產(chǎn)果香菌株的初步鑒定及香味成分分析

李 峰，明艷紅，李媛媛，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，資源植物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000)

產(chǎn)果香菌株的初步鑒定及香味成分分析

李 峰，明艷紅，李媛媛，潘 瑤，陳 奇

(淮北煤炭師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，資源植物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000)

對從安徽碭山果園土壤中分離出的產(chǎn)果香菌進(jìn)行純化和菌種形態(tài)特征研究，初步鑒定該菌株為地霉屬。采用頂空-固相微萃取法(HS-SPME)結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析產(chǎn)生的具有水果香味的物質(zhì)，結(jié)果表明，其主要成分為酯類和醇類，其中最多的是酯類，共32種，占總量的73.84%；醇類物質(zhì)8種，占12.53%。

產(chǎn)果香菌株；生長曲線；香氣成分；氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，消費(fèi)者在追求食品健康、營養(yǎng)、衛(wèi)生的同時(shí)也看重色澤、口味。各種可以食用的香料和人工色素在食品配料中所占的比例雖然很小，但卻對食品色澤、口味起著舉足輕重的作用。香料對原有食物的口味有輔助、穩(wěn)定、補(bǔ)充等作用[1]。香料的主要成分為脂類和醇類；香料的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成、動(dòng)植物提取以及微生物發(fā)酵法。隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，生物法生產(chǎn)香料的工作已取得了很多進(jìn)展。目前，已經(jīng)得到應(yīng)用的產(chǎn)香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)[2]、假絲酵母、乳酸菌、黑曲霉等。這些產(chǎn)香微生物主要應(yīng)用于酒類、食醋、香料、面包、煙用香料以及果汁等。如用婁地青霉生產(chǎn)甲基酮；以5-十二酮酸為起始原料，采用面包酵母生產(chǎn)R-δ-十二酸酐；用熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)發(fā)酵相應(yīng)的烷烴生產(chǎn)二梭酸；以乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酮和乙醛[3-4]，以棕桐酸為原料，由球擬酵母(Torulopsis bombicola)將其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯或十六烷；用微生物細(xì)胞或生物酶催化合成甜味、水果型香料。酵母菌可以部分代謝L-苯基苯胺，包括脫氨基、脫羧基，然后還原，用溶劑萃取發(fā)酵液的方法回收產(chǎn)品。這一工藝采用了豐富、價(jià)廉的苯基苯胺，它也用于生產(chǎn)高強(qiáng)度甜味劑阿斯巴甜。微生物發(fā)酵法與化學(xué)合成、動(dòng)植物提取相比具有很大的優(yōu)勢，這主要是因?yàn)槲⑸锏纳L周期短、培養(yǎng)簡單，不受原料限制；利用微生物制取的香料產(chǎn)物天然、健康安全，既可以降低成本，又可以提高香料的產(chǎn)量，彌補(bǔ)資源的不足，有利于香料大量地被利用，使生產(chǎn)廠家與消費(fèi)者均受益。固相微萃取(SPME)與氣-質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)聯(lián)用的方法對水果的香氣成分測定簡單有效，已被應(yīng)用在歐李、菠蘿等水果的香氣成分測定上[5-6]。雖然產(chǎn)香菌已經(jīng)在一些領(lǐng)域得到了很好的應(yīng)用，但其領(lǐng)域仍不夠廣泛，有待于進(jìn)一步拓寬。并且，有些參數(shù)還需要進(jìn)一步的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以達(dá)到更好的效果。

本研究對從安徽碭山果園土壤中分離出的產(chǎn)果香菌進(jìn)行分離純化、菌種鑒定以及生長曲線的描繪，利用頂空-固相微萃取法(HS-SPME)結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(GCMS)分析所產(chǎn)生的水果香味的成分，旨在為該菌在食用香料生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1 菌株

菌株P(guān)Y03分離于果樹下15cm的土壤中。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基[7]，外加硫酸鏈霉素1‰；純化培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF型凈化工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；CCS4S恒溫培養(yǎng)搖床 長沙科威實(shí)業(yè)有限公司；HPX-9272MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HS-SFME裝置 美國Supelco公司；TraceMS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Finnigan質(zhì)譜公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

從果園中果樹下15cm的土壤中采集土樣，通過初篩培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，重復(fù)3次；再通過純化培養(yǎng)基進(jìn)行菌株純化，重復(fù)3次；然后進(jìn)行菌落的含水狀態(tài)、外觀形態(tài)、與培養(yǎng)基結(jié)合程度、顏色、正反面顏色、透明度、邊緣、氣味觀察以及通過采用純化培養(yǎng)基制備顯微鏡小室通過培養(yǎng)進(jìn)一步觀察；重復(fù)以上步驟。最后對這株果香菌進(jìn)行生長曲線的繪制以及采用PDA培養(yǎng)基斜面在4℃進(jìn)行菌株保存。

