西甜瓜組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化影響因子研究進(jìn)展

孔維萍，程鴻，蘇永全，劉東順

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅蘭州，730070）

建立高效的離體培養(yǎng)再生體系是植物遺傳轉(zhuǎn)化成功的基礎(chǔ)。目前已能夠通過(guò)器官發(fā)生途徑獲得西甜瓜再生植株，有的還建立了比較高頻的再生體系[1～4]。西甜瓜生產(chǎn)中主要的問(wèn)題是病蟲(chóng)害嚴(yán)重以及品質(zhì)、產(chǎn)量不高等。目前利用遺傳工程方法改良甜瓜種質(zhì)的研究主要有轉(zhuǎn)化病毒的外殼蛋白基因、耐鹽基因和ACC氧化酶反義基因等，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株[5～7]。本文對(duì)西甜瓜再生體系建立與農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素作了綜述，為進(jìn)一步開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究、創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，特別是抗性種質(zhì)資源，提高育種水平奠定良好基礎(chǔ)。

1 再生體系建立的影響因素

1.1 基因型

材料的基因型對(duì)愈傷組織的器官分化有決定性的影響。外植體的基因型是影響離體培養(yǎng)再生的內(nèi)在因素。不同品種西甜瓜的組培情況差異極大，植株再生頻率隨基因型的不同而不同[8]，薄皮甜瓜的子葉組織培養(yǎng)再生能力比厚皮甜瓜容易得多。潘俊松等[9]對(duì)8個(gè)品種甜瓜子葉節(jié)離體培養(yǎng)的結(jié)果表明，基因型對(duì)子葉節(jié)叢生芽的誘導(dǎo)有較大影響，其中再生不定芽數(shù)最高的為12.5個(gè)，最低為7.2個(gè)。Galperin等[10]選用了30份材料研究，表明甜瓜器官的再生能力因基因型的不同而不同。孫治圖等[11]以23種基因型材料的西瓜無(wú)菌苗子葉為試材，運(yùn)用方差分析篩選高效基因型材料及芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基。結(jié)果表明，基因型不同的材料誘導(dǎo)效果有明顯差異，最高誘導(dǎo)率達(dá)到90.0%，篩選的芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L。

1.2 取材部位及時(shí)間

甜瓜組織培養(yǎng)研究中，目前大多數(shù)報(bào)道[12]指出不同基因型品種的幼嫩子葉都可得到較高頻率的再生不定芽，而真葉、下胚軸、莖尖等部位再生頻率很低。馮鳳娟等[1]以新梢頂端展開(kāi)的第2~3片葉在MS+6-BA 1.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，外植體遠(yuǎn)軸面向下接觸培養(yǎng)基，直接轉(zhuǎn)入正常光周期下培養(yǎng)再生頻率可達(dá)100%，平均每個(gè)外植體上可誘導(dǎo)出11株健壯植株。王果萍[13]以西瓜未成熟胚及子葉、幼苗莖尖、子葉及下胚軸切段進(jìn)行離體再生培養(yǎng)結(jié)果表明，子葉誘導(dǎo)再生效果最佳。李娟等[14]以7種不同基因型西瓜為試材進(jìn)行離體花藥培養(yǎng)，對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，西瓜離體花藥誘導(dǎo)率達(dá)到了68.42%，為西甜瓜組織培養(yǎng)提供了新途徑。

同一外植體不同部位不定芽誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)方式有差異。馬國(guó)斌等[15]的研究表明，西瓜和甜瓜組織培養(yǎng)中，子葉和真葉外植體切塊形態(tài)學(xué)下端部位總是首先大量發(fā)生愈傷組織或分化出器官，而切塊形態(tài)學(xué)上端則很少或幾乎不發(fā)生愈傷組織或器官。王春霞等[16]對(duì)京欣1號(hào)西瓜子葉進(jìn)行芽分化試驗(yàn)的結(jié)果表明，子葉的不同部位再分化能力并不相同。另外外植體切割以及培養(yǎng)方式對(duì)誘導(dǎo)出苗也有很大影響。潘俊松等[9]的研究表明，先切頂芽的后期成苗時(shí)出現(xiàn)畸形苗，切割1/3子葉的誘導(dǎo)率不如后切頂芽的，子葉老化快，產(chǎn)生黃化和萎縮等現(xiàn)象。孫天國(guó)的研究結(jié)果表明，橫、縱切子葉外植體的愈傷組織生長(zhǎng)速度、著生位置、芽原基的分布和生長(zhǎng)速度均不同，出芽率差異也很大。認(rèn)為縱切破壞了子葉表面最大的維管束，使植物體內(nèi)內(nèi)源激素的量減半，內(nèi)外源激素的聯(lián)合作用減弱，而使得誘導(dǎo)能力降低，抑制了芽的誘導(dǎo)與分化。培養(yǎng)方式也同樣會(huì)影響甜瓜葉片的再生，馮鳳娟等[1]的試驗(yàn)表明遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基是甜瓜葉片再生適宜的放置方式，分析其原因可能是因?yàn)槿~背面氣孔較多，角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，有利于營(yíng)養(yǎng)的吸收。

