胚胎晚期富集蛋白與生物的干旱脅迫耐受性

劉昀，劉國寶，李冉輝，鄒永東，鄭易之

深圳大學生命科學學院 深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳 518060

胚胎晚期富集蛋白與生物的干旱脅迫耐受性

劉昀，劉國寶，李冉輝，鄒永東，鄭易之

深圳大學生命科學學院 深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳 518060

胚胎晚期富集蛋白(Late embryogenesis abundant，LEA)是參與生物體抵抗干旱脅迫的一類重要蛋白。LEA蛋白可分為7組。大多數LEA蛋白具有親水性及熱穩(wěn)定性。LEA蛋白在水溶液中通常為無折疊狀態(tài)，但脫水脅迫可誘導其轉變?yōu)棣?螺旋。近年來關于LEA蛋白的研究取得了較多進展。研究結果表明LEA蛋白可定位于細胞內的多種細胞器中，且LEA蛋白可能具有多重保護作用，如保護蛋白質及酶活性、或保護細胞的膜結構、或具有抗氧化作用、結合離子或保護DNA等。以下主要介紹了LEA蛋白的功能、二級結構及保護作用機制。

胚胎晚期富集蛋白，干旱脅迫，亞細胞定位，蛋白質二級結構，多重保護功能

Abstract:Late embryogenesis abundant(LEA)proteins are well associated with the desiccation tolerance in organisms.LEA proteins are categorized into at least seven groups by virtue of similarities in their deduced amino acid sequences.Most of the LEA proteins have the characteristics of high hydrophilicity and thermo-stability.The LEA proteins are in unstructured conformation in aqueous solution.However, they adopted amphiphilic α-helix structure during desiccation condition.LEA proteins are localized to the different organelles in the cells, i.e.cytoplasm, endoplasmic reticulum, mitochondria and nucleus.The multi-functional capacity of LEA proteins are suggested, as protein stabilization, protection of enzyme activity, membrane association and stabilization,antioxidant function, metal-ion binding or DNA protection, etc.Here, we review the structural and functional characteristics of LEA proteins to provide a reference platform to understand their protective mechanisms during the adaptive response to desiccation in organisms.

Keywords:late embryogenesis abundant protein, desiccation tolerance, subcellular localization, secondary structure, protective functions

水分缺失是影響生物體生命活動的重要環(huán)境因素。在長期進化過程中，生物體演化出多種分子機制抵御水分的缺失，如基因的表達、代謝的調節(jié)、酶活性的改變等。胚胎晚期富集蛋白(Lateembryogenesis abundant，LEA)是參與細胞抗逆保護的一類重要蛋白質。上世紀 80年代，Dure等首次報告了在棉花發(fā)育種子中存在 LEA基因[1]。隨后，在許多其他植物的種子、花粉粒和營養(yǎng)組織中發(fā)現了多個LEA蛋白[2]。這些LEA蛋白的高水平表達與植物耐旱、耐鹽或耐低溫能力的提高密切相關。利用分子育種技術，證明了導入外源LEA基因(如大麥 HVA1，小麥 PMA80)可改善轉基因水稻的抗旱、耐鹽特性[3-4]，這些結果顯示出LEA基因在提高農作物抗逆性方面有著廣闊的應用前景。

近年來，科學家們在非植物界生物體(如線蟲、蛭形輪蟲、藻類、地衣、古細菌、微生物及節(jié)肢動物鹵蟲)中也發(fā)現了LEA蛋白[2,5]，并發(fā)現了LEA蛋白的新功能。在LEA蛋白抗脫水分子機制方面也取得了新的研究進展。以下將對近年來LEA蛋白與生物體干旱脅迫耐受性的關系研究進行綜述。

1 LEA蛋白家族的理化性質及分類

LEA蛋白大多數為低分子量蛋白，分子量約在10～30 kDa之間，少部分在30 kDa以上。LEA 蛋白多由堿性和親水性氨基酸組成，富含甘氨酸以及小分子量氨基酸，如丙氨酸和絲氨酸。該蛋白缺少半胱氨酸和色氨酸，疏水氨基酸含量也很少。該蛋白質具有高度親水性，且在沸水處理后仍可保持穩(wěn)定[2]。

