HWTX-I對運動性骨關(guān)節(jié)損傷大鼠關(guān)節(jié)軟骨中iNOS表達及血清NO含量的影響

容 瑛，黃 鵬，鐘文濤，陶谷陽，楊 華，羅赤苗，陳嘉勤★

（1.湖南師范大學體育學院，湖南 長沙 410012；2.邵陽市中心醫(yī)院，湖南 邵陽 422000）

運動性骨關(guān)節(jié)損傷是一種嚴重危害運動員運動能力和運動壽命的機械磨損性和無菌慢性進行性骨關(guān)節(jié)病。長期從事劇烈運動的運動員，如長跑、舉重、柔道等項目的運動員，骨關(guān)節(jié)經(jīng)常承受過大的壓力，更會加速骨關(guān)節(jié)的磨損，從而導致關(guān)節(jié)損傷，誘發(fā)運動性骨關(guān)節(jié)炎[1]。運動性骨關(guān)節(jié)損傷中，運動員常見的為多發(fā)性軟骨機械磨損,進而導致退行性變以及無菌慢性進行性疾病。它的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，其臨床表現(xiàn)與病理改變與骨關(guān)節(jié)炎非常相似，屬于骨關(guān)節(jié)炎的一種[2]。骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)楹诵?，累及骨質(zhì)，并包括滑膜、關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)其它結(jié)構(gòu)的全方位、多層次、不同程度的慢性炎癥。關(guān)節(jié)的修復(fù)能力較差，一旦損傷即可產(chǎn)生永久性病變，導致關(guān)節(jié)功能性障礙，其治療時間長,恢復(fù)慢,對運動員訓練影響較大,甚至導致運動員中止訓練。慢性運動性骨關(guān)節(jié)損傷是運動醫(yī)學上常見的問題，傳統(tǒng)的治療方法難以取得滿意的效果，是運動醫(yī)學界的一大難題。因此有關(guān)慢性運動性骨關(guān)節(jié)損傷發(fā)生發(fā)展機制及其干預(yù)的研究在運動醫(yī)學領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值和意義。

虎紋蜘蛛毒素-I(HWTX-I)是從我國珍稀蜘蛛虎紋捕鳥蛛（Selenocosmia huwena）粗毒中分離純化的一種天然多肽類神經(jīng)毒素，是一種作用于突觸前膜的N型鈣離子通道阻斷劑[3]。

在前期工作中,我們通過大鼠踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射弗氏佐劑制作大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，模擬急性炎性骨關(guān)節(jié)損傷的病理改變。前期研究結(jié)果表明：HWTX-I對我們復(fù)制的急性骨關(guān)節(jié)損傷模型有明確的抗傷害性效應(yīng)[4]。

本文采用改良的Hulth模型[5]，切斷大鼠前后交叉韌帶后結(jié)合間歇性中低強度運動，建立大鼠運動磨損性慢性骨關(guān)節(jié)病理模型。以布洛芬作為陽性對照，通過各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)改變，及骨關(guān)節(jié)損傷側(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的表達及血清中NO含量的變化，探討HWTX-I對慢性運動性骨關(guān)節(jié)損傷的保護作用機制，為其臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物:健康雄性SD大鼠30只,體重180～250 g,由湖南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心提供。試劑:虎紋蜘蛛毒素-I(HWTX-I)湖南師范大學生命科學學院蛋白質(zhì)化學與分子生物學實驗室分離純化,深圳科興生物制品公司加工制備；布洛芬緩釋片為惠州大亞制藥有限公司生產(chǎn)；誘導型一氧化氮合成酶免疫組化全套試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；一氧化氮試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 分組

健康雄性SD大鼠30只,隨機分成3組:非用藥組、HWTX-I用藥組和布洛芬用藥組。每組10只,各組分籠飼養(yǎng),自由飲食,室溫(22±3)℃,相對濕度55%～75%。

