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    Hirsutanols A通過增加活性氧選擇性誘導(dǎo)多西他賽耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PC14/TXT凋亡

    2010-02-10 08:34:52吳克偉劉俊齡馮公侃李厚金朱孝峰
    關(guān)鍵詞:倍半萜細(xì)胞株耐藥

    吳克偉,楊 芬,3,劉俊齡,馮公侃,李厚金,朱孝峰

    (中山大學(xué)腫瘤防治中心1.華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.腫瘤內(nèi)科,廣東廣州 510060; 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 510405;4.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所,廣東廣州 510275)

    近半個(gè)世紀(jì)以來,肺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增加,20世紀(jì)末肺癌已占惡性腫瘤死亡的首位。由于肺癌的初期癥狀不明顯,大部分肺癌患者在確診肺癌時(shí)多屬中晚期,因此化療是最主要的治療手段。多西他賽為紫杉類藥物,通過促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管,同時(shí)通過防止去多聚化過程而使微管穩(wěn)定,阻滯細(xì)胞于G2和M期,從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和增殖,發(fā)揮其抗腫瘤的作用,已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的一、二線治療[1]。然而同其它化療藥物一樣,藥物治療后誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥限制了其臨床應(yīng)用?;钚匝?reactive oxygen species ROS)是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱。ROS作為第二信使,在細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)中起著重要作用,近期研究表明ROS及氧化應(yīng)激也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)過量的ROS則被認(rèn)為是一類損傷細(xì)胞的毒性物質(zhì),可以氧化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。Hirsutanols A是從南海珊瑚Sarcophyton tortuosum內(nèi)生菌中分離得到的一個(gè)倍半萜類化合物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)式[3]見Fig 1。本研究旨在研究Hirsutanols A對(duì)多西他賽敏感及耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的影響,及ROS在其中的作用。

    Fig 1 The chemcial structure of Hirsutanols A

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 培養(yǎng)基 RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。

    1.1.2 藥物 多西他賽(docetaxel批號(hào):0906281 2)和依托泊苷(VP-16批號(hào):09043031)購(gòu)自江蘇恒瑞;紫杉醇(palitaxol批號(hào):8F40509)購(gòu)自Bristol-Myers Squibb;阿霉素(ADM批號(hào):0602E1)和長(zhǎng)春新堿(VCR批號(hào):1002V1)購(gòu)自深圳萬樂。Hirsutanols A (中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所提取純化)原藥以DMSO溶解,配成100 mmol·L-1貯存液,分裝后-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.3 其他試劑 二甲基亞楓(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCF-DA)、Dihydroethidium(DHE)和 N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cystein NAC)購(gòu)自Sigma公司;細(xì)胞裂解液購(gòu)自Upstate生物技術(shù)公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司;化學(xué)發(fā)光劑(ECL)購(gòu)自Cell Signal公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 Calbiochem公司 Caspase-3、PARP、GAPDH及抗兔和抗鼠的二抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

    1.1.4 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C14及其多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT由日本國(guó)立癌癥中心小泉史明博士惠贈(zèng),用含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)于37℃,5% CO2條件下培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.1.5 試驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,德國(guó)Heraeus公司;紫外分光光度計(jì)(Beckman DU640)、流式細(xì)胞儀(Beckman-Coultet FC500),Beckman公司產(chǎn)品等。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用常規(guī)MTT法[4]測(cè)定腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(每孔6 000個(gè)細(xì)胞),37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)過夜,次日加入不同濃度的藥物,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μl MTT液(5 g·L-1),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液加入100 μl DMSO,待結(jié)晶溶解后在酶聯(lián)檢測(cè)儀上檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下每孔的OD值,按下列公式求出細(xì)胞存活率及生長(zhǎng)抑制率:細(xì)胞存活率/%=(用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD)×100%;生長(zhǎng)抑制率/%=(1-用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%,按BLISS法計(jì)算機(jī)程序求出半數(shù)抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,稀釋接種于6孔板中培養(yǎng),藥物處理后收集細(xì)胞。按Calbiochem公司Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作,往細(xì)胞懸液中加入Media binding reagent及Annexin V-FITC,混勻后室溫避光孵育15 min。1 000×g離心5 min,棄上清,用冷1× Binding buffer重懸細(xì)胞后加入碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    1.2.3 Western blot檢測(cè)Caspase-3和PARP蛋白表達(dá) 分別收集對(duì)照組和Hirsutanols A處理24和48 h組的 PC14/TXT細(xì)胞,裂解后蛋白定量并用于Western blot檢測(cè)。首先行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)膜,封閉后分別Caspase-3抗體(1∶1 000)、PARP抗體(1∶ 500)及GAPDH抗體(1∶2 000)室溫孵育2 h,再與二抗室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光法發(fā)光曝片。