LEA蛋白是一個大的蛋白家族。擬南芥中就有50種以上的LEA蛋白[6]。根據LEA蛋白保守序列的特點，Battaglia將LEA蛋白分為7組[2]。其中LEA1蛋白高度親水，其序列內含20個氨基酸的保守基序(TRKEQG[T/E]EGY[Q/K]EMGRKGG[L/E])。該序列在植物LEA1蛋白中通?？纱?～4次，也可重復8次左右。此外，在植物LEA1蛋白的N-端和C-端還分別存在著另 2個保守序列(TVVPGGTGGKSLEAQE[H/N]LAE)和D[K/E]SGGERA[A/E][E/R]EGI[E/D]IDESK[F/Y])[2]。

LEA2蛋白又稱脫水素(Dehydrin)。該組 LEA蛋白通常具有由 15個氨基酸組成的 K片段(EKKGIMDKIKEKLPG)。K片段可串聯排列，其重復次數為1～11。LEA2蛋白還具有串聯絲氨酸區(qū)(S-片段)、Y-片段([V/T]D[E/Q]YGNP)n(n＝1～35)和富含甘氨酸和極性氨基酸(如蘇氨酸)的 Φ-片段。Φ-片段在K-片段之間重復出現。根據K、Y和S片段的存在和分布情況，可將LEA2蛋白分為K-、SK-、YSK-、YK-和 KS-亞組[2]。

LEA3蛋白具有高保守的 11-氨基酸基序(TAQAAKEKAGE)。該序列的拷貝數為5～30。該基序第1、2、5和9位氨基酸為疏水殘基(F)；第3、7和11位為帶負電荷或為極性氨基酸(E、D、Q)；第6和8位為帶正電荷氨基酸；第4和10位是隨機氨基酸(X)[7]。在LEA3蛋白的11氨基酸重復序列之間還常存在著不完整的11-氨基酸基序。此外，部分 LEA3蛋白序列中還存在 22-氨基酸基序(VNKMGEYKDYAAEKAKEGKDAT)[8]。

LEA4蛋白的N端多為由70～80個氨基酸組成的保守區(qū)域。其中，基序 1(AQEKAEKMTA[R/H]DPXKEMAHERK [E/K][A/E][K/R])在 N端序列中較保守[2]。

LEA5蛋白與其他LEA蛋白相比有較大差異。它通常含有高比例疏水氨基酸殘基，且不具有對熱的穩(wěn)定特性。LEA5蛋白為球蛋白[2,9]。

LEA6蛋白序列內有4個保守基序。其中的基序1(LEDYK MQGYGTQGHQQPKPGRG)和基序 2(GSTDAPT LSGGAV)高度保守，且基序下劃線部分的氨基酸序列在已發(fā)現的36個LEA6蛋白中的保守性可達100%[2]。

LEA7蛋白含6個保守氨基酸序列。位于蛋白質C-末端的保守序列可能含有核定位信號。位于N-末端的串聯組氨酸可能具有依賴 Zn2＋離子的 DNA結合活性[2,10]。

2 LEA蛋白家族的亞細胞定位

LEA蛋白多分布于細胞質內。在棉花胚細胞中，LEA蛋白可占細胞質可溶性蛋白的4%左右。此外，LEA蛋白還可分布在細胞的內質網、線粒體、葉綠體和細胞核中，表明LEA蛋白對細胞可能具有多重保護作用。

一些LEA3蛋白(如大豆GmPM8)的N端含有典型的信號肽序列。這類蛋白質在合成后被轉運至內質網中，同時信號肽被切除。利用免疫電鏡技術可觀測到桑樹Morus bombycis Koidz的WAP27蛋白(LEA3)位于內質網上。在冷凍脅迫下，WAP27蛋白可能通過減少內質網膜的流動性，賦予桑樹薄壁組織細胞較強的抗凍能力[11]。

豌豆Pisum sativum的LEAM蛋白(LEA3)則存在于種子細胞的線粒體基質中。當LEAM前體蛋白進入線粒體基質后，其N端的轉運肽被切掉。在脫水條件下，LEAM 蛋白可保護線粒體基質中的延胡索酸酶和硫氰酸酶活性，使線粒體免受脫水脅迫的傷害。LEAM 蛋白還有可能保護經干燥脅迫的線粒體內膜[12-13]。最近的研究結果表明，鹵蟲Afrlea3m蛋白定位于線粒體基質中。隨著Afrlea3m蛋白表達水平的提高，鹵蟲的耐脫水能力也得到提高[5]。

擬南芥Arabidopsis thaliana的Cor15蛋白N端具有轉運肽序列。利用免疫法可檢測到 Cor15蛋白位于擬南芥細胞的葉綠體內[14]。小麥 Triticum aestivum的Wcs19蛋白也定位于葉綠體[15]。