1.3 建模

1.3.1 構(gòu)建大鼠運動性關(guān)節(jié)損傷模型

建立大鼠運動性關(guān)節(jié)損傷模型:SD大鼠用10 %水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 mL/100 g體重)。待大鼠麻醉后,取髕內(nèi)側(cè)切口,切斷內(nèi)側(cè)副韌帶,打開膝關(guān)節(jié)腔,用眼科剪剪斷前后交叉韌帶,術(shù)中不損傷關(guān)節(jié)軟骨面,徹底止血,逐層縫合，術(shù)后均肌注青霉素鈉2 0萬單位以防感染。術(shù)后7天，待大鼠傷口愈合后，每組采用動物實驗跑臺模擬運動員受傷后運動訓練。第一周為熟悉跑臺和適應(yīng)運動負荷階段，運動強度逐漸增加（跑臺速度由10m/min逐漸增加到16 m/min）；從第二周開始進行正式訓練，每次訓練保持16 m/min不變，運動時間為30min。每周訓練6天，休息1天，連續(xù)訓練2周。各組大鼠再放養(yǎng)2周，于術(shù)后第42天取材。運動時采用毛刷刺激大鼠尾部，必要時采用聲音刺激或電刺激，以保證運動強度與運動量。

1.3.2 大鼠硬脊外腔置管

采用Yaksh TL,Rudy TA等的蛛網(wǎng)膜下腔置管術(shù)[6]，經(jīng)適當改進應(yīng)用于本研究。SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 mL/100 g體重)。待大鼠麻醉后,用手指尋找胸椎最突出的棘突T8,以此為中心,逐層切開皮膚、肌肉，向下找到T9與T10之間的椎間隙。向硬膜外腔插入PE管,進管深度約2 cm,外端約留5 cm長,埋管,縫合切口。術(shù)后注射20萬u青霉素鈉消炎。實驗后大鼠放回飼養(yǎng)籠中,讓其自然蘇醒,同時用紅外取暖器給大鼠取暖。自由進食、飲水,室溫26℃過夜,手術(shù)后穩(wěn)定飼養(yǎng)7天,只有那些沒有運動功能障礙的動物才能進行以下實驗。

1.4 給藥

HWTX-I用藥組，硬脊膜外腔按60μg/kg注射HWTX-I;非用藥組按 60μg/kg計算等體積的0.9%生理鹽水注入大鼠硬脊膜外腔;布洛芬用藥組以10%的乙醇溶解布洛芬緩釋片后，按照12mg/kg的劑量給大鼠灌胃。通過上述方式從第三周開始給藥，連續(xù)給藥一周，第二周間隔給藥。

1.5 切片標本制備及組織形態(tài)學觀察

術(shù)后第42天,各組斷頸處死,取下右膝關(guān)節(jié),標本立即在新鮮配制4%多聚甲醛中固定過夜。用0.2mol/L的磷酸緩沖液沖洗后,放入10%EDTA脫鈣10天 ；常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋。組織連續(xù)切片，厚度為5μm，HE染色,光鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學法測定iNOS

石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育10min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次；熱修復(fù)抗原，冷卻后0.1 M PBS洗2次；滴加5%BSA封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體，不洗；滴加1：100稀釋的一抗iNOS,室溫60min,0.1M PBS洗2min×3次；滴加生物素化山羊抗兔1gG,室溫20min,0.1 M PBS洗2min×3次;滴加試劑SABC,室溫20min,0.1 M PBS洗5min×4次;DAB顯色,室溫顯色10min,蒸餾水沖洗;蘇木素輕度復(fù)染;脫水,透明,封片。

1.7 結(jié)果檢測與統(tǒng)計學處理

用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)對膝關(guān)節(jié)軟骨組織中出現(xiàn)的棕褐色陽性產(chǎn)物的灰度和面積進行分析,具體步驟為:每張切片在×200倍鏡下選取不相重疊的3個代表性視野,測量陽性反應(yīng)產(chǎn)物的面積和灰度值以及所選區(qū)域的平均灰度值。陽性產(chǎn)物的表達用陽性單位表示,公式為:

1.8 血清中NO含量的測定

大鼠用10%的水合氯醛麻醉 (0.4 mL/100g體重),使用已滅菌的鑷子以摘眼球的方式取血,收集血液于10mL離心管中,4℃,6 000 r/min離心10 min,小心吸取上層血清,500μL每離心管分裝并冷凍保存。血清中NO檢測采用分光光度法,操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析檢驗。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，P＜0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學意義,P＜0.01為差異具有非常顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果形態(tài)學觀察

