生乳中L-羥脯氨酸測定方法的研究

■ 趙娟 夏淑鴻 張向榮 劉維華 寧夏獸藥飼料監(jiān)察所

1 前言

2009年，衛(wèi)生部公布了《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》，其中包含生乳中非法添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白是皮革“鞣革”工藝中產(chǎn)生的下腳料，將其摻入到生乳中可以增加蛋白質含量，但會改變生乳的口感及氨基酸的組成，降低生乳中氨基酸的吸收利用率。尤其“鞣革”下角廢料中含有的重金屬鉻，如果被人體吸收蓄積，可導致關節(jié)疏松、關節(jié)腫大，造成人體重金屬中毒。

由于L－羥脯氨酸是動物皮骨的膠原蛋白構成的特征氨基酸，通過水解可以將乳蛋白和其他動物皮骨的膠原蛋白區(qū)別開來，因此鑒定L－羥脯氨酸就是鑒定皮革水解蛋白，即檢測到了L－羥脯氨酸就證明使用了動物膠原蛋白類產(chǎn)品。

L－羥脯氨酸，又名反式-4-羥基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline），分子式C5H9NO3，分子量為131.13。截至2010年5月，“生鮮乳中皮革水解蛋白檢測方法”的國家標準或者行業(yè)標準均未發(fā)布實施。目前，實驗室通常參考“乳與乳制品中動物水解蛋白鑒定方法—比色法”、“生鮮乳中羥脯氨酸的測定—氨基酸分析儀法”、“皮革水解物檢測方法—硝酸汞沉淀顯色法”進行檢測。氨基酸分析儀價格較為昂貴，實驗室配備率不高，而紫外分光光度計是實驗室常用儀器。本文中，筆者用UV法測定了生乳中L-羥脯氨酸的殘留，并進行了方法學考察。

2 試驗方法

2.1 主要儀器設備

Shimadzu UV2410pc 紫外分光光度儀；高速冷凍離心機(HITACHI)；N-EVAPTM氮吹儀；移液器（Finnpipette）；CFYQYB YLE-1000水浴鍋；GZX-DH-30X35-BS電熱恒溫干燥箱；具塞玻璃比色管。

2.2 主要試劑

OMEGA-ORACLE L-羥脯氨酸：含量99.5%～101.5%，BIOSZUNE QC DEP提供，批號817k09266；氯胺T（批號20060831）、對二氨基苯甲醛（批號20010103）、鹽酸（優(yōu)級純，批號20091021）、苯酚（重精餾，批號20100122）均為天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)；檸檬酸、氫氧化鈉、結晶乙酸鈉、正丙醇均為分析純；實驗用水為去離子水。

2.3 溶液制備

2.3.1 標準溶液的制備

精密稱取L-羥脯氨酸對照品50mg置于100mL棕色量瓶中，加水充分溶解并稀釋至刻度，搖勻即得L-羥脯氨酸儲備液（濃度500μg/mL）；精密量取儲備液5mL，置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得L-羥脯氨酸中間液（濃度50μg/mL）。

分別精密量取L-羥脯氨酸中間液0、1.00、2.00、3.00、4.00mL，置100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的L-羥脯氨酸標準工作液。

2.3.2 試劑配制

氯胺T反應液（臨用現(xiàn)配）：由7%的氯胺T水溶液、正丙醇和緩沖液混合而成（20：26：54）；緩沖液：稱取5.00g檸檬酸、2.63g氫氧化鈉和14.61g結晶乙酸鈉溶于水，稀釋100mL。顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱取10g對二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙醇。

2.4 陽性添加試料的制備

精密量取L-羥脯氨酸儲備液（濃度500μg/mL）400μL、1000μL，置于5mL空白生乳樣品中，使之成為40μg/mL、100μg/mL的陽性添加試料。

2.5 試料水解

準確量取生乳5mL，置具塞比色管中，加優(yōu)級純濃鹽酸5mL，加入50g/L的重精餾苯酚水溶液3滴，混勻，靠近液面充入高純氮氣5min；在充氮氣狀態(tài)下封口。將已封口的水解管放在110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解6h后取出。打開水解管，趁熱過濾于100mL容量瓶中，用水反復沖洗試管和濾紙，定容到刻度，混勻。吸取10mL于25mL燒杯中，加10mol/L氫氧化鈉溶液8滴，再用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0±0.2，轉移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻備用，同時做試劑空白和陽性添加。

圖1 L-羥脯氨酸標準工作曲線

圖2 L-羥脯氨酸最大吸收峰

2.6 試料的顯色

分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的L-羥脯氨酸標準工作液和待測水解液各5mL。置25mL具塞比色管中，加氯胺T反應液2.00mL，搖勻室溫靜置20min。再加顯色劑2.00mL，搖勻，于60℃恒溫水浴20min，-15℃迅速冷卻15min，在波長（560±2）nm處測定吸光值，做標準曲線。