在細胞核中也發(fā)現有 LEA蛋白。如玉米 Zea mays胚中的Rab17蛋白是一個高度磷酸化的蛋白。Rab17蛋白不僅分布在細胞質中，也分布在細胞核內。而且在細胞質和細胞核中的Rab17蛋白有著不同程度的磷酸化[16]。

3 LEA蛋白的表達與生物的脅迫耐受性

3.1 LEA蛋白家族的基因表達模式

LEA蛋白不僅在種子發(fā)育后期大量表達，也受多種脅迫的誘導表達。大量證據表明，當干旱、高鹽及低溫脅迫發(fā)生、或外源脫落酸水平升高時，植物營養(yǎng)組織中也可積累LEA蛋白[2,6]。然而，也有一些例外情況。如用 ABA處理擬南芥后，一些 LEA基因(如AtLEA5-2、AtLEA9-1)的表達量保持不變，或呈下調趨勢[6]。利用比較熱穩(wěn)定蛋白組技術，發(fā)現鷹嘴豆Cicer arietinum L.種子中不僅有誘導表達的LEA蛋白，也有組成型表達的LEA蛋白[17]。

近年來在非植物界的生物中也發(fā)現有 LEA蛋白，如原核生物 Deinococcus radiodurans、藻類Chlamydomonas W80、釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae、線蟲 Aphelenchus avenae、搖蚊 Polypedilum vanderplanki和鹵蟲Artemia franciscana[2,5,18]等。利用RNAi方法抑制秀麗線蟲Ce-lea-1基因的表達，秀麗線蟲的耐脫水脅迫能力明顯下降[19]。此外，在極端耐輻射細菌Deinococcus radiodurans中也存在LEA基因，暗示著LEA蛋白的存在可能與該細菌的耐輻射能力有關[20]。

通過對不同來源的LEA蛋白進行系統(tǒng)樹分析，Tunnacliffe等推測LEA蛋白起源于古細菌蛋白[18]。LEA蛋白起源早、進化上高保守的特點暗示其在生物體中可能具有重要的生理功能。

3.2 LEA蛋白的干燥依賴性加工

大量研究結果表明，LEA蛋白的表達與細胞對干燥脫水及鹽脅迫耐受性的獲得直接相關。然而，目前還不清楚LEA蛋白如何參與細胞的保護作用。Goyal等報告線蟲 Aphelenchus avenae可表達AavLEA1蛋白(16.5 kDa)。在脫水脅迫誘導下，AavLEA1蛋白將斷裂成分子量較小的多肽(9 kDa)。體外實驗表明，AavLEA1全長蛋白及其斷裂小肽對檸檬酸合成酶有保護作用[21]。與線蟲AavLEA1蛋白類似，搖蚊幼蟲的PvLEA2蛋白(20.6 kDa)在脫水脅迫下也可斷裂產生小肽(14.7 kDa)[22]。Goyal等將這種受干燥脅迫誘導的蛋白質斷裂現象稱為干燥依賴性的蛋白質加工(Dehydration-regulated processing)[18]。然而，這種蛋白質加工現象是否也發(fā)生在受脅迫的植物LEA蛋白序列，以及細胞內誘導LEA蛋白產生干燥依賴性加工的分子機理，均是科學家們關注的問題。

3.3 LEA蛋白與轉基因生物的抗逆性

利用遺傳學方法鑒定LEA基因的抗逆功能已積累了較多資料。如將大麥HVA1(LEA3)基因轉化小麥和水稻，轉基因植物在經過干旱脅迫后可迅速恢復生長，且轉基因水稻根細胞膜的透性降低[3]。小麥PMA80(LEA2)、PMA1959(LEA1)基因在水稻中的過表達可明顯提高轉基因植株在干旱條件下的葉綠素含量和根系的重量[4]。

近年來，有研究人員利用酵母、大腸桿菌等單細胞生物研究LEA蛋白的功能。如小麥TaLEA2和TaLEA3基因(LEA3)在酵母中的表達可提高酵母轉化子的耐滲、耐鹽和耐低溫能力[23]。Zhang等將西紅柿 LE4基因(LEA2)及大麥 HVA1基因(LEA3)分別轉入酵母。證明不同LEA蛋白在滲透脅迫中的保護作用存在差異[24]。本研究小組首次用大腸桿菌表達體系鑒定LEA 蛋白的耐鹽功能。如將大豆 PM2(LEA3)基因和 PM11(LEA1)、PM30(LEA3)基因分別轉化大腸桿菌。過量表達LEA蛋白的重組菌在高鹽下的存活率明顯高于對照菌[8,25]?？梢姡湍负痛竽c桿菌體系可作為研究某些LEA蛋白抗逆功能的簡單、快捷、有效的體系。