初篩和復(fù)篩都是在28℃進(jìn)行培養(yǎng)，其他沒有特別說明培養(yǎng)溫度均為28℃。

1.2.2 產(chǎn)物的生理生化分析

1)形態(tài)學(xué)鑒定：進(jìn)行菌落的觀察以及顯微鏡小室培養(yǎng)觀察；2)生理生化鑒定：根據(jù)真菌學(xué)知識(shí)[8]對實(shí)驗(yàn)菌株生理生化特性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和觀察；3)對菌株生長曲線的測定：將純化菌株接種于液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)12h。無菌條件下，以10%的體積分?jǐn)?shù)將菌懸液加入到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，每3h取樣，以5000r/min的速度離心15min，倒出上清液用蒸餾水清洗沉淀物兩次后，收集菌絲體置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，電子天平準(zhǔn)確稱量，得菌絲濕質(zhì)量(生物量)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌絲濕質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪生長曲線。

1.2.3 菌發(fā)酵液的初步分析

取菌發(fā)酵液200mL，置于1000mL分液漏斗中，分別用150、100、40mL二氯甲烷萃取3次；然后用無水硫酸鈉干燥，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，得到具有香味的淡紅色液體，取10滴加入含飽和氯化鈉溶液的試管中。

1.2.4 菌發(fā)酵液香味成分的GC-MS分析

1.2.4.1 菌發(fā)酵液香氣成分的固相微萃取[9-10]

首先將固相微萃取裝置的萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化，老化溫度250℃，老化時(shí)間2h。取6mL菌液，置于15mL樣品瓶中，放入轉(zhuǎn)子在45℃恒溫。將固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶中，抽出纖維頭(注意萃取頭不要碰到菌液)，打開磁力攪拌使轉(zhuǎn)子在菌發(fā)酵液中迅速轉(zhuǎn)動(dòng)，吸附36min，隨后縮回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭直接插入氣相色譜儀，推出纖維頭，于250℃解析2min，用于GC-MS分析。

1.2.4.2 色譜條件

氣譜條件：色譜柱：PEG(30m×0.25m，0.25μm)；程序升溫：40℃保持4min，5℃/min升溫至90℃，10℃/min升溫至230℃，保持5min。載氣He，流速0.80mL/min，檢測器溫度250℃，入口溫度250℃。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70eV。離子源溫度200℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

2.1.1 菌落觀察

生長較快，培養(yǎng)12h即可長出白色菌落，菌落平板如圖1。

圖1 菌株平板劃線觀察Fig.1 Observation of strain of streak plate

2.1.2 顯微鏡小室培養(yǎng)觀察

將分離到的菌種，于顯微鏡下觀察；結(jié)果如圖2A、2B

圖2 菌體形態(tài)Fig.2 Morphology of the strain

該菌菌落呈平面擴(kuò)散、生長快、扁平、乳白色、短絨狀或近于粉狀、干燥。有同心圈和放射線，有的

呈中心突起。在液體培養(yǎng)基中生白醭，褶皺薄膜，培養(yǎng)液混濁，呈絮狀沉淀。光學(xué)顯微鏡下觀察，有單細(xì)胞和多細(xì)胞真菌絲及假菌絲混雜在一起，裂殖，菌絲為有橫隔的真菌絲，有的為二叉分枝。菌絲成熟后斷裂成單個(gè)或成鏈、長筒形、末端鈍圓的節(jié)孢子。

2.2 產(chǎn)物的生理生化特性分析

菌株的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表1～3。

表1 菌株的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)Table 1 Sugar fermentation test of strains

表2 菌株對碳源的同化Table 2 Carbon assimilation of strains

表3 菌株生理實(shí)驗(yàn)Table 3 Physiologycal experiments of strains

由表1～3可知：菌株對對糖發(fā)酵的能力較弱，對碳源的同化能力較弱，對溫度、NaCl、葡萄糖的耐性也較差。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論結(jié)合真菌學(xué)知識(shí)[8]鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，地霉屬。

2.2.1 液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)觀察

將純化菌株接種于搖瓶液體培養(yǎng)基中(250mL三角瓶中加入100mL液體培養(yǎng)基)，200r/min，26℃，振蕩培養(yǎng)3d。培養(yǎng)12h即可觀察到發(fā)酵液變渾濁并開始慢慢變紅，培養(yǎng)24h即可聞到菠蘿和香蕉的香味。

2.2.2 生長曲線的繪制

從該菌的生長曲線可以看出，該地霉屬菌株24h即可進(jìn)入穩(wěn)定期，48h后進(jìn)入衰亡期。

圖3 菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of the strain

2.3 菌液產(chǎn)物的分析

2.3.1 產(chǎn)物的初步分析

具有香味的淡紅色液體加入含飽和氯化鈉溶液的試管后出現(xiàn)分層現(xiàn)象，上層為紅色的發(fā)酵液，下層為水。紅色的發(fā)酵液能夠被飽和氯化鈉溶液萃取，根據(jù)相似相溶原理可知紅色的發(fā)酵液應(yīng)為非極性物質(zhì)。

2.3.2 GC-MS結(jié)果分析

采用HS-SPME結(jié)合GC-MS從菌株發(fā)酵液中提取并分離得到51種化合物，如圖4所示。通過NIST/WELLY標(biāo)準(zhǔn)譜庫數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行核對分析，共鑒定出其中46種香氣組分。采用色譜面積歸一化法計(jì)算已定性的香氣物質(zhì)的相對含量，結(jié)果見表4。

