黃連木葉片基因組DNA提取方法

程世平,施 江,史國安,李亞杰,宋程威,尹小芳

(河南科技大學洛陽市牡丹生物學重點實驗室,河南洛陽 471003)

0 前言

黃連木(Pistacia chinensis Bunge)屬漆樹科黃連木屬,落葉喬木,雌雄異株,分布廣泛,可作觀賞樹種,更是優(yōu)良的油料及用材林樹種。黃連木種子所含的油可作工業(yè)原料或用作食用油,是生產(chǎn)生物柴油的理想木本油料[1-2],黃連木還可藥用[3]。目前對黃連木的研究主要集中在組織培養(yǎng)[4]、種子發(fā)芽試驗和病蟲害防治[5]等方面,有關黃連木分子生物學相關的研究還未見報道。

高質(zhì)量的DNA是分子生物學關鍵的一步,是進行分子標記、基因組文庫構建、親緣關系分析等分子生物學研究的基礎。植物DNA提取的方法多種多樣,CTAB法經(jīng)改良后被廣泛應用,針對不同植物材料的特點,對CTAB法所做的改良各不相同,本文針對黃連木這種富含酚類、色素等極易影響DNA提取的物質(zhì),進行了相對應的改良,得出了一種簡單、有效的提取黃連木 DNA的方法,為黃連木分子生物學方面的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為黃連木嫩葉,葉片采下后立即裝入自封袋,放入裝有冰袋的采樣盒中帶回實驗室,用蒸餾水沖洗干凈、用濾紙吸干表面水分,置于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

(1)常規(guī)CTAB提取方法按文獻[6]的方法。

(2)改良CTAB法的操作步驟。參照文獻[7-10]的方法并作適當改良,進行黃連木葉片DNA提取。①將CTAB提取液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.4 mmol/L NaCl,50 mmol/L EDTA),加入3% CTAB后,放入65℃水浴鍋進行水浴。②待CTAB完全溶解后,每個10m L離心管中分裝3 mL CTAB提取緩沖液,繼續(xù)放入 65℃水浴。③取 3 g左右葉片,于液氮冷凍條件下迅速研磨成粉末,立即轉(zhuǎn)入裝有提取緩沖液的離心管中。④每個離心管中加入 120μLβ-巰基乙醇,20%的PVP溶液 520μL,5μL RNA酶(5mg/mL),迅速混勻。⑤65℃水浴1 h,期間每隔5min振蕩1次。⑥放至室溫后,加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1),抽提 2次。⑦上清液轉(zhuǎn)入另一干凈離心管中,加入 2倍體積預冷的無水乙醇,上下輕輕顛倒。⑧待出現(xiàn)大量沉淀時,挑出絮狀DNA沉淀,將沉淀轉(zhuǎn)入1.5mL離心管。⑨用體積分數(shù)70%乙醇洗滌1次?！?0將離心管口打開,在無菌操作臺內(nèi)吹58 min?！?1加入1m L 1×TE溶液,待DNA完全溶解后分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)DNA純度及濃度檢測。將 DNA樣品按照一定倍數(shù)稀釋后,用紫外分光光度計測定OD260和OD280值,按照1個OD260值相當于50 ng/μL和稀釋倍數(shù)來計算DNA的濃度,用 OD260和OD280的比值表示DNA的濃度,最后將DNA樣品稀釋,進行瓊脂糖凝膠電泳,用核酸染料(GeneFinder)染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照,檢測DNA的純度及完整性。

(4)RAPD檢測。以所提DNA為模板,用RAPD隨機引物進行PCR擴增,反應在Biometra PCR儀上進行。反應程序參考Surya Prakash等[11]的方法并作適當改動,引物購自上海Sangon。擴增產(chǎn)物用核酸染料染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察和拍照。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)CTAB法提取黃連木葉片基因組DNA

