飼醋大鼠血清對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

王 勉，張 旭

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命與健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率一直呈不斷上升趨勢(shì)。肺癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，近年來(lái)認(rèn)為細(xì)胞增殖和凋亡失衡可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。流行病學(xué)資料表明，食醋可能具有防癌抗癌作用。本研究旨在探討飼醋大鼠血清對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，為食醋防癌抗癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 人肺腺癌A549細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院；A549細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640，含1%三抗（青霉素、鏈霉素、兩性霉素），待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT，華美生物技術(shù)有限公司，用PBS配制成5mg/ml，-20℃保存?zhèn)溆?；碘化丙啶（PI），Sigma公司；Annexin Ⅴ-EGFP試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 制備飼醋大鼠血清

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理：6周齡SD大鼠50只，雌雄各半，體重150-200g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：812097。大鼠隨機(jī)分為飼醋組和對(duì)照組，每組25只，分別喂以含醋飼料、含醋飲水和普通飼料、普通飲水4個(gè)月。

1.2.2 飼料：普通飼料購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；醋中王，山西水塔老陳醋集團(tuán)生產(chǎn)，食醋產(chǎn)品總酸度≥6g/100ml；含醋飼料組成（30ml醋：100g普通飼料）；含醋飲水組成（5ml醋：100ml清潔飲水）。

1.2.3 制備血清：大鼠飼養(yǎng)4個(gè)月，隔夜禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，37℃溫浴1h后，3000r/min離心10min，分離血清，56℃水浴30min滅活血清，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MTT法檢測(cè)飼醋大鼠血清對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，以1×104/孔密度接種于96孔板，培養(yǎng)12h后，分別施加以下處理：對(duì)照組（N組），含20%普通飼養(yǎng)大鼠血清的1640培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組（V組），含20%飼醋大鼠血清的1640培養(yǎng)基；順鉑組（D組），含3mg/L順鉑的10%胎牛血清1640培養(yǎng)基；空白對(duì)照組（NN組），含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，處理后分別培養(yǎng)24、48、72、96h后，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸凈原培養(yǎng)液，加入二甲亞砜（DMSO）150μl/孔，振蕩10min，用酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)：490nm）測(cè)定每孔的OD值，計(jì)算抑制率。抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%，均以NN組為對(duì)照組。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)飼醋大鼠血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，取2×105個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)12h后按1.3的方法分組。培養(yǎng)48h后分別收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：①調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，取細(xì)胞懸液10μl，分別用AnnexinⅤ-EGFP及PI雙染，室溫避光15min，檢測(cè)A549細(xì)胞早期凋亡。②取2-3×106個(gè)細(xì)胞，用70%乙醇固定24h，PBS洗凈乙醇，加入40μl磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液，離心，棄上清，PI染色，室溫避光30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞晚期凋亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 飼醋大鼠血清對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用 見(jiàn)附圖。MTT法結(jié)果顯示,飼醋大鼠血清能明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈時(shí)間依耐性，隨用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率明顯上升（P＜0.05）。相同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組、順鉑組比較差異顯著：實(shí)驗(yàn)組的抑制率明顯高于對(duì)照組，低于順鉑組（P＜0.05）。

附圖 人肺腺癌A549細(xì)胞抑制率曲線

2.2 飼醋大鼠血清對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 飼醋大鼠血清處理48h后，實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組和空白對(duì)照組顯著提高,但明顯低于順鉑組（P＜0.01）。表明飼醋大鼠血清有促進(jìn)或誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用（見(jiàn)附表）。

附表 人肺腺癌A549細(xì)胞調(diào)亡率（%）

3 討論

食醋是生活中常用的調(diào)味品，在我國(guó)古代就有“治百病”之說(shuō)，被譽(yù)為“百藥之長(zhǎng)”。中醫(yī)認(rèn)為食醋可“消腫痛、散水氣、殺邪毒、理諸藥、解諸毒”。據(jù)明代李時(shí)珍本草綱目記載，食醋能破血運(yùn)，消食，殺惡毒，破結(jié)氣。近年的流行病學(xué)研究結(jié)果表明，釀醋廠工人、廠區(qū)及周?chē)鷶?shù)十年少有癌癥患者發(fā)生[1,2]。國(guó)內(nèi)外的一些研究也表明，食醋具有抗腫瘤活性，具有防癌抗癌作用[2-4]。

自日本學(xué)者田真代一于1988年提出血清藥理學(xué)的概念和實(shí)驗(yàn)方法以來(lái)，近年來(lái)，中外學(xué)者在血清藥理學(xué)方面做了大量的研究工作[5]。目前，血清藥理學(xué)的方法已被廣大學(xué)者接受，成為體外實(shí)驗(yàn)的重要方法。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，用飼醋大鼠血清（滅活）代替?zhèn)鹘y(tǒng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中的小?；蛱ヅＱ迮囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞，觀察其對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的影響。

本研究結(jié)果表明，飼醋大鼠血清能明顯抑制A549細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性；能顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡又稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身程序，通過(guò)自我調(diào)控，主要是通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活結(jié)束自己生命的過(guò)程[6]。細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生及抑制密切相關(guān)。一些腫瘤化療藥物、熱療及放療都是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用的，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為腫瘤治療的新思路[7]。長(zhǎng)期飼醋大鼠血清能通過(guò)抑制A549細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡而明顯抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究結(jié)果一方面可能為食醋防癌抗癌提供科學(xué)依據(jù)；另外，也為探討食醋防癌抗癌的可能機(jī)制提供途徑，即通過(guò)促進(jìn)或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤生長(zhǎng)，但誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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