4 LEA蛋白的二級結構特征

蛋白質的結構與功能有密切的關系。近年來的研究結果顯示 LEA1～LEA3蛋白在水溶液中呈無折疊狀態(tài)(Unfolded state)[26]。然而，LEA蛋白序列中還可能存在某些結構元件。此外，在 LEA1～LEA3蛋白中都發(fā)現了伸展的左手 PPII螺旋(Polyproline II helix)結構[27-28]。這種PPII螺旋可能與水緊密結合，為細胞提供緩沖環(huán)境[26]。

LEA蛋白的結構變化具有可逆性。在 SDS和TFE誘導下，LEA蛋白可形成高比例α-螺旋。但去除溶液中的SDS和TFE后，LEA蛋白又可恢復無折疊狀態(tài)。脫水脅迫也可誘導一些 LEA蛋白的 α-螺旋、β折疊結構增加[13,17,28-29]。當豇豆DHN1蛋白(LEA2)與小單層脂質體(Small unilamelar vesicles)孵育時，α-螺旋明顯增加[30]，LEA蛋白的結構改變可能有助于行使其保護功能。然而，上述結果尚缺乏體內實驗的支持。

5 LEA蛋白的保護作用機制

LEA蛋白與生物體耐受脅迫的能力密切相關，但其保護機制仍不清楚。根據生物信息學預測，LEA蛋白的保護作用主要有保護蛋白質、與非還原性糖的互作、穩(wěn)定膜結構、結合離子或保護DNA分子等。

5.1 LEA蛋白對蛋白質的保護作用及其機制

5.1.1 穩(wěn)定蛋白質的分子屏蔽(Molecular shield)假說

凍融和干燥引起的脫水可導致乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、延胡索酸酶和異硫氰酸酶活性的下降甚至完全喪失。LEA蛋白可通過保護這些酶的活性，起到保護細胞及細胞器的作用[12,31-32]。高溫也可使檸檬酸合成酶活性下降并發(fā)生聚集。高溫下，細胞中的分子伴侶與被保護的蛋白質分子形成復合物，阻止其構象的錯誤變化，同時伴隨著消耗能量ATP。LEA蛋白與海藻糖協(xié)同作用也可阻止檸檬酸合成酶聚集。然而，LEA蛋白對酶活性的保護并不需要消耗 ATP[32]?？梢?，LEA蛋白對蛋白(酶)的保護機制與分子伴侶似乎并不相同。

Tunnacliffe提出LEA蛋白保護蛋白質的分子屏蔽(Molecular shield)假說：無折疊LEA蛋白可填充于變性蛋白質分子之間，阻止了二者的互作，減少了部分變性蛋白質分子的聚集[18,32]。

5.1.2 蛋白質間的相互作用

LEA蛋白也可能通過蛋白質間的相互作用保護蛋白質活性。干燥可誘導鷹嘴豆MtEm6(LEA1)和線蟲AaVLEA1(LEA3)蛋白形成大量α-螺旋，后者可與部分變性的蛋白質的疏水基團互作，起到穩(wěn)定蛋白質的作用[17,28]。此外，位于 LEA1～LEA3蛋白表面的左手伸展PPII結構可與其他蛋白質分子結合，保護蛋白質分子[33]。

5.2 LEA蛋白與非還原性糖互作的玻璃化模型

細胞質玻璃化模型是細胞耐脫水脅迫的一個重要模型。在脅迫條件下，生物體內非還原糖(如蔗糖和海藻糖)的合成和積累增加，形成玻璃化狀態(tài)。同時，細胞內大量表達的LEA蛋白可參與非還原糖的玻璃態(tài)形成過程[29]。在干燥脅迫下，LEA蛋白可形成α-螺旋結構，繼而形成微纖維。這不僅有助于增強細胞的機械穩(wěn)定性，提高細胞質玻璃體的強度，增強細胞質粘滯性，抑制了有害分子在細胞內的擴散[29]。

