影響山綿羊胚胎移植手術(shù)粘連的因素分析

權(quán)富生,黃 欣,張 涌

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜生殖生理與胚胎工程重點開放實驗室,陜西楊凌712100)

山、綿羊由于個體相對較小,非手術(shù)法收集胚胎和移植效率很低、難度大,相對而言,手術(shù)法回收胚胎和移植胚胎比較容易進(jìn)行,回收效率也高[1]。所以手術(shù)法為目前山、綿羊胚胎回收和移植的主要方法。但是手術(shù)法最大的問題就是術(shù)后母羊的卵巢、輸卵管、子宮以及腸系膜之間等易發(fā)生粘連,影響供、受體母羊的重復(fù)利用和增加胚胎移植的成本。據(jù)研究,山、綿羊胚胎移植中,供體行施一次手術(shù)后總有2%～3%的個體發(fā)生手術(shù)粘連,如果重復(fù)手術(shù),粘連率會急劇增加[2]。解決山、綿羊胚胎移植供體和受體手術(shù)粘連問題,對于提高供體和受體重復(fù)利用率和胚胎移植效率,促進(jìn)胚胎移植技術(shù)的生產(chǎn)實用化推廣和應(yīng)用具有重要意義。

1 影響山、綿羊胚胎移植手術(shù)粘連的原因分析

影響山、綿羊胚胎移植供體和受體手術(shù)后粘連的因素較多。從胚胎移植供體開始處理到收集完胚胎及受體胚胎移植,影響手術(shù)粘連的因素概括起來有以下方面：

1.1 超排反應(yīng)對粘連的影響 影響胚胎移植效率的主要因素是超排效果和移植妊娠率[3-4]。許多胚胎移植技術(shù)人員,往往喜歡選用較大劑量的激素進(jìn)行超排,以追求獲得較好的超排反應(yīng)和收集更多的可利用胚胎,但是一次超排處理卵巢反應(yīng)過于強(qiáng)烈,卵巢體積明顯增大,卵巢表面黃體分布較多,卵巢從腹腔拉出時容易損傷出血,一旦發(fā)生出血,粘連發(fā)生就很難避免。在山、綿羊胚胎移植實踐中,從防止粘連的角度考慮,盡量選用低劑量的促性腺激素進(jìn)行超排。一般山羊供體每次超排平均排卵數(shù)在10～15枚,綿羊平均排卵數(shù)在7～10枚比較合適。據(jù)國內(nèi)山、綿羊超排的資料分析,不同作者和不同單位之間,激素用量差別很大[5-8],合適劑量沒有統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)。盡管山、綿羊超排對促卵泡素(FSH)表現(xiàn)出很大的耐受性,使用范圍比較大。但從供體重復(fù)利用和防止過分超排反應(yīng)來說,用低劑量FSH比較合理。

1.2 胚胎移植手術(shù)操作水平對粘連的影響 胚胎移植手術(shù)操作熟練、規(guī)范,能很快找到卵巢和子宮體,順利牽引出腹腔,沖卵順利,不發(fā)生卵巢、輸卵管損傷以及黃體破裂等情況,一般手術(shù)后發(fā)生粘連的機(jī)會會大大降低。胚胎移植中防止組織出血和損傷是防止粘連的最好方法。當(dāng)腹腔內(nèi)腹膜受到機(jī)械損傷、局部缺血、異物等刺激后,腹膜發(fā)生炎癥反應(yīng),炎癥因子活化,纖維蛋白滲出。如果纖維蛋白溶解作用受到抑制,纖維蛋白沉積至纖維組織增生,粘連就形成[9]。所以手術(shù)中應(yīng)細(xì)致操作,嚴(yán)格遵守手術(shù)操作規(guī)范,減少手術(shù)時間,防止組織創(chuàng)傷,保證組織良好血供,防止異物介入,使用無滑石粉的手套,術(shù)后反復(fù)沖洗,嚴(yán)密縫合組織,嚴(yán)格止血,避免組織結(jié)扎過多或縫合過密等[9]。在胚胎移植工作中培養(yǎng)和培訓(xùn)專門的技術(shù)人才,規(guī)范胚胎移植實施機(jī)構(gòu)管理,嚴(yán)格訓(xùn)練,培養(yǎng)良好的操作習(xí)慣對于提高胚胎移植總體效率及防止供體粘連損傷具有重要作用。

