青蒿琥酯對人胚肺成纖維細胞系HFL-I細胞膠原合成的影響及機制

王昌明,張孝飛＊,呂 倩,黃嵐珍,范才文

(1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001;2桂林醫(yī)學院科學實驗中心)

肺纖維化是多種病因引起的一種慢性炎性間質(zhì)性肺部病變,多數(shù)患者在發(fā)病 3～8 a后死亡,目前尚無有效治療方法。肺成纖維細胞的過度增生和膠原分泌在肺纖維化形成過程中扮演重要角色。近年研究發(fā)現(xiàn),青蒿素類藥物除治療瘧疾外,亦具有抗腫瘤及抗纖維化等作用[1,2]。我們前期研究了青蒿琥酯對人胚肺成纖維細胞(HELF)系HFL-I細胞增殖、凋亡的影響及機制[3]。2009年 6～9月,我們觀察了青蒿琥酯對體外培養(yǎng)的HFL-I細胞膠原合成的影響,旨在進一步探討其對肺纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HFL-I細胞株(中科院細胞庫),青蒿琥酯(純度 ＞99%,廣西桂林南藥公司),碘化丙啶(PI,上海浩然生物技術(shù)有限公司),CCK-8、0.1%天狼腥紅苦味酸染液、胰酶(Sigma公司),D-MEM/F-12培養(yǎng)基,胎牛血清。RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit及PCR試劑盒Prem ix PrimeSTAR HS,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含體積分數(shù)10%的胎牛血清、1 ×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的D-MEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng), 3 d換液 1次,每 5～6 d傳代 1次;傳 4代以上用于下列實驗。

1.3 青蒿琥酯處理及HFL-I細胞膠原檢測 取對數(shù)生長期HFL-I細胞,用D-MEM/F-12培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為 1×105/m l,接種至 96孔培養(yǎng)板,每孔200μl,37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后隨機分為觀察 1～3組及對照組,前三組分別加入質(zhì)量濃度為1、10、100 mg/L的青蒿琥酯,對照組加等體積的培養(yǎng)液,每組設(shè) 4個復孔。分別培養(yǎng) 48 h后吸去培養(yǎng)液,每孔加甲醇100μl,-20℃固定過夜,PBS洗1次,天狼猩紅室染1 h,0.1%醋酸洗3次,每孔加入0.1μmol/L氫氧化鈉20μl,室溫振蕩1 h,于倒置顯微下攝像,于酶標儀 540 nm處檢測各孔吸光度A值,實驗重復3次取其均數(shù)。

1.4 青蒿琥酯處理及Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白 mRNA表達測定 HFL-I細胞種于6 cm板,細胞貼壁并長至80%峰度后同上分組及處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用Trizol試劑提取高質(zhì)量的mRNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。Ⅰ型、Ⅲ型前膠原及內(nèi)參β-actin擴增產(chǎn)物長度分別為159、447、300 bp。PCR反應條件：預變性：94℃3min,變性：94℃30 s,退火：61～65℃30 s,延伸：72℃45 s,循環(huán)擴增：30個循環(huán)。半定量RT-PCR法測定Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA水平,以目的基因/內(nèi)參β-actin值表示, PCR實驗重復 3次。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示,采用方差分析及t檢驗,P≤0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

各組HFL-I細胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達結(jié)果見表1。由表1可見,HFL-I細胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達均呈劑量依賴性關(guān)系,隨著青蒿琥酯濃度的增加,三指標表達均呈降低趨勢。

表1 各組HFL-I細胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(±s)

表1 各組HFL-I細胞膠原、Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達(±s)

注：與對照組比較,＊P＜0.05,△P均＜0.01;與觀察 2組比較, #P＜0.05;與觀察 1組比較,○P＜0.05

組別 HFL-I細胞膠原(A值)Ⅰ型前膠原蛋白mRNAⅢ型前膠原蛋白mRNA觀察1組 0.608±0.040＊#0.565±0.030△#0.123±0.010△#觀察2組 0.589±0.020＊ 0.448±0.020△ 0.070±0.010△觀察3組 0.412±0.050△#○0.188±0.030△#○0.031±0.000△#○對照組 0.619±0.050 0.882±0.040 0.295±0.020

3 討論

肺纖維化是多種肺疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化。其集中表現(xiàn)為成纖維細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)的過度沉積,在肺部,細胞外基質(zhì)的主要成分之一膠原即來自于活化的成纖維細胞。由于纖維細胞的異常增殖及膠原的過度分泌在肺纖維化過程中起重要作用[4],故抑制膠原過度分泌是防治肺纖維化的有效手段。

前膠原是成熟膠原的前體分子,其水平可反映膠原的生物合成活性。侯杰等[5]報道,Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與降解失衡在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中起主要作用,在肺泡炎階段或肺纖維化早期主要以Ⅲ型膠原增加為主,此期病變尚可逆轉(zhuǎn),隨后病變轉(zhuǎn)為慢性,則以Ⅰ型膠原沉積為主,形成不可逆轉(zhuǎn)的改變。本研究顯示,青蒿琥酯處理后,人胚肺成纖維細胞膠原表達量降低,Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白mRNA表達減少,即Ⅰ、Ⅲ型前膠原表達活性降低,人胚肺成纖維細胞膠原蛋白合成能力下降,導致成纖維細胞分泌膠原蛋白量明顯減少,與文獻[6,7]報道一致。

綜上所述,青蒿琥酯具有抗纖維化作用,可在一定程度上降低膠原的分泌,其機制可能為下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達。

[1]張佳麗,王增,莊蓓蓓,等.二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)氧化酶 2抑制劑抗S180肉瘤作用機制研究[J].中國藥理學通報,2009,25(3)：308-312.

[2]許光蘭,梁勁松,以敏,等.轉(zhuǎn)化生長因子 β1在博萊霉素誘導肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中的表達及青蒿琥酯的干預作用 [J].廣西醫(yī)學,2008,30(8)：1119-1121.

[3]青蒿琥酯對人胚肺成纖維細胞系 HFL-I細胞增殖、凋亡的影響及機制[J].山東醫(yī)藥,2010,50(3)：33-35.

[4]趙洪文.肺成纖維細胞在肺纖維化中的作用[J].國外醫(yī)學：呼吸系統(tǒng)分冊,1996,16(3)：116-117.

[5]侯杰,戴令娟.川芎嗪、丹參治療大鼠肺纖維化對Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1999,22(1)：43-44.

[6]余欣,歐陽五慶,張黎,等.玉米幼芽提取物對小鼠皮膚成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原表達的影響[J].西北農(nóng)林科技大學學報, 2007,35(7)：15-18.

[7]馬捷,陳麗華,廖榮,等.蒿甲醚、雙氫青蒿素對小鼠硬皮病模型的影響[J].中國中藥雜志,2009,34(2)：207.