海洋微生物活性物質(zhì)分離提取方法研究進(jìn)展

張奕婷，遲海洋，張麗霞，祖國仁

(1.大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 大慶 163712；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 國際學(xué)院，廣東 廣州 510520；3.大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

海洋覆蓋著地球表面積的71%，是生命的發(fā)源地，生物種類20多萬種，其生物量約占地球生物量的87%，其生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陸地生物的多樣性?？梢哉f海洋是地球上最大的資源能源寶庫。海洋環(huán)境條件惡劣，具有高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營(yíng)養(yǎng)、低溶氧等特點(diǎn)，為了適應(yīng)這樣的生存環(huán)境，海洋生物在新陳代謝、生存繁殖方式和適應(yīng)方式等方面產(chǎn)生了與陸地生物不同的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)。因此在海洋生物及其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多具有特異、新穎、多種多樣化學(xué)結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì)，包括抗腫瘤化合物、腫瘤促進(jìn)劑、抗炎癥/過敏化合物、抗菌、抗病毒化合物、生物毒素、抗寄生蟲化合物、多不飽和脂肪酸等，其中相當(dāng)部分生物活性物質(zhì)是陸地生物所沒有的[1]。這些海洋生物活性物質(zhì)具有種類繁多、結(jié)構(gòu)特異及活性強(qiáng)等特點(diǎn)，再加上目前陸地資源的不斷開發(fā)，發(fā)現(xiàn)新的代謝物的可能性日趨減少，帶來了對(duì)新的生物來源的強(qiáng)烈需求，有關(guān)海洋生物活性物質(zhì)的研究已經(jīng)引起國內(nèi)外的重視。海洋天然產(chǎn)物的特異結(jié)構(gòu)和藥理作用是陸源生物所無法比擬的，海洋藥物具有顯著的藥理穩(wěn)定性和強(qiáng)效性，毒副作用相對(duì)較小，對(duì)防治癌癥、艾滋病、心腦血管病、老年病等疑難病癥具有獨(dú)特效應(yīng)，已成為開發(fā)新藥、特藥的主要方向之一。

隨著海洋生物活性物質(zhì)的研究不斷加強(qiáng)，海洋微生物的研究開發(fā)也受到世界矚目。海洋微生物有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力，目前發(fā)現(xiàn)的許多海洋生物活性物質(zhì)都分離自海洋微生物，并且發(fā)現(xiàn)以前有些被認(rèn)為是海洋動(dòng)植物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)實(shí)際上是由與動(dòng)植物宿主共生的微生物所產(chǎn)生。因此,海洋微生物生物活性物質(zhì)的研究已成為開發(fā)海洋資源的重要內(nèi)容之一。

1 海洋微生物的定義及其種類

目前，關(guān)于什么是真正的海洋微生物仍有爭(zhēng)議。一般認(rèn)為，分離自海洋環(huán)境，其正常生長(zhǎng)需要海水，并可在寡營(yíng)養(yǎng)、低溫條件下生長(zhǎng)的微生物即可視為嚴(yán)格的海洋微生物。然而，有些分離自海洋的微生物，其生長(zhǎng)不一定需要海水，但可產(chǎn)生不同于陸地微生物的代謝物(如溴代化合物抗生素)或擁有某些特殊的生理性質(zhì)(如鹽耐受性、液化瓊脂等)，也被視為海洋微生物[2]。這些微生物中不僅包括海洋中生物起源的種類，而且還包含陸地起源后流入海洋中并適應(yīng)了的微生物種類，幾乎包括了所有的微生物種類[2]。如病毒等非細(xì)胞類生物、以產(chǎn)甲烷細(xì)菌和嗜鹽細(xì)菌為代表的古細(xì)菌、陸地環(huán)境常見的細(xì)菌種類以及種類繁多的真核微生物。

2 海洋微生物產(chǎn)生的生物活性代謝產(chǎn)物

有關(guān)海洋微生物產(chǎn)生生物活性代謝產(chǎn)物的大量研究工作在20世紀(jì)60年代以后展開，現(xiàn)已知的海洋微生物所產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)種類包括新型抗生素、抗癌藥物、不飽和脂肪酸、酶、酶抑制劑、維生素、毒素等，還有不少海洋微生物代謝物結(jié)構(gòu)新穎，但其功能還有待開發(fā)。其中對(duì)于海洋微生物產(chǎn)生的多糖類物質(zhì)和酶的研究比較深入。