1.3 胚胎回收方法對粘連的影響 從理論上說,非手術(shù)法回收胚胎時母畜生殖器官損傷最小,但是山、綿羊非手術(shù)法回收胚胎和移植胚胎技術(shù)方法還很不成熟,也無專門的商業(yè)化配套器械,所以手術(shù)法目前仍然為山、綿羊超排后胚胎回收的主要技術(shù)方法[1]。根據(jù)收集胚胎的時間和采卵部位分為輸卵管法和子宮角法。從操作損傷來看,輸卵管法因為要接觸輸卵管傘,容易引起傘部與卵巢粘連,另外輸卵管法回收胚胎時,如果時間把握不好,在輸卵管沒有收集到胚胎或者收集到少量胚胎,與排卵數(shù)(黃體數(shù))之間差異較大,必須在子宮角和宮管結(jié)合處收集胚胎,增加了輸卵管及子宮角的損傷機(jī)會。采用子宮角回收胚胎,就只進(jìn)行一次,而且隨著沖卵設(shè)備和技術(shù)的改進(jìn),回收胚胎率與輸卵管法基本接近。子宮角法基本不傷及輸卵管傘部,損傷少,粘連機(jī)會就相對減少。子宮角法根據(jù)所用器械和回收胚胎方法的不同分為針回收法和三通管回收法。目前國外普遍采用三通管法,因為這是商業(yè)化開發(fā)的專門沖卵器械,回收率比較高,就是子宮損傷比較大,但是如果操作得當(dāng),子宮損傷處經(jīng)縫合,不會留下后遺癥,如果操作不當(dāng)會造成子宮內(nèi)翻或引起瘺管。在胚胎移植重復(fù)手術(shù)中筆者見過多例這樣的母羊。國內(nèi)近年來,通過自己的自主研究開發(fā),已經(jīng)研制出了比較配套的針回收技術(shù)[10-11]?；厥蔗樋逃新菁y狀的出液口,胚胎回收率很高,一般胚胎回收率可達(dá)95%以上,與三通管回收率無差異。針回收法器械比較簡單,也比較配套。主要由沖卵針和回收針組成,還有腸鉗、阻血鑷等。沖卵針由6～7號針頭改制而成,回收針一般用12號不銹鋼穿刺針改制而成,在回收胚胎時夾子宮體的腸鉗和夾輸卵管部阻血鑷上套有醫(yī)用乳膠管,對輸卵管和子宮體的損傷很小。在操作過程中,腸鉗夾的力量合適,子宮體和輸卵管部不充血,不會引起粘連發(fā)生。筆者在山羊和綿羊胚胎移植中一直采用此方法,回收胚胎率高,粘連率低于三通管法。

采用腹腔內(nèi)窺鏡技術(shù)進(jìn)行胚胎移植手術(shù),因其具有切口小、損傷少、術(shù)后恢復(fù)快、減少腹腔粘連等優(yōu)點[12-14]得到普遍應(yīng)用?？梢杂糜谑中g(shù)前供體排卵情況觀察和受體黃體觀察,也可以用于胚胎回收和移植手術(shù)過程中,不僅可以剔除無效超排供體和不可利用受體,減少不必要的手術(shù),同時也可以減少手術(shù)過程創(chuàng)傷,減少供體和受體羊的粘連比例。但是腹腔內(nèi)窺鏡購置設(shè)備需要較多資金,操作也不容易掌握,需要反復(fù)實踐,在生產(chǎn)推廣應(yīng)用中受到一定的限制。

