譚海東,王磊,林金濤,趙宗保
中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部,大連 116023
微生物的 DNA轉(zhuǎn)化方法是基因工程中的重要內(nèi)容,目前對微生物轉(zhuǎn)化主要有化學(xué)法和電轉(zhuǎn)化法[1]。但這些轉(zhuǎn)化方法,仍然存在許多缺點(diǎn),比如感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備時(shí)間長,處理過程容易導(dǎo)致細(xì)胞活性降低,處理后要有溫育等過程。2001年,Yoshida等發(fā)表了一系列關(guān)于使用溫石棉 (Chrysotile asbestos) 實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒對原核生物轉(zhuǎn)化的有趣方法[2-5],這種方法被命名為Yoshida效應(yīng)。但是這種方法仍然有很多缺點(diǎn):操作繁瑣、利用的介質(zhì)對人體致癌等。對該法的可靠性有很多質(zhì)疑,限制了它的應(yīng)用[6],所以這種新穎的DNA轉(zhuǎn)化法很少被其他科學(xué)家引用。
最近,這種方法又進(jìn)一步被Wilharm等改進(jìn)[6]。他們使用的一種價(jià)格便宜、資源豐富、對人類健康友好的礦石納米材料海泡石 (Sepiolite) 作為介質(zhì),實(shí)現(xiàn)了對多種微生物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。作者在本方法中使用的參數(shù)與 Yoshida等報(bào)道的一致,并根據(jù)后者的報(bào)道,提出了借助海泡石進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化的相同機(jī)制。問題是海泡石和溫石棉屬于不同的介質(zhì):前者沒有生物活性,后者有一定的生物活性;前者對人體友好,而后者可以致癌等。因此,我們認(rèn)為這種新的轉(zhuǎn)化方法,可能會存在不同的DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制。Wilharm 等雖然對方法進(jìn)行了改進(jìn),但該工作是以非常短的通訊形式報(bào)道,很多參數(shù)未優(yōu)化。我們認(rèn)為對這種轉(zhuǎn)化機(jī)制的充分理解和對該試驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化,會促進(jìn)這種方法的推廣和實(shí)現(xiàn)對特殊物種的DNA轉(zhuǎn)化。為此,我們進(jìn)行了本研究。
1.1.1 質(zhì)粒和菌種
pET15b質(zhì)粒有本組保存。E. coli DH5α菌株購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。短乳酸桿菌Lactobacillus brevis AS 1.579購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。
1.1.2 試劑
蛋白酶K、250 bp DNA marker購自TaKaRa公司大連分公司。200~300 bp的RNA從短乳酸桿菌AS 1.579提取,在本組保存。海泡石購自德國Kremer Pigmente有限公司 (Kremer Pigmente GmbH & Co. KG,Hauptstr. 41?47DE 88317 Aichstetten,Germany),產(chǎn)品編號 58945。溶菌酶、鹽酸胍、十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)、苯酚和瓊脂糖購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。其他培養(yǎng)基及生化試劑牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉、氯仿和異戊醇等均為分析醇,購自大連博諾生物化學(xué)試劑廠。
1.2.1 海泡石懸浮液和培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
海泡石懸浮液根據(jù)文獻(xiàn)準(zhǔn)備4%儲存液[6]:海泡石121℃滅菌20 min;用去離子水配含200 mmol/L KCl,5 mmol/L HEPES緩沖液,用NaOH調(diào)pH到7.4,過膜除菌。最后配成5% (W/V) 海泡石儲存液。另外配10×海泡石緩沖液 (2 mol/L KCl,50 mmol/L HEPES,7.4) 備用。
LB培養(yǎng)基:在950 mL去離子水中加入胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,搖動容器直至溶解,用NaOH調(diào)pH至7.0,用去離子水定容至1 L。取200 mL,加入3 g瓊脂粉。在120℃滅菌20 min。待溫度降到50℃左右,加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素,準(zhǔn)備40個(gè)抗性平板。
MRS培養(yǎng)基的配制:1 L蒸餾水中溶解下列組分:胰蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母提取物5 g,葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g,檸檬酸三銨2 g,乙酸鈉5 g,吐溫80 1 mL,硫酸鎂 200 mg,硫酸錳50 mg,用高壓鍋在121℃滅菌15 min,調(diào)pH到6.8。其中葡萄糖單獨(dú)滅菌。