2.1 海洋微生物多糖

近二十年來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展，人們漸漸認(rèn)識(shí)到糖及其復(fù)合物分子具有極其重要的生物學(xué)功能。多糖是構(gòu)成生物體的一類十分重要的有機(jī)化合物，與免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸?shù)榷加兄芮械年P(guān)系，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。多糖的種類各異，在生物體中行使著不同的功能。人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有許多方面的生物活性，且多數(shù)無毒，可以成為理想的藥物來源。近年來，隨著海洋藥物和海洋保健生物制品的蓬勃發(fā)展，海洋多糖類物質(zhì)的研究引起了廣泛重視，經(jīng)科研和實(shí)踐證明，海洋多糖及其降解產(chǎn)物具有多種新型的生理活性，在醫(yī)藥、化妝品、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 海洋微生物酶

海洋微生物酶的開發(fā)和利用是實(shí)現(xiàn)海洋資源高值化的關(guān)鍵技術(shù)之一。海洋生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜使得海洋微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和生理習(xí)性發(fā)生適應(yīng)性的改變，從而產(chǎn)生出具有獨(dú)特生理活性的酶系。利用從海洋微生物中分離提取的多糖降解酶對(duì)海洋生物多糖進(jìn)行降解，得到具有新型生物活性的低聚糖組分，并逐漸發(fā)展到海洋多糖降解酶及其酶解產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)，將會(huì)有效地推動(dòng)海洋多糖活性物質(zhì)的開發(fā)和利用，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

2.2.1 幾丁質(zhì)(殼聚糖)降解酶

幾丁質(zhì)是廣泛分布于自然界的生物多聚物。幾丁質(zhì)及殼聚糖經(jīng)水解后得到的寡糖具有多種生理功能，如改善腸道微生物區(qū)系，促進(jìn)腸道有益微生物的生長(zhǎng)，降低血液膽固醇含量，提高機(jī)體免疫功能等。因此，幾丁質(zhì)和殼聚糖的降解尤其是酶法降解成為近期人們關(guān)注的熱點(diǎn)。酶法降解包括專一性酶解法和非專一性酶解法，前者是利用從細(xì)菌、真菌及某些動(dòng)植物體內(nèi)提取的幾丁質(zhì)(殼聚糖)酶對(duì)底物進(jìn)行專一性降解。

在海洋中，由于浮游生物在生長(zhǎng)過程中進(jìn)行規(guī)律性的換殼，形成大量的幾丁質(zhì)，為幾丁質(zhì)降解微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了豐富的碳源和能源。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和殼聚糖酶的細(xì)菌包括:粘細(xì)菌(Myxobacter)、生孢噬細(xì)菌屬(Sporocytophaga)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、弧菌屬(Vibrio)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌(Serratia)、色桿菌屬(Chromobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等；放線菌,如節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等;真菌如曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)等。

2.2.2 褐藻膠降解酶

褐藻膠存在于海帶等褐藻細(xì)胞間質(zhì)中。褐藻膠酶可以水解甘露糖醛酸和古羅糖醛酸殘基間的1，4糖苷鍵，其主要來源是海洋中的微生物和食藻的海洋軟體動(dòng)物如海螺、鮑魚等。褐藻膠產(chǎn)生菌包括弧菌、黃桿菌(Flavobacterium multivolum)、固氮菌(Azotobacte vinelandii)、克雷伯氏菌(K.aerogenes、K.pnermoniae)、假單胞菌(P.alginovora、P.aeruginosa)、腸桿菌(E.cloacae)、別單胞菌、芽孢桿菌等。早在1934年，Waksman就從海水和海底沉積物以及藻體上分離到能降解褐藻膠的菌種。

多年的科研和實(shí)踐證明,褐藻多糖具有多種生理活性和廣泛的應(yīng)用價(jià)值,而酶解得到的低分子片段,在醫(yī)療保健等方面的多種功效的逐漸認(rèn)識(shí),更是成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).分子量小于1000的褐藻膠寡糖可作為人表皮角質(zhì)化細(xì)胞的激活劑,聚合度1～9的寡聚甘露糖醛酸或古羅糖醛酸可用于制作礦物吸收促進(jìn)劑。另外，人們還發(fā)現(xiàn)褐藻膠寡糖對(duì)植物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，在化工行業(yè)也有一定的應(yīng)用價(jià)值。褐藻膠酶還可作為海藻解壁酶的組成部分，可用于海藻的細(xì)胞解離，以獲得其單細(xì)胞和原生質(zhì)體。

