苯并［a］芘對小鼠肝臟和腎臟中丙二醛和過氧化氫酶的影響

胡夢林，石 勇，金明華，劉曉梅，杜海英，劉 穎，孫志偉

（吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021）

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，B（a）P）是第一個被發(fā)現(xiàn)的環(huán)境致癌物，屬多環(huán)芳烴類，致癌性強(qiáng)，可誘發(fā)多種實(shí)驗(yàn)動物發(fā)生腫瘤。流行病學(xué)研究提示B（a）p與人類肺癌的發(fā)生有關(guān)，已被世界衛(wèi)生組織所屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為第二類A組人類致癌物［1］。廣泛的存在于煤焦油、煙囪、燃燒煙草的煙霧和內(nèi)燃機(jī)尾氣及烹飪的油煙和熏炸的食物等。苯并［a］芘為前致癌物，進(jìn)入人體內(nèi)后通過細(xì)胞色素P450類酶氧化成活性氧物質(zhì)［2］，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生自由基、氧化應(yīng)激及干擾細(xì)胞第二信號傳導(dǎo)系統(tǒng)正常運(yùn)行等相關(guān)［3-6］。生物體內(nèi)不僅有自由基產(chǎn)生體系，還有清除自由基的抗氧化系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶是抗氧化系統(tǒng)中的酶促系統(tǒng)的三種重要保護(hù)酶，這些抗氧化酶能清除機(jī)體內(nèi)的活性氧，有利于維持體內(nèi)活性氧產(chǎn)物和淬滅的動態(tài)平衡，

從而抑制脂質(zhì)過氧化的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)以丙二醛（MDA）作為脂質(zhì)過氧化物的指標(biāo)，過氧化氫酶（CAT）作為酶性抗氧化能力的指標(biāo)，通過測定染毒小鼠肝臟和腎臟的丙二醛（MDA）和過氧化氫酶的含量，探討苯并［a］芘對機(jī)體脂質(zhì)過氧化和抗氧化能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

苯并［a］芘，德國Merck公司；考馬斯亮蘭G250，中國民藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；30％過氧化氫，北京化工廠；鉬酸銨，沈陽市試劑一廠；硫代巴比妥酸，上海試劑二廠；1.1.3.3-四乙氧基丙烷，沈陽市試劑一廠；低溫離心機(jī)（MTX-150），日本TOMY；721分光光度計，上海第三分析儀器廠；電熱三用水箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 動物與分組

實(shí)驗(yàn)動物由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的健康ICR雄性小鼠，體重23±2g，按照隨機(jī)分組原則，將小鼠分成4組，分別為玉米油溶劑對照組，5、10、20mg/kgB（a）P組，每組6只小鼠。動物合格證號：SCXK-（吉）2003-0001。

1.3 染毒方法

小鼠在灌胃前后禁食水3h，對照組給予玉米油。3個實(shí)驗(yàn)組分別給以玉米油為溶劑B（a）P5、10、20mg/kg的劑量口腔灌胃給藥，連續(xù)給藥3d后將小鼠斷頭處死，迅速取出肝、腎組織剔除脂肪稱重，然后置于冰浴中，加冰冷的pH7.4的緩沖液于玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿。肝、腎勻漿比均為1：10。在4℃離心，腎10 000r/min，10min。肝3 000r/min，10min。上清液置4℃冰箱備用。

1.4 蛋白含量測定

取上清液用考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量。取10μL上清液加入0.99mL的pH 7.4磷酸鹽緩沖液，加入3mL考馬斯亮蘭溶液，混勻，在波長595nm波長下測定A595nm值。

1.5 TBA比色法檢測MDA［7］

取組織勻漿上清液0.4mL，以同樣體積的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（10μmol/mL四乙基丙烷的甲醇溶液）作空白對照，向上述各管中加入20％的三氯醋酸（TCA）2.5mL，混勻，加入1％TBA 1.0mL混勻，沸水浴30min后流水冷卻至室溫，加入正丁醇4.0mL，振蕩或顛倒混勻數(shù)次。5 000r/min離心10min，吸取上清液于535nm比色，丙二醛的濃度=（f/F）×10nmol/mL，F(xiàn)：由標(biāo)準(zhǔn)液測得的光密度。f：由樣品溶液測得的光密度。10nmol/mL：標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度。

1.6 鉬酸銨比色法測定CAT含量［8］

取樣品各10μL，每一樣品都設(shè)空白管1（B1）和測定管（U）。將基質(zhì)液37℃水浴預(yù)溫5min。于空白管2（B2）：加1.0mL基質(zhì)液，1.0mL鉬酸銨與上清液相同體積的pH 7.4的緩沖液?？瞻坠蹷1加1.0mL基質(zhì)液，1.0mL鉬酸銨與組織的上清液，測定管U：加上清液，1.0mL基質(zhì)液，37℃水浴準(zhǔn)確保溫60s（以秒表計時），立即加入1mL鉬酸銨，搖勻。放置10min后，721分光光度計測定吸光度（λ=405nm；0.5cm比色杯；蒸餾水調(diào)零）。