1.2.2 海泡石吸附pET15b試驗(yàn)及轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的試驗(yàn)
從于 37℃培養(yǎng) 20 h的新鮮平板中挑取一個(gè)E. coli DH5α單菌落,接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)過夜。將該菌懸液以1∶100的比例接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)3 h至OD600=0.5左右。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置10 min, 然后于4℃下4 000 r/min離心10 min。棄去上清,用預(yù)冷的海泡石緩沖液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞,4℃下4 000 r/min離心10 min。最后用2 mL的海泡石緩沖液懸浮,置于冰上備用。
取40 μL pET15b溶液 (100 ng/μL),加入10 μL的5% (W/V) 海泡石儲存液,充分混合,取5 μL備用。剩余的溶液12 000 r/min離心30 s,用1 mL的海泡石緩沖液連續(xù)洗滌 2次。吸附結(jié)果用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
取備用的細(xì)胞50 μL,加入5 μL質(zhì)粒飽和的海泡石 (海泡石終濃度為0.1%),充分混合。取備用的細(xì)胞50 μL,加入1 μL洗滌后的海泡石 (海泡石終濃度為0.1%),充分混合。將2種懸浮液加到2個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂抹30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。
1.2.3 利用海泡石對pET15b轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的試驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化
海泡石緩沖液對DNA轉(zhuǎn)化率的影響:取備用的細(xì)胞50 μL 2份,1份用LB洗滌細(xì)胞,另外1份仍然保留海泡石緩沖液。分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液,充分混合。將2種懸浮液加到2個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL),立即用玻璃板均勻涂平板30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。
細(xì)胞濃度對DNA轉(zhuǎn)化率的影響:分別取備用的細(xì)胞500 μL、50 μL和5 μL,前者通過離心后用50 μL海泡石緩沖液懸浮,后者加入45 μL海泡石緩沖液懸浮,這樣 3個(gè)樣品的 OD600分別是 200、20和2。分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液,充分混合。將3種懸浮液加到2個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL),立即用玻璃板均勻涂平板30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。
海泡石的濃度對DNA轉(zhuǎn)化率的影響:分別取備用的細(xì)胞50 μL 3份,分別配成海泡石終濃度為1%,0.1%和0.01%的混合液。分別加入10 ng pET15b充分混合。將3種懸浮液加到3個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL),立即用玻璃板均勻涂平板30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。
涂板次數(shù)和預(yù)干處理對DNA轉(zhuǎn)化率的影響:取備用的細(xì)胞50 μL 7份,分別加入10 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液,充分混合。將4份懸浮液加到4個(gè)LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板分別均勻涂抹10次、20次、40次和100次,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。另外3份細(xì)胞,1份立即用玻璃板均勻涂平板30 s,第2份10 min后用玻璃板均勻涂平板30 s,第3份20 min后用玻璃板均勻涂平板30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。
1.2.4 利用海泡石對pET15b直接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α單菌落
取4℃存放1個(gè)月的E. coli DH5α單菌落,加入20 μL海泡石緩沖液,加入100 ng pET15b和1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液,充分混合。將細(xì)胞懸浮液加到LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂平板30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。