2.2.3 瓊膠降解酶

瓊膠是一種親水性紅藻多糖，包括瓊脂糖和硫瓊膠兩種組分。瓊膠降解形成的低聚糖產(chǎn)物可作為功能性食品和藥品的原料或添加劑，近年來在日用化工領(lǐng)域又發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖的一些新用途，日本利用瓊膠寡糖作為添加劑生產(chǎn)的化妝品對(duì)皮膚具有很好的保濕效果，對(duì)頭發(fā)也有很好的調(diào)理效果。

降解瓊膠的酶可以從微生物和一些軟體動(dòng)物中分離得到，如黑指紋海兔(Aplysiadactylomela)、鮑(Haliotiscoccinea)、濱螺(Littorinastriata)、冠海詹(Diademaantillarum)等。瓊膠降解菌主要存在于海洋環(huán)境中，這些降解菌可分為兩類：一類菌軟化瓊膠，在菌落周圍出現(xiàn)凹陷；另一類菌則劇烈地液化瓊膠。潮汐帶淤泥中含有的瓊膠降解菌可達(dá)107/g,大約占淤泥中所有好氧細(xì)菌的2%～4%。自從1902年Gran第一次從海水中分離到瓊膠的分解細(xì)菌——假單胞菌(P.galatica)以來，人們已經(jīng)從海洋環(huán)境中分離到多種瓊膠分解菌，包括：噬細(xì)胞菌屬(Cytophage)、芽孢桿菌屬、弧菌屬、別單胞菌屬、假別單胞菌屬(Pseudoalteromonas)及鏈霉菌屬等。

2.2.4 纖維素降解酶

纖維素為自然界第一大糖，人們很早就知道細(xì)菌和霉菌能夠降解纖維素，直至1912年，Pringsheim才從耐熱性纖維素細(xì)菌中分離出纖維素酶。纖維素酶可用于生物紡織助劑，棉麻產(chǎn)品的磨洗等后處理，用于海藻解壁及生物肥料加工等。隨著海藻工業(yè)的迅猛發(fā)展，大量的海藻加工廢棄物產(chǎn)生并排放到環(huán)境中，造成極為嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，利用纖維素酶降解海藻加工廢棄物，得到易被植物吸收利用的低聚分子片段，制成生物肥料，同時(shí)解決了環(huán)保問題。利用細(xì)菌、放線菌、真菌對(duì)自然環(huán)境中的野生植物和廢棄纖維素產(chǎn)品進(jìn)行降解再利用，可以生產(chǎn)乙醇、糠醛等各種工業(yè)產(chǎn)品，同時(shí)還可以回收大量的微生物單細(xì)胞蛋白。Takashi Yamasaki等人利用紫菜粉或木聚糖分離到275株細(xì)菌，包括黃桿菌、別單胞菌、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和弧菌，它們具有多種糖苷酶活性，能夠降解紫菜等海藻的細(xì)胞壁多糖，包括木聚糖、紫菜多糖、甘露聚糖和纖維素，得到紫菜細(xì)胞的原生質(zhì)體。

3 海洋微生物生物活性代謝產(chǎn)物的分離和提取

海洋微生物產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物主要包括：多糖、多肽、脂肪酸、皂甙、萜類、大環(huán)聚酯類、聚醚類等化合物，具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多樣性、高生物活性等突出特點(diǎn)。因此海洋生物活性物質(zhì)的篩選、提取、純化是一項(xiàng)十分困難的工作，用傳統(tǒng)的化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)，比如多糖類物質(zhì)。多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水、稀堿溶液提取，盡量避免在酸性條件下提取，以防引起糖苷鍵的斷裂，稀酸提取時(shí)，時(shí)間宜短、溫度不宜超過50℃。

3.1 萃取技術(shù)

傳統(tǒng)的液—液萃取分離技術(shù)成本比較低、易于運(yùn)作，已廣泛應(yīng)用于多組分物質(zhì)的分離。但由于溶劑的局限性，難于分離大分子生物活性物質(zhì)。近年來，一些新的萃取技術(shù)顯示了良好的應(yīng)用前景。

