羅紅霉素的百里酚藍荷移分光光度法測定

李 俊 ,高成莊 ,王國慶 ,常方方 ,李全民

(1.焦作師范高等專科學校生化系,河南焦作 454000;2.鄭州輕工業(yè)學院應用化學系,河南鄭州 450002;3.河南師范大學化學與環(huán)境科學學院,河南新鄉(xiāng) 453007)

0 前言

羅紅霉素為半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,主要作用于革蘭氏陽性菌,厭氧菌,衣原體等。具有用量小,吸收快,作用時間長,穩(wěn)定性好等特點。藥典上記錄的檢測方法為抗生素微生物檢定法[1],比較繁瑣。已報道的分析方法主要有 HPLC[2-5]法、RHPLC[6-8]法、LC[9]法、SP[10]法、荷移反應[11-13]。本文首次利用百里酚藍與羅紅霉素在無水乙醇介質中的電荷轉移反應,研究了最佳反應條件,該方法簡便,快捷,條件易于控制,靈敏度高,線性范圍寬,在可見光區(qū)即可完成測定。用于測定藥物制劑中有效成分的含量,所得結果與文獻[2]方法一致,同時測定了配合物的組成和穩(wěn)定常數(shù),并初步探討了反應機理。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

UV-2800AH型紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);722S分光光度計(上海棱光技術有限公司);CS501型超級恒溫器(重慶試驗設備廠制造)。1.0×10-2mol/L百里酚藍(上海試劑三廠)乙醇溶液備用,稀釋至5.0×10-4mol/L;2.5×10-3mol/L羅紅霉素的乙醇溶液(對照品由中國藥品生物制品檢定所提供);所用有機試劑均為分析純(天津市德恩化學試劑有限公司)。

1.2 實驗方法

取適量羅紅霉素乙醇溶液于5m L比色管中,濃度為3.1×10-4mol/L,加百里酚藍溶液1.5 m L,用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻后室溫放置10min,以試劑空白為參比,用1 cm比色皿在 438 nm處測定吸光度。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的選擇

(1)吸收光譜。按實驗方法配制溶液后,于 UV-2800AH紫外可見分光光度計上進行光譜掃描,由實驗可知:羅紅霉素在320580 nm處無吸收,百里酚藍的最大吸收波長為 547 nm,荷移配合物的最大吸收波長為 438 nm,吸收光譜發(fā)生藍移,波長變化 109 nm。吸收光譜圖見圖1,故選定檢測波長為438 nm。

(2)反應溫度的影響。按實驗方法配制溶液,在不同溫度的水浴中保溫 10min,,取出冷至室溫后測定吸光度,結果見表1。表1表明吸光度隨反應溫度的升高反而降低,說明該反應選擇室溫測定較為合適,因此選擇室溫測定。

(3)反應時間的影響。按實驗方法配制溶液,放置不同的時間后進行測定,結果表明反應10 min后溶液吸光度A基本保持不變,且 10 h內(nèi)穩(wěn)定,本反應穩(wěn)定性較好。

(4)溶劑的影響。百里酚藍難溶于水,研究以甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇為有機溶劑時配合物的吸光度,分別為0.375,0.108,0.318,0.328。結果表明:乙醇效果最好。

圖1 吸收光譜

表1 溫度對荷移配合物形成的影響

(5)試劑用量的影響。其他條件不變,改變百里酚藍的用量,按實驗方法配置一系列溶液,室溫放置10 min后測定吸光度值A,百里酚藍的用量是0.5 mL,1.0m L,1.5mL,2.0mL,2.5m L時,吸光度值A分別為0.196,0.398,0.451,0.432, 0.420。結果表明百里酚藍用量1.5 mL為宜。

(6)其他試劑的影響。考察了水及表面活性劑的影響,結果表明:CTAB、SDS、吐溫-80、吐溫-20的加入均使吸光度有不同程度的降低,見表2。

表2 水和表面活性劑對荷移配合物形成的影響

2.2 線性范圍

按實驗確立的最佳工作條件繪制工作曲線(見圖2),將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理得回歸方程為:A=0.296 9+0.000 62 C,相關系數(shù)r=0.999 9,羅紅霉素在41.9419mg/L范圍內(nèi)呈線性關系,表觀摩爾吸光系數(shù)ε為1.70×103L/(molcm)。

2.3 測定方法的重現(xiàn)性實驗

按實驗方法配制溶液8份,室溫放置10 min后測定吸光度A分別為0.428,0.423,0.425,0.426,0.425, 0.427,0.422,0.424;s=0.002,RSD=0.47%。