CAT活性（kU/L）=（AB1-AU）×65×1000×1/（0.2×1000×AB2）式中65：H2O2濃度；分子1000=1升樣品；分母1000=換算為千國際單位kU；0.2：樣品測定時用量

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 B（a）P對小鼠肝臟和腎臟MDA含量的影響

隨著染毒劑量的增加，肝中各劑量染毒組的MDA含量均有所增加其中5mg/kg、10mg/kg劑量組與油劑對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）；腎臟中各劑量染毒組的MDA含量均有所增加，其中10mg/kg劑量組與對照組比較差異有顯著性（P＜0.05）。見表1。

2.2 B（a）P對小鼠肝臟和腎臟CAT含量的影響

隨著染毒劑量的增加，肝臟中各劑量染毒組的CAT的含量在5mg/kg劑量組時有所增加，但在10、20mg/kg劑量組CAT的含量與對照組比較有所降低，腎臟中的CAT含量，各染毒劑量組均高于對照組，但與對照組比較均無顯著性差異（表2）。

表1 苯并（a）芘對小鼠肝臟和腎臟MDA含量的影響Tab.1 The effect of B（a）Pon MDA in the mouse liver and kidney（nmol/mg）（±s）

表1 苯并（a）芘對小鼠肝臟和腎臟MDA含量的影響Tab.1 The effect of B（a）Pon MDA in the mouse liver and kidney（nmol/mg）（±s）

與對照組比較P＜0.05 Note：vs.the nor malk control group

劑量分組Groups 肝臟Liver 腎臟Kidney對照組 Normal control 2.455±1.068 7.127±1.934 5mg/kg 3.915±1.301＊ 7.936±0.536 10mg/kg 4.752±0.935＊ 16.128±1.269＊20mg/kg 3.600±1.002 7.476±0.737

表2 苯并（a）芘對小鼠肝臟和腎臟CAT含量的影響Tab.2 The effect of B（a）P on CAT in the mouse liver and kidney（kU/g）（±s）

表2 苯并（a）芘對小鼠肝臟和腎臟CAT含量的影響Tab.2 The effect of B（a）P on CAT in the mouse liver and kidney（kU/g）（±s）

劑量分組Group 肝臟Liver 腎臟Kidney Normal control 3221.217±1131.760 104.910±33.893 5mg/kg 3355.741±1040.819 112.694±34.381 10mg/kg 2402.689±1242.850 133.296±22.059 20mg/kg 2933.324±743.421 145.072±115.260

3 討論

B（a）P進(jìn)入人體內(nèi)后通過細(xì)胞色素P450類酶氧化成活性氧物質(zhì)，引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生自由基。自由基在發(fā)揮損傷過程中，首先攻擊組織的細(xì)胞膜、線粒體、溶體酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜性結(jié)構(gòu)中的多聚不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)指多價不飽和脂肪酸（PUBA）雙鍵上一系列鏈鎖式自由基反應(yīng)，是機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)而產(chǎn)生的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而形成脂質(zhì)過氧化物，如醛基（丙二醛）、酮基、羥基、羰基、氫過氧基、一氧化氮（NO）或內(nèi)過氧基甚至新的氧自由基等。脂質(zhì)過氧化作用一方面將活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類分解產(chǎn)物，而且通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)，起到放大活性氧的作用，從而導(dǎo)致很多脂類分解產(chǎn)物的形成，這些分解產(chǎn)物中，一些是無害的，另一些則能引起細(xì)胞的代謝與功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中PUFA的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷，因而測定MDA的量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反映細(xì)胞損傷程度［9，10］。

SOD、CAT和GSH-PX是機(jī)體內(nèi)清除自由基的特異酶類，其活性的降低表明機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生的增加。正常機(jī)體存在著一套健全的抗氧化系統(tǒng)，其中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）及過氧化氫酶（CAT）起著重要的作用。它們在體內(nèi)具有清除有害過氧化物，減輕和阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)等作用，從而保護(hù)生物膜功能完整的重要作用。當(dāng)自由基增加到一定程度時，清除自由基的特異酶類如SOD、GSH-PX、CAT等的活性就降低，機(jī)體清除自由基的能力下降，造成自由基在體內(nèi)堆積，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA等增加，最終導(dǎo)致機(jī)體的脂質(zhì)過氧化而致?lián)p傷。