3.1.1 超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取技術(shù)是以超臨界狀態(tài)下的流體為溶劑，利用該狀態(tài)下的流體所具有的高滲透能力和高溶解能力分離混合物的過程。超臨界流體是溫度與壓力均在其臨界點(diǎn)之上的流體，性質(zhì)介于氣體和液體之間，由于液體相接近的密度，與氣體相接近的黏度及高的擴(kuò)散系數(shù)，故具有很高的溶解能力及良好的流動(dòng)、傳遞性能，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有毒、易燃、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑。

最常用的超臨界流體二氧化碳，由于具有臨界條件溫和、對(duì)大部分物質(zhì)呈化學(xué)惰性、無色無味無毒、物溶解污染、易制成高純度氣體，不易點(diǎn)燃等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于熱敏性、易揮發(fā)、易氧化成分的分離萃取，已經(jīng)被廣泛使用?，F(xiàn)在可利用超臨界萃取技術(shù)分離提取的海洋活性物質(zhì)有海洋生物毒素、萜類化合物、海洋天然色素、某些稀有氨基酸等。

3.1.2 反膠束萃取技術(shù)

雙親物質(zhì)(表面活性劑)溶于非極性有機(jī)溶劑，當(dāng)濃度大于臨界膠團(tuán)濃度時(shí)，在有機(jī)相中會(huì)自發(fā)形成聚集體，成為反膠束。反膠束中極性頭朝內(nèi)，非極性頭朝外形成親水內(nèi)核，可以增溶水、蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)。近年來，該技術(shù)和其他方法結(jié)合，如親和配體的引入、超臨界流體萃取技術(shù)的聯(lián)用以及分離萃取工藝設(shè)備的完善，大大提高了目標(biāo)物的萃取率和分離的選擇性，拓展了該技術(shù)的應(yīng)用空間，可以預(yù)見它在海洋微生物生物活性產(chǎn)物方面的研究和開發(fā)及海洋生物制藥方面有良好的應(yīng)用潛力。

3.2 膜分離技術(shù)

膜分離是用天然或人工合成的高分子薄膜以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力,對(duì)雙組分或多組分的溶質(zhì)進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和濃縮的過程。膜分離過程在常溫、無相變、無化學(xué)變化條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的分離，是一項(xiàng)有效、節(jié)能、無污染、保持原料性能不變的物質(zhì)分離技術(shù)。近年來，微濾、超濾及反滲透等各種膜分離技術(shù)發(fā)展迅速，以廣泛應(yīng)用于制藥、生物化工、食品、環(huán)保等方面，在天然活性物質(zhì)的提取和海洋藥物的研制中更顯現(xiàn)出其技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

3.2.1 納濾

納濾膜是20世紀(jì)80年代末問世的一種新型分離膜，其截留分子量介于反滲透和超濾膜之間。該膜存在著納米級(jí)細(xì)孔，截留率大于95%的最小分子的直徑約為1nm。與反滲透和超濾等膜分離過程一樣，納濾也是以壓力差為推動(dòng)力的膜分離，其分離機(jī)理可以運(yùn)用電荷模型、細(xì)孔模型及靜電排斥和立體阻礙模型等來描述。

利用納濾膜的電荷性，可以用來分離肽類活性物質(zhì)。多肽分子含有游離的羧基和氨基，等電點(diǎn)時(shí)呈電中性，當(dāng)溶液的pH值高于或低于等電點(diǎn)時(shí)，多肽分子則呈陰離子或陽離子形式，帶有相應(yīng)的正電荷或負(fù)電荷。利用帶有靜電官能基團(tuán)的納濾膜，只要通過調(diào)節(jié)溶液的pH，就可以截留離子而不截留電中性的分子。此特性可以分離分子量幾乎相差無幾，但等電點(diǎn)相差較大的多肽混合體系。同時(shí)選擇適合的納濾膜還可以從低聚糖混合溶液中有效的除去單糖、二糖等[4]。