非用藥組膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)關(guān)節(jié)裂隙，組織結(jié)構(gòu)破壞，潮線消失，軟骨細胞排列紊亂，膠原纖維斷裂，關(guān)節(jié)腔內(nèi)纖維素樣滲出；布洛芬用藥組膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，組織結(jié)構(gòu)接近正常，軟骨細胞排列不齊，可見軟骨細胞固縮；HWTX-I用藥組膝關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑，潮線整齊，軟骨細胞排列一致，可見少許軟骨細胞固縮。具體見圖1。

2.2 各組大鼠iNOS膝關(guān)節(jié)軟骨免疫組織化學染色結(jié)果

2.2.1 iNOS蛋白表達結(jié)果

非用藥組膝關(guān)節(jié)軟骨可見陽性細胞表達率高且染色深；布洛芬用藥組次之;HWTX-I用藥組膝關(guān)節(jié)軟骨可見陽性細胞表達,但其分布明顯較非用藥組、布洛芬用藥組分布稀疏，且染色較淺；正常SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨幾乎未見陽性細胞表達。具體見圖2。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果(×200)

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨iNOS免疫組織化學染色結(jié)果(×200)

2.2.2 計算機顯微圖像分析結(jié)果

iNOS陽性單位的表達值以非用藥組最高，布洛芬用藥組次之，HWTX-I用藥組最低。其中布洛芬用藥組與非用藥組比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）、HWTX-I用藥組與非用藥組比較差異均具有非常顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HWTX-I用藥組與布洛芬用藥組比較具有非常顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。具體見表1。

表1 各組大鼠iNOS軟骨免疫組織化學蛋白表達分析結(jié)果(陽性單位)（mean±S）

2.3 各組大鼠血清中NO含量比較

血清中NO的含量以非用藥組最高，布洛芬用藥組次之，HWTX-I用藥組最低。其中HWTX-I用藥組、布洛芬用藥組與非用藥組比較差異均具有非常顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HWTX-I用藥組與布洛芬用藥組比較具有非常顯著統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）。具體見表2。

表2 各組大鼠血清NO含量（mean±S）

3 討論

運動常導致關(guān)節(jié)損傷，運動員因長期專業(yè)體育訓練，常負重的關(guān)節(jié)發(fā)生不同程度的損傷及韌帶撕裂傷[8]。另外運動員在專項運動中由于技術(shù)動作完成部位相對固定，關(guān)節(jié)軟骨受到長期機械磨損及其表面受到反復(fù)的輕微撞擊,由于韌帶的斷裂使關(guān)節(jié)不穩(wěn)，負荷傳導紊亂可致軟骨損傷退變[9]。目前全面系統(tǒng)探討運動性骨關(guān)節(jié)損傷發(fā)生發(fā)展的可能分子機制鮮有報道，確定HWTX-I對急、慢性運動性骨關(guān)節(jié)損傷的抗傷害作用的有效性和可能分子機制，為運動性骨關(guān)節(jié)損傷新的臨床診斷和治療手段提供理論和實驗依據(jù)尤為重要。

一個理想的運動性骨關(guān)節(jié)損傷動物模型是實驗研究能否取得順利進展的決定性因素之一，而硬脊膜外腔用藥是目前臨床鎮(zhèn)痛及神經(jīng)保護類藥物的常用施藥途徑。我們采用通過切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶結(jié)合運動訓練制作大鼠慢性骨關(guān)節(jié)損傷結(jié)合硬脊外腔置管術(shù)，構(gòu)建了重復(fù)性好的大鼠運動性骨關(guān)節(jié)損傷模型。并應(yīng)用此模型觀察虎紋蜘蛛毒素(HWTX-I)的抗傷害保護作用研究。經(jīng)近百例大鼠動物實驗證明，這是一種能產(chǎn)生較為典型的運動性骨關(guān)節(jié)炎性病變，置管定位準確的大鼠運動性骨關(guān)節(jié)損傷模型。