1.4 重復(fù)超排處理和胚胎回收對粘連的影響 從國內(nèi)外山、綿羊重復(fù)超排和重復(fù)回收胚胎研究可以看出,往往前兩次手術(shù)供體數(shù)量較多,在第3次、第4到第5次,可用供體數(shù)明顯減少。Bari F等研究了綿羊超排反應(yīng)和胚胎回收率重復(fù)能力問題,從第1次超排到第4次超排,有效排卵母羊數(shù)分別為222只、73只,26只和7只,回收胚胎母羊分別為224只、74只、23只和7只[2]。國內(nèi)王建國等報道了白絨山羊重復(fù)超排和手術(shù),連續(xù)4年4次超排,有效供體數(shù)分別為91只、43只、7只和 2只[15]。這些超排母羊數(shù)和回收胚胎母羊數(shù)減少的主要原因是由于粘連問題,將不能用于沖胚的母羊進(jìn)行了剔除。在胚胎移植實踐中,重復(fù)超排次數(shù)越多,粘連羊的比例越高,導(dǎo)致最后可超排母羊數(shù)量很少。筆者在重復(fù)超排中也遇到類似情況,每次重復(fù)超排對于上次嚴(yán)重粘連供體予以淘汰,只處理認(rèn)為可以重復(fù)回收胚胎的供體。因為輸卵管、卵巢、子宮、腸系膜粘連羊,收集胚胎時往往要進(jìn)行微手術(shù)分離,每次分離會造成更加嚴(yán)重的粘連,在以后超排中就不能使用。在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn),如果重復(fù)超排時間間隔在一年以上,重復(fù)超排反應(yīng)不會減弱,母羊排卵數(shù)也不會減少,而且母羊妊娠可以使已經(jīng)發(fā)生粘連的子宮體與腸系膜之間的位置復(fù)位,有利于卵巢和子宮體等器官的恢復(fù)。但是?？梢砸姷?由于粘連問題,引起回收胚胎中未受精卵的比例增加,甚至超排反應(yīng)很好,由于粘連嚴(yán)重卻不得不放棄沖卵。重復(fù)多次超排和手術(shù),明顯可以增加供體母羊卵巢、輸卵管、子宮體之間及與腹腔的粘連比例。

1.5 術(shù)后輸卵管、卵巢、子宮體及腹腔處理對粘連的影響 山、綿羊胚胎移植術(shù)后輸卵管、卵巢、子宮及腹腔處理這是非常重要的一個環(huán)節(jié),也是目前胚胎移植中防止腹腔粘連的主要關(guān)鍵技術(shù)問題。目前在山、綿羊胚胎移植技術(shù)方面進(jìn)行預(yù)防粘連的方法主要是用生理鹽水沖洗腹腔并灌注生理鹽水,涂抹石蠟油[18]及用抗生素處理創(chuàng)口防止感染引起粘連。在山、綿羊胚胎移植技術(shù)中應(yīng)該積極借鑒和吸收人醫(yī)防止腹腔手術(shù)粘連的技術(shù)成果[16-17]。何剛等[19]應(yīng)用幾丁糖防治大鼠腹腔粘連,證實幾丁糖能抑制Ⅰ型膠原基因的表達(dá),減少Ⅰ型膠原的合成,從而減輕粘連的程度。楊偉明等進(jìn)行試驗表明,右旋糖酐具有預(yù)防術(shù)后腸粘連的作用[20]。筆者所在實驗室將人醫(yī)用丁殼質(zhì)糖應(yīng)用于山羊胚胎移植中,進(jìn)行預(yù)防粘連的研究,表明可以大大減少山羊胚胎移植手術(shù)后粘連率及明顯提高供體的重復(fù)利用率。

1.6 其他因素對粘連的影響 供、受體母羊手術(shù)前的饑餓空腹、術(shù)后母羊精心護(hù)理、嚴(yán)格消毒,防止腹腔內(nèi)外感染等也是不可忽視的因素。

2 小結(jié)

在超數(shù)排卵處理過程中,使用較低劑量的、比較合理的FSH用量;注意手術(shù)的規(guī)范化操作,不斷提高技術(shù)熟練水平;采用損傷較小的子宮角法收集胚胎和移植胚胎;使用有效的腹腔防粘連技術(shù),包括使用防粘連劑;注意母羊手術(shù)前饑餓空腹;防止手術(shù)后腹腔內(nèi)外的感染等。通過綜合性預(yù)防措施和手段,可以有效避免山、綿羊胚胎移植術(shù)后的粘連發(fā)生及有效提高供體和受體母羊的利用率,提高胚胎移植效率。

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