2.4 配合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定

用連續(xù)變化法(見圖3)和斜率比法(見圖4)測定配合物的組成比為 1∶1,穩(wěn)定常數(shù)為 1.53×106。

圖2 工作曲線

2.5 反應動力學性質與反應機理探討

(1)反應級數(shù)和反應速率方程的確定。按實驗方法配制溶液,分別在 30℃和 40℃下反應,按初始速率法測定不同時間下吸光度,并由此計算不同溫度下未絡合的羅紅霉素濃度。分別以A-t、1/A-t、In1/A-t作圖,且都為一直線,由此可知:此荷移反應對羅紅霉素為一級反應;由于在此反應中百里酚藍遠遠過量,可視為常數(shù),故此荷移反應可看作為假一級反應。速率方程為:

(2)表觀速率常數(shù)和活化能的計算。將上述實驗得到的 A-t數(shù)據(jù)用最小二乘法處理得 30℃和40℃的表觀速率常數(shù)。又據(jù)阿累尼烏斯公式:ln k′=–Ea/RT+C,將各對k′-T數(shù)據(jù)代入公式:Ea=RT1T2/T2-T1lnk2′/k1′中計算出荷移反應的活化能,見表3。

(3)反應機理探討。百里酚藍是一個很強的平面型的 π電子受體,而羅紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,富含電子,可以提供電子而與百里酚藍形成 1∶1的配合物。

表3 表觀速率常數(shù)和活化能

2.6 回收率實驗

精密稱取處方量輔料9份,分別按羅紅霉素(150mg/L)標示量的80%、100%、120%加入標準品各3份,測定回收率,結果分別為100.2%、101.4%、100.8%,RSD分別為0.43%、0.49%、0.47%。

2.7 試樣的測定

(1)試樣的準備。取羅紅霉素膠囊10粒(150mg/粒),精確稱量,混勻,準確稱取適量藥粉,用乙醇溶解,轉移到 100m L容量瓶中,用乙醇定容,搖勻,取續(xù)濾液使用。

表4 試樣的測定結果

(2)試樣的測定。取適量試樣溶液于 5 mL比色管中,加入1.5m L百里酚藍,按實驗方法平行制3份溶液。測定吸光度A,按回歸方程計算含量,與文獻[2]對比,測定制劑中羅紅霉素的含量。本法測定結果與文獻[2]方法基本一致(150mg/粒),結果見表4。

[1] 中華人民共和國藥典委員會,中華人民共和國國家藥典:二部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2000:388.

[2] 戴 紅,胡昌勤.HPLC法分析羅紅霉素及其片劑含量和相關物質[J].藥物分析雜志,2002,22,(3):185-188.

[3] 王 芳,賴日禹.高效液相色譜法測定羅紅霉素顆粒含量[J].藥物分析雜志,2001,21(6):442-443.

[4] 田 潔,胡昌勤,張正行.羅紅霉素及其有關物質快速HPLC分析方法的探討[J].藥物分析雜志,2003,23(6):434-437.

[5] 丁晨光,范 青,鐘紅玲,等.羅紅霉素的HPLC測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1998,29(3):122-124.

[6] 趙亞男,李相鴻,楊菁菁,等.RP-HPLC法測定人體血漿中羅紅霉素的濃度[J].藥物分析雜志,2006,26(5):618.

[7] 李偉華,閆惠平,黃 春,等.反相高效液相色譜法測定羅紅霉素血藥濃度[J].藥物分析雜志,2006,26(8):1103-1105.

[8] 秦永平,黃 英,梁茂植,等.血清中羅紅霉素的反相高效液相色譜法測定[J].藥物分析雜志,1997,17(4):249.

[9] Maria Hedenmo,Britt-Marie Eriksson.Liquid Chromatographic Determ ination of the Macrolide Antibiotics Roxithromycin and Clarithromycin in Plasma Byautomated Solid-phase Extraction and Electrochemical Detection[J].JChromatogr A, 1995,692(1/2):161-166.

[10] 張敏波,張琪霞,金耀楚.羅紅霉素片溶出度的分光光度測定[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1996,27(6):260-261.

[11] 趙桂芝,李華侃.荷移分光光度法測定羅紅霉素[J].光譜學與光譜分析,2003,23(1):157-159.

[12] 白秀珍,李華侃,劉中英,等.荷移分光光度法測定羅紅霉素[J].藥物分析雜志,2005,25(4):429-431.

[13] 李 俊,李全民,王新明.羅紅霉素的荷移分光光度法測定[J].化學研究與應用,2006,18(9):1081-1083.