5.3 與細胞膜結構的結合及對膜的穩(wěn)定作用

逆境脅迫對細胞的傷害是破壞細胞膜系統(tǒng)和生物大分子結構。已有實驗證據表明一些LEA蛋白可定位在膜結構豐富的區(qū)域。在體外，LEA蛋白可與小的單層脂質體相互作用[13]。而轉基因實驗結果顯示，轉大麥 HVA1基因的水稻經干旱脅迫后，細胞膜透性降低，表明過量表達的HVA1蛋白可通過保護細胞膜提高植株抗旱性[3]。此外，脅迫發(fā)生時，線粒體基質中的LEA蛋白也可保護線粒體內膜[13]。然而，也存在著另一種可能性，即LEA蛋白在保護線粒體內膜的同時，也將影響線粒體內膜的氧化磷酸化過程。

5.4 結合金屬離子

細胞的脫水不僅導致細胞內滲透壓升高，還將引起離子濃度升高。LEA蛋白可螯合過多的離子，減輕離子毒害，這可能是LEA蛋白的一個重要功能[2,8]。

有研究表明，高鹽脅迫可誘導植物表達LEA蛋白[2,18]。而且，LEA2蛋白的絲氨酸被磷酸化后可結合溶液中的Ca2+，顯示出依賴磷酸化的Ca2+結合特性[34]。此外，LEA蛋白還可結合Cu2+、Zn2+、Mn2+和 Fe2+等離子[35]。而且，LEA2蛋白中的組氨酸殘基也可與金屬離子結合[36]。

5.5 保護DNA

最新的研究結果表明，柑橘 Citrus unshiu的COR15蛋白在Zn2+作用下可與DNA和tRNA發(fā)生非特異相互作用。LEA蛋白序列中富含組氨酸和賴氨酸的結構域可能在與DNA互作時起關鍵作用。以上研究表明CuCOR15蛋白可能對DNA/RNA有一定的保護作用[37]。此外，Wise等利用生物信息學預測LEA蛋白可以進入細胞核與 DNA結合，具有調控基因表達的功能[38]。

6 一種LEA蛋白的多功能特性(Multifunction)

蛭形輪蟲可耐受極端脫水的環(huán)境。最近的研究表明，蛭形輪蟲的 LEA基因具有兩個不同的轉錄本，可產生大小不同、功能各異的兩個LEA蛋白。其中一個基因轉錄本負責阻止一些重要蛋白質的聚集，另一個基因轉錄本可維持細胞膜的完整性[39]。暗示一種LEA蛋白可能具有多功能性。體外實驗結果證實柑橘COR15蛋白不僅可螯合金屬離子，還具有保護DNA/RNA等功能[36-37]。然而，“LEA蛋白的多功能性”假設仍需更多的實驗證據來支持。

本課題組利用大腸桿菌、酵母和煙草證明了異源的大豆 Em(LEA1)和 PM2(LEA3)蛋白的表達可提高宿主的耐鹽性。這一結果為前人提出的“LEA蛋白在原核細胞和真核生物中可能具有相似的耐鹽機理”這一假說提供了依據[8,25]。本課題組還證明Em和PM2蛋白的高保守序列(如20-氨基酸基序，11-氨基酸/22-氨基酸基序)為耐鹽功能結構域。最近，劉昀等證明一種LEA蛋白(大豆PM2)的表達可賦予大腸桿菌重組子對低溫、冷凍、高溫及幾種不同鹽脅迫的耐受力。首次通過體內實驗證明了一種LEA蛋白的多功能特性[40]。

7 展望

LEA蛋白對生物體、細胞及生物大分子的保護機理研究已積累了較多資料。然而，在同一生物體內LEA蛋白家族成員是否存在冗余、不同成員的功能是否有差異、它們之間是否具有可替代性仍不清楚。盡管有研究指出LEA蛋白在脅迫處理時可由無折疊狀態(tài)轉變?yōu)橛薪Y構狀態(tài)，然而對LEA蛋白高級結構的形成及其與保護功能關系的研究并不多見。LEA蛋白的多功能特性、以及LEA蛋白如何參與不同生物大分子的保護作用機理還需要實驗證據的支持。因此，對LEA蛋白的深入研究對于揭示和闡明生物體對脅迫應答的機理有重要意義。

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Functions of late embryogenesis abundant proteins in desiccation-tolerance of organisms: a review

Yun Liu, Guobao Liu, Ranhui Li, Yongdong Zou, and Yizhi Zheng
Key Laboratory of Microorganism and Genetic Engineering of Shenzhen City, College of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China