1.2.5 短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取
為了獲得短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA,該加入100 μL 5 mol/L NaCl混勻,再加入80 μL的CTAB/NaCl混勻,65 ℃ 10 min。加入固體的鹽酸胍至終濃度6 mol/L[10],待細(xì)胞徹底裂解后,加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液 (25∶24∶1),混勻,12 000 r/min離心5 min,取上清,加0.6倍體積的異丙醇,混勻,室溫放置10 min。12 000 r/min離心10 min。沉淀用 75%的乙醇洗滌,晾干,最后用20 μL TE溶解,取3 μL電泳檢測。
1.2.6 小片段RNA對pET15b轉(zhuǎn)化E. coli DH5α的影響
取1 μL 5% (W/V) 海泡石儲存液,加入5 μL小片段的RNA提取液 (200 ng/μL),充分混合,讓海泡石飽和吸附RNA。加入10 ng pET15b和備用的細(xì)胞50 μL,充分混合。將細(xì)胞懸浮液加到LB氨芐青霉素抗性平板 (100 μg/mL)。立即用玻璃板均勻涂平板30 s,最后放在37℃培養(yǎng)過夜。并與不加小片段RNA的作對照。提取使用不加 RNAase的基因組提取方法,參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[7],并對此方法進(jìn)行優(yōu)化。簡述如下:取單克隆短乳酸桿菌到10 mL MRS培養(yǎng)基中,200 r/min、37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按 1∶50接入 100 mL MRS中,200 r/min、37℃培養(yǎng)至OD600=0.5。10 000 r/min離心30 s,收集沉淀,使用500 mmol/L的EDTA洗滌3次,最后用2 mL的500 mmol/L EDTA懸浮,200 W微波處理1 min[8-9]。10 000 r/min離心30 s收集沉淀,取50 mg菌體用400 μL TE重懸于1.5 mL離心管中,加入終濃度為10 mg/mL溶菌酶,10 mmol/L的DTT,37℃保溫1 h。加入50 μL蛋白酶K (10 mg/mL),混勻,65℃,1 h。
從圖1可以看出,用pET15b飽和后的海泡石,經(jīng)過海泡石緩沖液充分洗滌后的海泡石幾乎檢測不到DNA。此結(jié)果說明海泡石對質(zhì)粒的pET15b吸附能力很弱,幾乎看不到DNA吸附。用pET15b飽和的海泡石轉(zhuǎn)化細(xì)胞,長出的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于洗滌后的海泡石轉(zhuǎn)化數(shù) (圖2,16-17)。這些結(jié)果說明,利用海泡石實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,有可能不是海泡石將DNA帶入宿主內(nèi)的,而是由海泡石在宿主表面產(chǎn)生的瞬間小孔,導(dǎo)致DNA的隨機(jī)進(jìn)入。
圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測海泡石吸附pET15b能力Fig. 1 Analysis of 1% agarose electrophoresis for the ability of sepiolite absorbing pET15b. 1: pET15b; 2: the sepiolite absorbing pET15b saturatedly; 3: the sepiolite saturated with DNA was washed once; 4: the sepiolite saturated with DNA was washed two times.
圖2 海泡石用于E. coli DH5αDNA轉(zhuǎn)化的參數(shù)優(yōu)化Fig. 2 Optimization of DNA transformation for E. coli DH5α based on sepiolite. 1?2: the effect of sepiolite buffer for transformation. 3?5: the cell concentration is OD600=200, 20 and 2 in sample 3, 4 and 5 respectively. 6?8: the percent content of sepiolite is 1%, 0.1% and 0.01% in sample 6, 7 and 8 respectively; 9?12: the circulating times are 10, 20, 40 and 100 in sample 9, 10, 11 and 12 respectively. 13?15: the pre-dry treatment is 0 min, 10 min and 20 min in sample 13, 14 and 15 respectively; 16?17: washing effect for transformation; 18?19: the effect of RNA treatment for transformation.