近年來，一氧化氮作為一種關(guān)節(jié)軟骨損傷和基質(zhì)合成抑制介質(zhì)，在骨關(guān)節(jié)損傷的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制越來越受到大家的重視。NO是一種生理和病理生理介質(zhì),由精氨酸中的胍基氮與分子氧經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)催化生成。NOS包括神經(jīng)元型一氧化氮合酶 (nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)。其中eNOS和nNOS稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS),活性為Ca2+/鈣調(diào)蛋白 (CaM)依賴性,受細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)；與cNOS相反，iNOS為Ca2+非依賴性，其激活不需要胞內(nèi)Ca2+濃度升高。在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜和軟骨組織中發(fā)現(xiàn)顯著表達的iNOS導致血清及關(guān)節(jié)液中NO含量增高[10]。而在動物實驗中用iNOS抑制劑S-甲基異硫脲（SMT）能抑制過量NO的釋放，改善軟骨代謝環(huán)境，對軟骨有一定的保護作用。

我們從實驗中觀察到，正常的SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨中沒有iNOS的存在，與Amin的發(fā)現(xiàn)一致[11]；HWTX-I用藥組、布洛芬用藥組與非用藥組相比可明顯抑制iNOS的表達，降低血清中NO含量；但HWTX-I用藥組比布洛芬用藥組對iNOS的表達抑制作用更為明顯，血清中NO含量更低，說明HWTX-I能更好的保護骨關(guān)節(jié)軟骨。布洛芬是臨床上常用的一種鈣離子通道拮抗劑,為非甾體類解熱鎮(zhèn)痛消炎藥,布洛芬作為臨床常用的消炎鎮(zhèn)痛藥,其藥效強勁,但同時會引起過敏、下肢水腫、口腔皰疹、肝炎、溶血性貧血等副作用,長期服用甚至會造成腎功能衰竭[12]。HWTX-I是一種作用于突觸前膜的N型鈣離子通道阻斷劑，經(jīng)動物的多種疼痛模型證明其有明顯的鎮(zhèn)痛作用[13]。CCI大鼠脊髓和受損坐骨神經(jīng)iNOS表達增加,鞘內(nèi)注射N型Ca2+通道阻滯劑芋螺毒素SO3可降低CCI大鼠上述部位iNOS表達。說明N型Ca2+通道阻滯劑對降低iNOS的表達有一定作用，與本實驗結(jié)果相一致。N型鈣通道阻滯劑為何能抑制非Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性iNOS的表達呢？

研究表明，糖皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）等抑制iNOS的表達。一般iNOS正常情況下是不表達的,當關(guān)節(jié)出現(xiàn)缺損或炎癥時，各種細胞因子如白介素1β、γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和細菌脂多糖均能增加iNOS的表達，使NO水平升高,進而升高基質(zhì)膠原酶、金屬蛋白酶活性，增加軟骨損害?？梢酝茰y發(fā)病早期，受損裸露的軟骨細胞在周圍細胞因子的作用下誘發(fā)iNOS蛋白表達，從而導致NO大量釋放，NO又進一步促進炎性細胞因子釋放。而前期實驗我們發(fā)現(xiàn)HWTX-I硬脊膜下腔用藥可下調(diào)炎性關(guān)節(jié)炎血清中TNF-α濃度,并上調(diào)IL-4、IL-10的濃度，能對炎性關(guān)節(jié)炎病程進展起到緩解和抑制作用[4]。下調(diào)的TNF-α濃度和上調(diào)的IL-4、IL-10的濃度均可抑制iNOS的表達。提示HWTX-I不是直接調(diào)節(jié)Ca2+濃度,而是由鈣通道阻滯劑其可能具有的抗炎機制起作用。其通過抑制前炎性細胞介質(zhì)的釋放,并避免質(zhì)膜和細胞內(nèi)相關(guān)酶的激活;通過抑制Ca2+內(nèi)流保持細胞膜的完整性,保護組織避免損傷、發(fā)炎來降低iNOS的表達，減少關(guān)節(jié)內(nèi)NO的釋放量，保護骨關(guān)節(jié)軟骨延緩關(guān)節(jié)進行性退變。

綜上所述，HWTX-I硬脊膜下腔用藥可抑制膝關(guān)節(jié)軟骨iNOS的表達，降低血清中NO的含量，其效果相對于臨床上常用的鈣通道拮抗劑布洛芬更明顯,能對關(guān)節(jié)軟骨起到保護作用。本研究探討了HWTX-I在運動性骨關(guān)節(jié)損傷中的保護作用機制,也顯示出HWTX-I在運動性骨關(guān)節(jié)損傷的臨床應(yīng)用的潛在前景。但其對運動性骨關(guān)節(jié)損傷的抗傷害保護作用機制，尚需進一步深入研究。

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