1.3 培養(yǎng)基以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)和濃度

不同外植體選用相同的基本培養(yǎng)基，或同一外植體選用不同的基本培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率均不同。于喜艷等[17]研究表明，改良的Miller培養(yǎng)基獲得的不定芽誘導(dǎo)率較高。馬國(guó)斌等[15]報(bào)道，改良的MS培養(yǎng)基也可得到較好的不定芽分化效果。鄧向東等[18]的研究表明，LS培養(yǎng)基對(duì)哈密瓜的不定芽誘導(dǎo)效果較好，有提高不定芽生活力、增加不定芽數(shù)量的作用。這可能是由于甜瓜本身的內(nèi)源生長(zhǎng)素的含量比較高，而不需要人為添加，如果添加，就會(huì)引起愈傷組織的發(fā)生，不利于不定芽的誘導(dǎo)。可見(jiàn)，不同培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)出不定芽，但不同品種甜瓜的適合培養(yǎng)基不同。

植物組織不同對(duì)植物激素的要求有很大變化，這取決于它本身的內(nèi)生激素水平。馮鳳娟等[1]的試驗(yàn)結(jié)果表明，甜瓜不定芽誘導(dǎo)中，生長(zhǎng)素是非必要的，適宜甜瓜葉片誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，不需要IAA。在甜瓜組織培養(yǎng)中，常用的細(xì)胞分裂素的類(lèi)似物是6-BA和KT，生長(zhǎng)素的類(lèi)似物中常用的是IAA、NAA和IBA。添加不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)或組合的組培效應(yīng)不相同。 鄧向東等[18]在以 6-BA、ZT、KT、2iP和2，4-D誘導(dǎo)哈密瓜不定芽的試驗(yàn)中觀察到，6-BA的誘導(dǎo)效果最好，其最適濃度為0.5 mg/L，而高濃度的ABA（2.0 mg/L）可以提高網(wǎng)紋哈密瓜的誘導(dǎo)率。此外，ABA對(duì)子葉誘導(dǎo)不定芽也有一定的作用。于喜艷等[17]用6-BA和IAA組合誘導(dǎo)的結(jié)果表明，低濃度的IAA（0.2 mg/L）有利于厚皮甜瓜子葉的分化，而對(duì)薄皮甜瓜幾乎沒(méi)有影響。李娟等[14]、曹華興等[19]的研究結(jié)果也表明，培養(yǎng)基中激素的種類(lèi)、用量和配比，對(duì)誘發(fā)小孢子啟動(dòng)、分裂、生長(zhǎng)和分化起決定性作用。

此外如AgNO3、VC、脯氨酸、水解酪蛋白以及活性碳等添加物通過(guò)調(diào)節(jié)代謝過(guò)程對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化也有一定影響。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化影響因素

遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、花粉管通道法等，目前西甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。

2.1 菌株

目前，西甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化中常用的菌株為章魚(yú)堿型的LBA4404與農(nóng)桿堿型的EHA105。Fang等[20]是最早報(bào)道用根癌農(nóng)桿菌改良株系LBA4404，并成功地將NPTⅡ基因（抗卡那霉素基因）轉(zhuǎn)入甜瓜品種。王慧中等[21]以含選擇標(biāo)記基因NPTⅡ和WMV-1CP（西瓜花葉病毒）基因雙元載體pBEWMV的根癌農(nóng)桿菌LBA4404感染甜瓜子葉外植體，獲得可育的轉(zhuǎn)基因甜瓜植株。顏雪等[7]也是采用農(nóng)桿菌LBA4404對(duì)新疆感病甜瓜進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得抗枯萎病甜瓜新品種。張志忠等[22]分別用農(nóng)桿菌菌株LBA4404、AGL-1和EHA105侵染同一西瓜品種，結(jié)果表明，EHA105的侵染能力明顯優(yōu)于LBA4404和AGL-1。李建勇等[23]用農(nóng)桿菌LBA4404（含pCAMBIA1301重組質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化浙密2號(hào)西瓜，經(jīng)GUS檢測(cè)獲得抗性芽。