2.2.1 緩沖液
試驗(yàn)結(jié)果表明,使用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化率略高于使用海泡石緩沖液 (圖2,1~2)。另外海泡石緩沖液配制和過膜除菌的操作繁瑣,利用培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,將使轉(zhuǎn)化變得更加直接。
2.2.2 細(xì)胞濃度
細(xì)胞濃度是決定轉(zhuǎn)化率高低的重要參數(shù),我們研究表明當(dāng)細(xì)胞濃度在OD600=20時(shí)轉(zhuǎn)化率最高 (圖2,3~5)。不同于電轉(zhuǎn),細(xì)胞濃度越高轉(zhuǎn)化率越高。這可能與海泡石物理運(yùn)動空間需要有關(guān),細(xì)胞濃度太高,海泡石纖維不能充分運(yùn)動,限制了質(zhì)粒對細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)化。
2.2.3 海泡石濃度
試驗(yàn)結(jié)果表明使用海泡石的濃度比報(bào)道的高了近10倍,而轉(zhuǎn)化率有5倍以上增加 (圖2,6~8)。我們認(rèn)為使用0.1%的海泡石濃度,而不是0.01%,轉(zhuǎn)化率會更高些。具體原因不很清楚,是否由于不同批次產(chǎn)品之間存在納米纖維材料數(shù)量的差異。
2.2.4 涂平板次數(shù)和狀態(tài)
菌液不經(jīng)預(yù)干處理,直接涂抹平板,隨著涂抹次數(shù)的增加,轉(zhuǎn)化率逐漸增加 (圖2,9~12)。另外,隨著預(yù)干處理時(shí)間的延長,轉(zhuǎn)化率會逐漸降低 (圖2,13~15)。
在 4℃儲存 1個(gè)月的單菌落,利用海泡石仍然可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。取 4℃儲存 1個(gè)月的單菌落,利用海泡石直接轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率低于 100/μg pET15b。但是,該操作大大節(jié)省了時(shí)間,不需要轉(zhuǎn)化前的再培養(yǎng),沒有感受態(tài)制備或超低溫凍存和轉(zhuǎn)化后的溫育等過程。同時(shí)單菌落的直接轉(zhuǎn)化,由于菌量過少,通過鈣轉(zhuǎn)和電轉(zhuǎn)難以實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然,本操作不適用于對轉(zhuǎn)化率要求非常高的實(shí)驗(yàn),但可以在條件非常落后的實(shí)驗(yàn)室中普及。該操作也可用于某些特殊的實(shí)驗(yàn),比如某些致病菌對抗性質(zhì)粒的易感染性等。
為了得到理想化的RNA小片段,采取基因組提取方法得到降解的RNA片段。經(jīng)過該試驗(yàn),可以從短乳酸桿菌得到理想的小片段RNA:濃度較高,大于200 ng/μL;分子量在300 bp左右 (圖3),根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,非常適合用于海泡石上 DNA競爭結(jié)合試驗(yàn)。同時(shí),我們也嘗試了其他微生物的RNA提取,但是得到的RNA總是一條模糊的帶,分子量集中在500 bp和2 kb之間,不符合本試驗(yàn)的需要。對這種結(jié)果的差異,無法從試驗(yàn)過程中得知。
圖3 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測短乳酸桿菌AS1.579小片段RNA的提取Fig. 3 Analysis of 1% agarose for small RNA extraction from Lactobacillus brevis AS1.579. M: marker; 1: small RNA.
經(jīng)小片段RNA飽和的海泡石轉(zhuǎn)化E. coli DH5α,與對照組相比,幾乎沒有什么變化 (圖2,18~19)。同樣說明,利用海泡石實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,有可能不是海泡石帶 DNA進(jìn)入宿主內(nèi),而是由海泡石在宿主表面產(chǎn)生的瞬間小孔,導(dǎo)致外源DNA的隨機(jī)進(jìn)入。
利用海泡石轉(zhuǎn)化有以下優(yōu)點(diǎn):可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒對細(xì)胞的轉(zhuǎn)化;這種介質(zhì)對人體健康友好,無致癌物質(zhì);本身無生物活性,不會對宿主生長產(chǎn)生影響;操作過程中不需特殊的設(shè)備;不需要感受態(tài)的制備就可以得到較高的轉(zhuǎn)化率;另外,資源豐富、價(jià)格便宜,使這種轉(zhuǎn)化方法容易推廣。