3.2.2 親和—膜過濾

親和—膜過濾是生物分子的親和相互作用原理與膜分離技術(shù)相結(jié)合的新型耦合分離技術(shù)。當(dāng)需提純物質(zhì)(親和體)自由存在于提取液時(shí)，由于其分子量相對(duì)比較小，能順利地通過截留相對(duì)分子量大的超濾膜。但當(dāng)親合體與具有結(jié)合能力的大分子配體混合形成親和體大分子復(fù)合物后，由于此復(fù)合體的分子量遠(yuǎn)大于超濾膜的截留相對(duì)分子量，從而被截留，而提取液中其他未被結(jié)合的組分則通過超濾膜被除去。用適合的洗脫液處理超濾膜截流到的復(fù)合物，使得親和膜過濾法既具有膜分離法易于放大、分離速度快的特點(diǎn)，又具有親和層析選擇性好、分離精度高的優(yōu)點(diǎn)，在篩選分離純化濃縮功能性蛋白質(zhì)分子(酶、抗體、抗原、載體、抗生素等)有較大的應(yīng)用前景。

3.3 色譜方法

色譜方法的起源、發(fā)展與天然產(chǎn)物的研究工作密切相關(guān)。海洋微生物活性成分多而結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有效成分的分離、純化很困難，而色譜分離技術(shù)則是這類物質(zhì)精細(xì)分離的有效手段。

3.3.1 液相色譜

液相色譜法作為一種分離手段，是根據(jù)混合物種不同組分在流動(dòng)相和固定相間具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，這些組分在兩項(xiàng)間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而得到分離。液相色譜分離法是海洋天然活性物質(zhì)蛋白質(zhì)、多肽、多糖、低聚糖、核苷酸等的分離純化的重要方法。特別是制備性高效液相色譜技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)海洋生物制藥產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，它不僅可以在溫和條件下段時(shí)間內(nèi)達(dá)到分離目的，更重要的是易于放大，能形成生產(chǎn)化的制備規(guī)模。液相色譜可按溶質(zhì)在兩相分離過程的物理化學(xué)原理分類：

1)吸附色譜：用固體吸附劑作固定相，以不同的溶劑作流動(dòng)相，依據(jù)樣品中各組分在吸附劑上吸附性能的差別來實(shí)現(xiàn)分離。

2)分配色譜：用在固相基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動(dòng)相，依據(jù)樣品中各組分在固定液上分配性能的差別來實(shí)現(xiàn)分離。

3)離子色譜：用高效微粒離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，依據(jù)離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團(tuán)進(jìn)行可逆性離子交換能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離。

4)體積排阻色譜：用化學(xué)惰性的多孔性凝膠作固定相，按固定相對(duì)樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來實(shí)現(xiàn)分離。

5)親和色譜：以在不同基體上，鍵合多種不同特征的配體作固定相，用不同的pH值緩沖溶液作流動(dòng)相，依據(jù)生物分子與基體上鍵聯(lián)的配位體之間存在的特異性親和作用能力的差別，而實(shí)現(xiàn)對(duì)具有生物活性的生物分子的分離。

3.3.2 高速逆流色譜

逆流色譜是一種無載體的液—液分配色譜，從古老的分液漏斗萃取法發(fā)展而來，有著回收率高、制備量大、排除載體干擾的優(yōu)點(diǎn)。

3.3.3 超臨界流體色譜

超臨界流體色譜以超臨界流體為流動(dòng)相，必要時(shí)加入甲醇等極性物質(zhì)為改性劑來改善分離性能。超臨界流體色譜具有氣相色譜和高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，在室溫下即可分離熱不穩(wěn)定性、沸點(diǎn)較高或分子量較大的物質(zhì)，同時(shí)還具有柱效高、分離速度快的特點(diǎn)，可用通用的靈敏檢測(cè)器。

4 結(jié)語

21世紀(jì)是海洋的世紀(jì)，海洋是人類生命的巨大寶庫。在過去的幾十年中，人們已經(jīng)從海洋環(huán)境中分離到數(shù)百種具有生理活性的化合物，其中很多屬海洋環(huán)境特有的成分。然而我們對(duì)海洋微生物的研究和開發(fā)還剛剛起步，關(guān)于海洋微生物的生理結(jié)構(gòu)、生活特點(diǎn)、代謝調(diào)控各方面還很不清楚，嚴(yán)重制約了人們對(duì)海洋財(cái)富的開發(fā)和利用。隨著化學(xué)、生物、物理、制藥等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和相互滲透，天然產(chǎn)物的分離提取技術(shù)的長(zhǎng)足進(jìn)步，對(duì)海洋微生物生物活性代謝產(chǎn)物的分離提取和研究提供更強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

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