2.2 菌液濃度及侵染時(shí)間

農(nóng)桿菌菌液濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一。濃度過(guò)低，農(nóng)桿菌數(shù)目不足而影響侵染效率，濃度過(guò)高，農(nóng)桿菌過(guò)度繁殖又會(huì)對(duì)外植體造成傷害，從而降低轉(zhuǎn)化效率。另外適宜的侵染時(shí)間可以使較多的農(nóng)桿菌附著于外植體傷口處；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體在后期培養(yǎng)中易發(fā)生褐化死亡。李建勇等[23]將菌液濃度稀釋到 OD600分別為 0，0.1，0.3，0.5，0.7， 侵染時(shí)間設(shè)為0，5，10，15 min，結(jié)果表明 OD 為 0.3，侵染時(shí)間 10 min效果最佳，侵染效率達(dá)67.7%。

2.3 預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間

預(yù)培養(yǎng)可以淘汰生命力弱的外植體，促使外植體盡早適應(yīng)組織培養(yǎng)環(huán)境而進(jìn)入萌動(dòng)狀態(tài)，在一定程度上提高轉(zhuǎn)化率。但預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)使外植體切面表皮細(xì)胞形成潛伏芽，使轉(zhuǎn)化率降低，假陽(yáng)性率增高。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短轉(zhuǎn)化率極低，但共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，農(nóng)桿菌會(huì)過(guò)度繁殖，從而造成植物細(xì)胞因受到毒害而死亡，降低轉(zhuǎn)化率。顏雪等[7]通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因成功導(dǎo)入甜瓜中，采用的預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時(shí)間均為3 d。李建勇等[23]的結(jié)論指出，預(yù)培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到63.3%。

2.4 抗生素

在用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞時(shí)，常用頭孢霉素和羧芐青霉素控制根癌農(nóng)桿菌的過(guò)量生長(zhǎng)，而且兩者除了抑制根癌農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)外，還影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。過(guò)量頭孢霉素易引起傷口細(xì)胞褐化、死亡，抑制芽的分化；而羧芐青霉素則促進(jìn)芽分化，抑制生根。李建勇等[23]指出，潮霉素對(duì)西瓜的分化有很強(qiáng)的抑制作用，隨著潮霉素濃度的上升，外植體存活率顯著下降，當(dāng)潮霉素在15 mg/L或以上濃度時(shí)，可以完全抑制芽的分化，因此可以作為轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選濃度。300 mg/L的頭孢霉素抑菌效果相對(duì)較好，對(duì)芽分化的影響最小。張智俊等[24]的結(jié)論表明，75 mg/L的Kan可以作為篩選轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體的臨界濃度，而Amp的抑菌濃度為200~400 mg/L。

2.5 其他添加物

李建勇等[23]在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入20 mg/L的乙酰丁香酮（AS）顯著提高了西瓜子葉外植體的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化率高達(dá)70%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沒(méi)有加AS對(duì)照的轉(zhuǎn)化率（20%）；張志忠等[22]在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS可明顯提高轉(zhuǎn)化效率，最高達(dá)74.8%，而在其他條件類(lèi)似情況下不經(jīng)此處理的轉(zhuǎn)化率僅為46.6%。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)化過(guò)程中使用AS對(duì)提高轉(zhuǎn)化率是有益的。

目前關(guān)于AgNO3在組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)理有3種解釋?zhuān)恍┭芯空J(rèn)為，AgNO3是乙烯作用的抑制劑，它能通過(guò)促進(jìn)多胺的合成提高體細(xì)胞胚胎和芽發(fā)生的頻率。Chi等認(rèn)為AgNO3并不是抑制乙烯的合成，而是促進(jìn)ACC合成酶活力和ACC的積累。另外還有研究認(rèn)為Ag+在促進(jìn)植株再生上與多胺代謝無(wú)關(guān)，Ag+抑制乙烯活性可能是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞上的乙烯受體蛋白，起到阻止或降低乙烯的作用。

3 結(jié)語(yǔ)

植物病蟲(chóng)害生理小種變異比較迅速，很難用化學(xué)和物理方法防治，我們可以從廣譜、持久的抗病基因方面入手，探索更有效的防治途徑。另外我們可以嘗試?yán)门呷榕囵B(yǎng)來(lái)產(chǎn)生三倍體，從根本上改進(jìn)利用二倍體和四倍體雜交產(chǎn)生三倍體的育種手段。

目前大多數(shù)轉(zhuǎn)基因工作仍停留在試驗(yàn)研究階段，在生產(chǎn)中的應(yīng)用還較少。另外轉(zhuǎn)基因植物潛在的毒性和環(huán)境安全性是植物抗真菌基因工程推向市場(chǎng)的最大障礙。我們應(yīng)該建立可靠的轉(zhuǎn)基因植物毒性和環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)植物特別是作物抗病分子機(jī)理進(jìn)行深入研究、完善轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，使基因工程在作物種質(zhì)創(chuàng)新、作物育種上得到更廣泛的有效應(yīng)用。

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