但是,關(guān)于基于礦石海泡石納米材料的 DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制仍然不很清楚。Yoshida等利用溫石棉進(jìn)行DNA試驗(yàn),提出競爭機(jī)制,即海泡石溫石棉大量吸附DNA,借助涂平板的機(jī)械摩擦力,纖維絲插入宿主內(nèi)。宿主內(nèi)的RNA與海泡石溫石棉上的DNA競爭,從而實(shí)現(xiàn)外源基因?qū)υ松锏霓D(zhuǎn)化[6,11]。Wilharm等對此方法進(jìn)行了改進(jìn),采用無生物活性,對人環(huán)境友好的海泡石進(jìn)行了DNA轉(zhuǎn)化。但他們提出的轉(zhuǎn)化機(jī)制仍然與 Yoshida等報(bào)道的相同。而我們試驗(yàn)表明海泡石吸附DNA的能力不是很強(qiáng),洗滌后,轉(zhuǎn)化率大大降低。而用RNA飽和后的海泡石,轉(zhuǎn)化率幾乎沒有降低,這些結(jié)果說明,海泡石的作用是借助一種瞬間機(jī)械力,在細(xì)胞膜上擊出孔,借此外源 DNA隨即進(jìn)入細(xì)胞。這種開孔現(xiàn)象是可逆的,移開海泡石,細(xì)胞膜會自動修復(fù),將開孔重新封閉。細(xì)胞的這一特性,可使一些細(xì)胞外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),從而達(dá)到復(fù)制或表達(dá)的目的。另外,由于對DNA轉(zhuǎn)化機(jī)制理解的不同,導(dǎo)致操作方法有差異。Wilharm等根據(jù)他們提出的機(jī)制認(rèn)為,在涂平板前要經(jīng)過預(yù)干處理[6]。根據(jù)我們對該機(jī)制的理解,預(yù)干處理對提高DNA轉(zhuǎn)化率不利。不經(jīng)預(yù)干過程,用玻璃棒立即涂平板,轉(zhuǎn)化率較高。而對照組,隨著預(yù)干處理時(shí)間的延長,轉(zhuǎn)化率會逐漸降低 (圖2,樣品13~15)。
在重新了解這種基于礦石納米材料微生物轉(zhuǎn)化機(jī)制基礎(chǔ)上,我們對該轉(zhuǎn)化進(jìn)行了優(yōu)化:使用對數(shù)生長初期的細(xì)胞為宿主,細(xì)胞濃度 OD600在 10~20之間,海泡石的濃度為0.1%,不經(jīng)預(yù)干過程,不需要特定的緩沖液,持續(xù)涂平板時(shí)間在1 min以上,可以實(shí)現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)化率,有時(shí)高于鈣轉(zhuǎn)。這些不同于最近的報(bào)道[6],但我們的轉(zhuǎn)化方法變得更直接,轉(zhuǎn)化時(shí)間變得更短。由于我們使用轉(zhuǎn)化率較低的pET15b作為實(shí)驗(yàn)對象,說明這種方法可以用于多種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。使用其他質(zhì)粒如pUC18等可以得到大于1×106/μg質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率。這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA (質(zhì)粒),線型DNA和其他微生物的轉(zhuǎn)化有待摸索。
當(dāng)然這種轉(zhuǎn)化方法與電轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化率還有很大差距,不同的人操作,會有較大的差異。但該方法無需感受態(tài)的制備、不需要貴重的儀器、甚至單菌落冷藏 1個(gè)月都可以直接實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化,所以這種方法的簡便性會得到很多研究者的青睞。海泡石用于微生物的DNA轉(zhuǎn)化屬于一種非常新的轉(zhuǎn)化方法,而且提升的空間很高。在我們的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將DNA與E. coli DH5α在微型離心管內(nèi)混合,槍頭的隨機(jī)抽動就可以實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)化,該現(xiàn)象預(yù)示可以通過海泡石、DNA和微生物的共培養(yǎng)就可以實(shí)現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)化,這為研究特種微生物的DNA轉(zhuǎn)化提供很新的方法。另外,海泡石可以用于革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化[1]。但該方法用于真核生物的DNA轉(zhuǎn)化還沒有報(bào)道,根據(jù)現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化機(jī)制推理,這種方法應(yīng)該很快被用于真核生物的轉(zhuǎn)化。
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