圖4 菌株發(fā)酵液香氣成分GC-MS總離子流圖Fig.4 GC-MS total ion current chromatogram of aroma components from fermented media

香氣成分通常是指那些通過味覺和嗅覺感覺到的物質(zhì)。揮發(fā)性香氣物質(zhì)約2 0 0 0種，包括酯類、醛類、內(nèi)脂類、萜類、醇類、羰基化合物和一些含硫化合物等[11]。表4顯示，鑒定出的46種組分峰面積之和占總離子流出色譜峰面積的88.11%。這些香氣成分包括酯類、醇類、醛類、萜類、芳香烴類等成分。在已鑒定的香氣組分中，種類最多的是酯類，共32種，其含量占總量的73.84%；醇類物質(zhì)8種，占12.53%；萜類物質(zhì)3種，占1.70%；醛類物質(zhì)1種，占0.33%；芳香烴類物質(zhì)2種，占0.31%。

表4 菌株發(fā)酵液主要香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis results of aroma components from fermented media

從單一香氣成分及香氣成分的感官特征方面分析，菌發(fā)酵液中主要香氣物質(zhì)為：乙酸乙酯(16.70%)、丙酸乙酯(11.31%)、丁酸乙酯(7.47%)、2-丁稀酸乙酯(5.01%)、丙酸異丁酯(4.50%)、丙酸-2-甲基丁酯(3.79%)、2-甲基-2-丁烯酸乙酯(3.66%)、乙酸-2-甲基丙酯(2.59%)、己酸乙酯(2.31%)以及苯乙醇(3.95%)、3-甲基丁醇(5.93%)。這些香氣物質(zhì)含量占總量的67.22%。由此可見，主要香氣成分為酯類和醇類。這也是該菌發(fā)酵液散發(fā)出濃郁水果香味的重要原因。

本次測定得到的46種香氣成分中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯等化合物常出現(xiàn)在香蕉、菠蘿、草莓等果品的香氣成分中。苯乙醇是一種具有花香的液體，它具有柔和、愉快而持久的玫瑰香味從而被廣泛應(yīng)用于各種食用香精和煙用香精中。

3 討 論

從果園的泥土中篩選得到的地霉屬菌株，生長條件簡單，可以利用工業(yè)上的廢料解決環(huán)境污染問題[12-13]，生長速度快、周期短、成本低，在工業(yè)上應(yīng)用十分廣泛。發(fā)酵12h后能夠產(chǎn)生紅色色素，24h后能夠產(chǎn)生天然的香蕉、菠蘿等香味，這在其他資料上也有報(bào)道[14]。

菌發(fā)酵液感官特征由芳香成分的種類、含量、感官閾值及各成分間的相互作用所決定。由于芳香物質(zhì)易于揮發(fā)，同時(shí)菌的生長受到各種條件的影響，使得菌發(fā)酵液芳香物質(zhì)的生物合成過程受到不同程度的影響，可導(dǎo)致部分香氣成分難以定性，但是主要的香氣成分是穩(wěn)定的，是能夠測量的。本次測定的菌發(fā)酵液香氣總含量已經(jīng)占總峰值的88.11%，包括酯類、醇類、醛類、萜類、芳香烴類等成分，這些成分都具有濃厚的水果型香味。

通過從發(fā)酵液中提純所得到的酯類混合物所散發(fā)出的香味是天然合成的復(fù)合香味，這是人工化學(xué)合成方法很難合成出來。運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的手段確定菌發(fā)酵液芳香物質(zhì)組分以及含量為下一步在實(shí)踐中應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。該菌株所具有的增香、增色功能，可以應(yīng)用到醬油、醋等調(diào)味品的生產(chǎn)中，同時(shí)可以作為食品添加劑等，應(yīng)用到食品工業(yè)的許多方面，具有潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值。值得注意的是在混合物中有一種化合物含有硫元素，它是否在菌發(fā)酵液中起到重要作用，有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Preliminary Identification and Aroma Component Analysis in an Aroma-producing Strain

LI Feng，MING Yan-hong，LI Yuan-yuan，PAN Yao，CHEN Qi
(Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology, College of Life Sciences, Huaibei Coal Industry Teacher’s College, Huaibei 235000, China)

An aroma-producing strain was isolated and purified from soil samples collected from Dangshan Anhui province in China and prliminarily identified as Geotrichum based on morphological characteristivs. Hs-S-SPME and GC-MS results indicated that major aroma components were esters and alcohols. The esters exhibited the highest content, which were about 32 species and accounted for 73.84%. In addition, the alcohols were 8 species, which were accounted for 12.53%.

fruity aroma-producing strain；growth curve；aroma components；GC-MS

Q93.331

A

1002-6630(2010)09-0219-05

2010-02-03

安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2008A086)

李峰(1970—)，男，副教授，博士，主要從事微生物生理、發(fā)酵和分子遺傳學(xué)研究。E-mail：rx2500@163.com