    1.2.4 ROS檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,稀釋接種于6孔板中培養(yǎng),細(xì)胞未經(jīng)藥物處理或藥物處理不同時(shí)間后,用10 μmol·L-1DCF-DA或5 μmol·L-1DHE染料[5]避光孵育30 min,收集細(xì)胞,PBS洗滌2次后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。

    2 結(jié)果

    2.1 PC14和PC14/TXT細(xì)胞的藥物敏感性MTT結(jié)果顯示,與PC14細(xì)胞相比,PC14/TXT細(xì)胞對(duì)多西他賽、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷及長(zhǎng)春新堿的敏感性降低,耐藥指數(shù)分別為:4.05、2.35、1.74、1.73、1.50(Tab 1)。可見PC14/TXT表現(xiàn)出對(duì)多西他賽較高的耐藥性,并呈多藥耐藥性。

    Tab 1 Drug sensitivity of PC14 and PC14/TXT cells

    2.2 倍半萜類化合物Hirsutanols A對(duì)PC14和PC14/TXT細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度的Hirsutanols A處理PC14及PC14/TXT細(xì)胞72 h或用40 μmol·L-1Hirsutanols A處理PC14及PC14/TXT細(xì)胞24、48和72 h,MTT法檢測(cè)Hirsutanols A對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯示,Hirsutanols A對(duì)PC14/TXT細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性,其 IC50值約為28 μmol·L-1,而對(duì)PC14細(xì)胞的增殖幾乎不顯示抑制活性(Fig 2)。

    2.3 Hirsutanos A誘導(dǎo)PC14/TXT細(xì)胞凋亡 30 μmol·L-1Hirsutanols A處理PC14/TXT細(xì)胞48、72 h后,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高(Fig 3A)。此外,Hirsutanols A還可以活化Caspase-3和PARP(Fig 3B)。

    2.4 Hirsutanols A對(duì)PC14和PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響 使用DCF-DA和DHE熒光染料分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過氧化氫和超氧陰離子的含量。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的過氧化氫和超氧陰離子含量分別是PC14細(xì)胞的3.5倍和1.1倍,可見PC14/TXT細(xì)胞較PC14細(xì)胞有更高的基礎(chǔ)ROS水平,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4A)。用30 μmol·L-1Hirsutanols A處理PC14和PC14/TXT細(xì)胞,PC14和PC14/TXT細(xì)胞中過氧化氫的含量均迅速增加。隨著藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng),PC14細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的含量逐漸降低,在藥物處理4 h已恢復(fù)到基礎(chǔ)水平;而PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)過氧化氫含量則一直維持較高的水平(Fig 4B)。

    2.5 抗氧化劑NAC逆轉(zhuǎn)Hirsutanols A誘導(dǎo)的PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)ROS積累及細(xì)胞凋亡 為研究ROS是否為Hirsutanols A誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因素,我們用1 mmol·L-1自由基清除劑NAC在Hirsutanols A作用之前預(yù)先加入細(xì)胞中。發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理能完全逆轉(zhuǎn)Hirsutanols A誘導(dǎo)地ROS增加(Fig 5A)和增殖抑制(Fig 5B),同時(shí)NAC預(yù)處理也阻斷了Hirsutanols A誘導(dǎo)地細(xì)胞凋亡(Fig 5C)。