采用常規(guī)CTAB提取方法,上清液在提取DNA的同時,富含大量的蛋白質(zhì)、RNA、單寧、色素等物質(zhì),經(jīng)沉淀出現(xiàn)的絮狀DNA呈深綠色或黑褐色,溶解后的DNA較粘稠。瓊脂糖凝膠電泳檢測,DNA點樣量5μL才出現(xiàn)微弱條帶,且電泳孔道出現(xiàn)大量的蛋白質(zhì)和RNA等(如圖1所示)。經(jīng)紫外分光光度計檢測表明,其紫外吸收比值在 1.53左右。

2.2 改良CTAB法提取黃連木葉片基因組DNA

改良后的CTAB法盡量縮短了研磨樣品與空氣接觸的時間;提取過程中充分振蕩增加了提取液和研磨樣品快速、充分的接觸,有效去除了蛋白、色素等雜質(zhì)。加入無水乙醇待 DNA析出時,立刻將沉淀挑出,防止多酚、單寧、多糖等物質(zhì)與 DNA沉淀在一起,另外不采用離心方法沉淀DNA,有效避免了雜質(zhì)和DNA混合在一起。

電泳點樣量僅1μL,從電泳圖(如圖2所示)可知,改良法提取的DNA無蛋白、RNA等污染,條帶清晰,亮度均一,純度、完整性較高。經(jīng)紫外分光光度計檢測,其吸收比值 1.8左右。

2.3 RAPD擴增檢測黃連木葉片基因組DNA的提取效果

運用常規(guī)CTAB方法提取的黃連木基因組DNA,經(jīng)RAPD隨機引物擴增后,瓊脂糖凝膠電泳檢測,條帶模糊且片狀拖帶或涂抹帶現(xiàn)象明顯,擴增主帶不明顯。

采用改良法提取的DNA,進行RAPD基因擴增,擴增所用DNA隨機選擇,1和2,3和4,5和6,7和8,9和 10,11和12所用引物相同,RAPD擴增結果表明(如圖3所示),同一引物之間擴增產(chǎn)物清晰、豐富。同一條引物之間擴增的條帶有少許差異,是因為雌雄模板之間的差異所致。結果表明:改良法提取的DNA能較好的用于PCR擴增研究。

3 討論與結論

高質(zhì)量的DNA樣品是進行相關分子生物學研究的基礎,根據(jù)不同植物材料的特點,提取基因組DNA的方法也不盡相同。CTAB提取法在植物DNA提取過程中應用最廣泛,提取效果較理想。黃連木葉片富含單寧、多酚、色素等物質(zhì),給DNA提取帶來很大困難。本試驗在常規(guī) CTAB提取方法的基礎上,針對黃連木葉片的特點,進一步對提取方法進行完善,設法減少酚類物質(zhì)、色素、多糖等物質(zhì)的干擾。

圖3 改良CTAB法提取黃連木DNA的RAPD擴增效果圖

為了盡量減少材料的褐化,并顯著提高提取效果,首先將提取液分裝并水浴保持在65℃,研磨后將研磨樣品立即加入提取液;另外使用β-巰基乙醇和PVP的組合也有效避免了DNA在抽提過程中的褐變。因為 PVP是一種高分子合成樹脂,能絡合多酚物質(zhì),防止酚類化合物氧化成醌類,避免了溶液褐化具有抗氧化作用[12],β-巰基乙醇的巰基能與酚類物質(zhì)競爭氧,有效避免了酚類物質(zhì)氧化成醌,避免材料的褐變[13]。

為了簡化提取過程,在加入研磨樣的同時加入RNA酶,并進行短暫振蕩可有效除去 RNA;為了防止多酚、單寧、多糖等次生代謝物質(zhì)與 DNA一起沉淀[14],在加入預冷無水乙醇,輕輕上下混勻后,待大量絮狀沉淀產(chǎn)生時,立即挑出DNA絮狀沉淀,一定不能離心。否則,雜質(zhì)都和DNA混在一起。

經(jīng)改良的DNA提取方法,提取的DNA質(zhì)量較好,并且簡化了提取步驟。提取的DNA能直接用于PCR擴增等相關的分子生物學研究。

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