2.7 計算

回收率計算公式：R=（Xs－B1）·K/X0·100%。式中，Xs：標準曲線查得添加試料吸光度對應濃度（μg/mL）；X0：陽性添加試料實際濃度（μg/mL）；K：稀釋倍數(shù)（100）；B1：標準曲線查得空白樣品吸光度對應值（μg/mL）。

3 試驗結果

3.1 標準曲線

在波長（560±2nm）處測定吸光值，做標準工作曲線。得線性回歸方程為：

Conc=4.616X-0.300 R=0.9998

由圖1可見，0標準是有一定吸收值的，吸光度與濃度呈良好的線性關系，線性范圍為0～2.0μg/mL。

3.2 加標回收率

在空白試料中做40μg/mL、100μg/mL 2個水平陽性添加，每水平做4份平行樣品，每份結果取2次平均值，考察4批。生乳中L-羥脯氨酸的回收率、批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)如表1、2所示。

表1 生乳中L-羥脯氨酸40μg/mL添加結果匯總

表2 生乳中L-羥脯氨酸100μg/mL添加結果匯總

3.3 穩(wěn)定性

3.3.1 測定時間的影響

對不同濃度的溶液室溫放置48h，測定其濃度，考察重復性或穩(wěn)定性。1h內(nèi)測定吸光度值變化不顯著。結果如表3所示。

表3 顯色后放置時間對L-羥脯氨酸待測溶液吸光度的影響

3.3.2 反應液的影響

臨用現(xiàn)配和放置許久的氯胺T反應液對測定結果影響較大，結果如表4所示。

表4 氯胺T反應液對L-羥脯氨酸待測溶液吸光度的影響

3.3.3 水解時間的影響

同一空白樣品分別制備40和100μg/mL的L-羥脯氨酸陽性添加各9批，分別在110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解6、12和24h后取出。按2.5、2.6的方法水解顯色，測定吸光度值，并比較回收率。結果如表5所示。

表5 同一批樣品陽性添加不同水解時間測定L-羥脯氨酸回收率結果

4 分析與討論

4.1 試樣經(jīng)酸水解，釋放出羥脯氨酸，經(jīng)氯胺T氧化，生成含有吡咯環(huán)的氧化物，顯色劑中含有的高氯酸破壞了過量的氯胺T，終止氧化。羥脯氨酸氧化物與對二甲氨基苯甲醛反應生成紅色化合物，在波長560nm處進行比色，與標準曲線比較可以定量測定L－羥脯氨酸。L－羥脯氨酸是動物皮骨的膠原蛋白構成的特征氨基酸，其含量占10%以上，而乳蛋白中不含有此成分。通過水解可以將乳蛋白和其他動物皮骨的膠原蛋白進行區(qū)分，因此鑒定L－羥脯氨酸就是鑒定皮革水解蛋白，即檢測到了L－羥脯氨酸就證明使用了動物膠原蛋白類產(chǎn)品。

4.2 由標準曲線得，UV法測定生乳中L-羥脯氨酸含量方法成立，在波長（560±2）nm處有最大吸收（圖2），吸光度與濃度呈良好的線性關系，線性范圍0～2.0μg/mL；線性回歸方程為：Conc=4.616X-0.300，R=0.9998。

4.3 回收率試驗結果表明，40μg/mL陽性添加，L－羥脯氨酸平均回收率為100.0%（n=16），回收率范圍為87.3%～106.4%，4次考察批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.1%、3.6%、2.1%和3.7%，批間變異系數(shù)為5.6%；100μg/mL陽性添加，L－羥脯氨酸平均回收率100.4%（n=16），回收率范圍為92.7%～107.9%，4次考察批內(nèi)變系數(shù)分別為5.9%、3.6%、4.5%和4.8%，批間變異系數(shù)為1.3%。

4.4 穩(wěn)定性試驗表明，用UV法測定生乳中L-羥脯氨酸含量，顯色后吸收值測定應在1h內(nèi)完成，隨著放置時間的延長，測定值逐漸減小且不穩(wěn)定；氯胺T反應液配制后的放置時間對試驗結果影響較大，要做到臨用現(xiàn)配；生乳酸化水解6、12和24h對L-羥脯氨酸回收率測定結果無顯著影響，證明酸化6h可以滿足完全水解的目的。另外，不同品牌的標準品和分光光度儀機型可能引起L－羥脯氨酸最大吸收峰的漂移，建議做一定波長范圍內(nèi)的掃描測定，確定吸收峰。因本檢測方法所用試劑和步驟較多，生乳空白樣品中含有一定量的L-羥脯氨酸，可能由檢測過程中使用的各種試劑引入。因此，使用該方法測定回收率時，同時應做樣品空白；測定樣品時，同時做試劑空白，計算結果時要扣除。

本方法測定生乳中的L-羥脯氨酸含量，檢測條件穩(wěn)定，加標回收率高，變異系數(shù)較小，對儀器要求低，應用簡單方便。該方法的研究對生乳中皮革水解蛋白鑒定標準的制定修訂提供了可靠的實驗室數(shù)據(jù)及科學依據(jù)，對質檢機構開展生乳質量安全檢測工作具有現(xiàn)實指導意義。