肝臟是多環(huán)芳烴類化學(xué)物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的重要器官，也是受其有害作用的重要靶器官。B（a）P可以引起肝臟腫瘤，并導(dǎo)致細(xì)胞癌基因的突變和抑癌基因的突變以及DNA鏈斷裂損傷等［11-13］。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明：多環(huán)芳烴類化合物經(jīng)代謝活化成含氧自由基產(chǎn)物是致癌和致突變機(jī)制重要的途徑，也是導(dǎo)致機(jī)體肝臟損傷的途徑之一［14］。腎臟是內(nèi)毒素和外來化合物的主要排泄器官，因其血流量大且腎髓質(zhì)有濃縮功能，使腎臟易受很多毒物的影響。MDA是目前公認(rèn)能反映氧自由基產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的間接指標(biāo)，其含量變化不但可以反映氧自由基生成的量及氧化反應(yīng)強(qiáng)烈程度，還可反映其對組織損傷的嚴(yán)重程度。H2O2雖不是自由基，但它屬于活性氧類，有高反應(yīng)性，可促進(jìn)自由基的生成，引發(fā)生物膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的壞死和凋亡［15］。一般情況下，生物體內(nèi)的過氧化氫常被酶系統(tǒng)所清除，如過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨染毒劑量增加小鼠肝臟中MDA的含量增加，其中5mg/kg、10mg/kg劑量組與油劑對照組比較有顯著性差異。腎臟中各劑量染毒組的MDA含量均有所增加。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其生成的增加表明脂質(zhì)過氧化作用的增強(qiáng)。肝、腎組織MDA含量都高于油劑對照組，并且在肝臟組織中二者有顯著性差異（P＜0.05），說明B（a）P對這兩種組織都造成脂質(zhì)過氧化作用，并且在肝臟組織中脂質(zhì)過氧化作用比較明顯.。這可能與肝是哺乳動物體內(nèi)最主要的解毒器官有關(guān)。

隨著染毒劑量增加小鼠肝臟中CAT的含量低劑量增加高劑量減少，考慮機(jī)體對外來化合物的應(yīng)激性代償反應(yīng)，使酶活力升高。但因其本身也可捕捉有機(jī)自由基而引起失代償。因此，在高染毒劑量時作為解毒主要器官的肝內(nèi)的CAT含量減少，抗氧化能力下降。

本研究發(fā)現(xiàn)：一定劑量的苯并［a］芘可引起小鼠的肝、腎脂質(zhì)過氧化損傷，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Winston GW，DiGuilio RT.Prooxidant and antioxidant mechanis ms in aquaticorganis ms［J］.Toxicology，1991，19：137-161.

［2］張寶旭.外源化學(xué)物的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化.見：周宗燦.毒理學(xué)基礎(chǔ)（第2版）［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2000.24-45.

［3］Heidel S M，Mac W illiams PS，Baird WM，et al.Cytochrome P450 1B1 mediates induction of bone marrow cytotoxicity and preleukemia cells in mice treated with 7，12-dimethylbenz［a］anthracene［J］.Cancer Res，2000，60：3454-3460.

［4］Mann KK，Doerre S，SchlezingerJJ，et al.The role ofNF-kappa B as a survival factor in environmental chemical-induced pre-B cell apoptosis［J］.Mol Pharmacol，2001，59：302-309.

［5］Burchiel S，Luster M I.Signaling by environmental polycyclic aromatic hydrocarbons in human lymphocytes［J］.J Toxicol Environ Health，2001，98：2-10.

［6］龐戰(zhàn)軍.周玫.陳璦.自由基醫(yī)學(xué)研究方法［M］.人民衛(wèi)生出版社，2000.6（1）：62-64.

［7］Halliwell B.Chloroplast metabolis m：the structure and function of chloroplasts in green leaf cells［M］.Oxford：Clarendon Press，1984，180-202.

［8］ManjanathaMG，Li EE，F(xiàn)u PP，et al.Rasmutationalprofiles in chemically induced liver tumors from B6C3F1 and CD-1 mice［J］.J Toxicol Environ Health，1996，47：195-208.

［9］Wirnitzer U，Topfer R，Rosenbruch M.Altered p53 expression in early stages of chemically induced rodent hepatocarcinogenesis［J］.Toxicol Pathol，1998，26：636-645.

［10］程魯京.孟澤.鉬酸銨顯色法測定血清過氧化氫酶［J］.臨床醫(yī)學(xué)雜志，1994，12（1）：25-27.

［11］Slater TF.Free radical mechanismsin tissue injury［J］.Biochem，1984，222（1）：1-15.

［12］Vaghef H，W isen AC，Hellman B.Demonstration of benzo（a）pyrene induced DNA damage in mice by alkaline：single cell gel electrophoresis：evidence for strand breaks in liver but not in lymphocytes and bone marrow［J］.Phar macol Toxicol，1996，78（1）：37-43

［13］Lee SK，Lee BM.Oxidation of erythrocyte protein and lipid.and hemolysis in rabbit red blood cells treated with benzo［a］pyrene or adriamycin［J］.J Toxicol Environ Health，1997，51：557-569.

［14］Baek S M.Kwon CH.Kim JH，et al.Differential roles of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in cisplatin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial cells［J］.J Lab Clin Med，2003，142（3）：178-186.

［15］張夢寒，徐幸蓮，周光宏.肌肽對脂質(zhì)的抗氧化作用［J］.食品科學(xué)，2002，23（7）：52-54.