    Fig 2 Effect of Hirsutanols A on the PC14 and PC14/TXT cells's proliferation

    3 討論

    近年來,隨著多西他賽等第三代抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用,惡性腫瘤化療的效果有了明顯改善。然而腫瘤耐藥性卻是造成腫瘤化療最終失敗的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥是一個(gè)涉及基因突變、相關(guān)耐藥蛋白及酶類的表達(dá)的復(fù)雜生物學(xué)過程。日本國(guó)立癌癥中心小泉史明利用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C14通過體外逐漸增加多西他賽濃度的方法誘導(dǎo)建立多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT,在隨后耐藥機(jī)制的研究中,研究者[6]發(fā)現(xiàn)這種獲得性多西他賽耐藥與細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白(P-glycoprotein)高表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。P-glycoprotein[7]屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassette transporters)蛋白家族,能夠ATP依賴性地將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外,被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與PC14細(xì)胞相對(duì),PC14/TXT細(xì)胞對(duì)其他作用機(jī)制各異的化療藥物都表現(xiàn)出不同程度的敏感性降低。因此尋找新的治療靶點(diǎn)用于耐藥腫瘤的治療具有重要意義。

    Fig 3 Hirsutanols A induced apoptosis in PC14/TXT cells

    Fig 4 Effects of Hirsutanols A on ROS contents in PC14 and PC14/TXT cells

    Fig 5 NAC reversed the increase of ROS induced by Hirsutanols A and inhibited apoptosis

    倍半萜類化合物是天然產(chǎn)物化學(xué)的重要組成部分。因其在自然界中廣泛分布,數(shù)量龐大,結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多變,倍半萜化合物一直是尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物先導(dǎo)分子,以及其它功能分子的重要源泉,倍半萜化合物的抗腫瘤活性得到廣泛而深入的研究[8]。Hirsutanols A是從南海珊瑚Sarcophyton tortuosum內(nèi)生菌中分離得到的一種倍半萜類化合物,前期研究表明Hirsutanols A的藥理學(xué)活性依賴于其能提高細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),Hirsutanols A對(duì)多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT的增殖有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)較好的劑量/時(shí)間依賴關(guān)系,而對(duì)PC14細(xì)胞的增殖幾乎不顯示抑制活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明Hirsutanols A可以誘導(dǎo)PC14/TXT細(xì)胞發(fā)生凋亡。使用抗氧化劑NAC可以完全抑制Hirsutanols A誘導(dǎo)地增殖抑制及細(xì)胞凋亡,提示ROS在 Hirsutanols A細(xì)胞毒作用中起著關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn)與PC14細(xì)胞相比,多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/ TXT中含有更高基礎(chǔ)水平的ROS含量;用Hirsutanols A處理后,PC14細(xì)胞中的ROS含量迅速增加,在藥物處理后4 h恢復(fù)到基礎(chǔ)水平;而PC14/TXT細(xì)胞在藥物處理后一直維持較高的ROS含量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT由于細(xì)胞代謝或遺傳的改變,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高,細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)如谷胱甘肽等清除一部分ROS為防止其過度增高引起細(xì)胞死亡,可見與PC14細(xì)胞相比,PC14/TXT細(xì)胞消耗了大量的還原性物質(zhì),使細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力降低,因而不能耐受Hirsutanols A誘導(dǎo)地氧化應(yīng)激從而發(fā)生細(xì)胞凋亡。Trachootham等[9]研究發(fā)現(xiàn)PEITC能通過ROS介導(dǎo)的機(jī)制特異性殺死氟達(dá)拉濱耐藥的慢性淋巴性白血病細(xì)胞株,說明ROS有可能成為耐藥腫瘤細(xì)胞治療的潛在靶點(diǎn)。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)倍半萜類化合物Hirsutanols A可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成從而特異性的誘導(dǎo)多西他賽耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C14/ TXT細(xì)胞發(fā)生凋亡。下一步我們將深入研究Hirsutanols A誘導(dǎo)ROS生成的分子機(jī)制,為Hirsutanols A的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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