芽胞表面展示技術研究進展

徐小曼，王嘯辰，馬翠卿

1 山東大學 微生物技術國家重點實驗室，濟南 250100

2 四川大學生命科學學院，成都 610065

細胞工廠的構建技術

芽胞表面展示技術研究進展

徐小曼1，王嘯辰2，馬翠卿1

1 山東大學 微生物技術國家重點實驗室，濟南 250100

2 四川大學生命科學學院，成都 610065

芽胞表面展示技術作為微生物表面展示技術的一種，因所表達的異源蛋白無需經過跨膜過程及芽胞的抗逆性等獨特優(yōu)勢而備受研究者的關注。以下介紹了芽胞的生理結構和形成過程、芽胞表面展示系統(tǒng)構建原則及目前所構建的芽胞表面展示系統(tǒng)種類。芽胞表面展示技術不僅在疫苗生產中應用廣泛，在生物催化和細胞工廠研究領域也具有廣闊的應用前景。

芽胞，芽胞表面展示，生物催化

Abstract:Spore surface display is one of attractive microorganism surface display systems. With the advantage of resistance attribute and specific assembly pattern, the technology of spore surface display now is attracting more and more attention. According to the current reports and main achievements of spore surface display, the structure and assembly of spores, the principle for construction and some existing spore surface display systems were elaborated in this paper. Now with the unique property of spores,the technique is not only widely used in production of vaccines but also has great applied potential in the field of biocatalysis and cell-factory.

Keywords:spore, spore surface display, biocatalysis

表面展示 (Surface display) 是一種有價值的基因操作技術，它使表達的外源肽 (或蛋白質的結構域) 以融合蛋白形式展現在噬菌體或細胞的表面，被展示的多肽或蛋白質可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，因而可以用于多肽性質、相互識別和作用的研究，以及構建大型的展示庫。

第一個表面展示系統(tǒng)由Geroge P. Smith等于1985年建立，他利用絲狀噬菌體M13的pIII蛋白將抗體固定在噬菌體表面，為抗原的生產提供了一種新的技術和方法[1]。該實驗的成功使表面展示系統(tǒng)引起了研究學者們越來越廣泛的關注，并建立了多樣的表面展示系統(tǒng)，如噬菌體表面展示系統(tǒng)[2]、酵母表面展示系統(tǒng)[3]、細菌表面展示系統(tǒng)[4]和新發(fā)展起來的芽胞表面展示系統(tǒng)[1]。與噬菌體和細胞等表面展示系統(tǒng)相比，雖然芽胞表面展示系統(tǒng)起步較晚，但具有表達過程更為簡捷有效的優(yōu)點。由于芽胞具有特殊的生理結構，使得融合蛋白在固定到表面的過程中無需經過穿膜過程，大大增加了融合蛋白正確折疊和有效定位的效率，同時借助芽胞的抗逆特性還可提高異源蛋白的穩(wěn)定性[5]。此外，芽胞表面展示系統(tǒng)可固定多聚體蛋白在芽胞表面，并且不影響其活性，為多聚體蛋白的應用提供了一種新的方法[6]。

目前芽胞表面展示技術的應用較為廣泛。在活疫苗和抗體生產方面，可用于將異源抗原決定簇固定在芽胞表面來引起特定抗原的抗體免疫應答。芽胞良好的抗逆性使疫苗能夠耐受胃液中的酸性環(huán)境，儲存時間長，可順利通過胃腸屏障，快速誘導機體產生保護性免疫反應。在蛋白或多肽的高通量篩選方面，借助芽胞的特殊組裝機制和抗逆特性，可有效增加結合和淘洗的過程中所展示蛋白或多肽的穩(wěn)定性。此外，芽胞表面展示技術還應用于化學物質和重金屬的生物吸附、構建生物傳感器等方面(圖1)[7]。隨著科技的不斷發(fā)展和進步，芽胞表面展示技術在不斷的變化更新，其應用的領域和范圍也在逐漸擴大。

圖 1 芽胞基本結構以及芽胞表面展示技術的應用[6,8,16,18,21,23]Fig.1 Structure of spore and application of spore surface display[6,8,16,18,21,23].

1 芽胞的組成

芽胞是有些細菌在饑餓或者環(huán)境惡劣的情況下形成的一種圓形或橢圓形的休眠體，以抵抗不良環(huán)境。芽胞從外至內的結構為孢子外壁、芽胞衣、外膜、皮層、內膜和核心[8]，每部分行使不同的功能。芽胞的結構和化學組成在芽胞的抗逆性中起到了重要的作用。

孢子外壁是一層疏松的結構，存在于少數特定的孢子外層，尤其是蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus屬。芽胞衣是由多個分層和超過50種蛋白組成的復雜結構，以規(guī)則嚴密的矩陣形式自組裝形成，并且多數蛋白都是芽胞基因特有的表達產物。芽胞衣使芽胞對化學試劑和外部溶菌酶具有抵抗作用，防止含有染色體的核心被降解或被原生動物吞噬，但對熱、輻射和一些其他的化學試劑的抵抗作用并不明顯[9-10]。外膜位于芽胞衣的內側，是芽胞形成不可或缺的結構，但具體功能目前尚不明確。與芽胞的外膜相比，芽胞內膜是具有選擇性的透性屏障，保護芽胞染色體DNA免于被一些化學試劑破壞。在芽胞中，內膜呈現為一種緊密壓縮的狀態(tài)。

芽胞的皮層和核心是休眠孢子形成和保持較低水分的關鍵因素。皮層主要是由肽聚糖 (PG) 組成，其結構與生長細胞中的肽聚糖結構類似但具有特殊的后修飾。當芽胞開始萌發(fā)時，皮層會被降解，為核心的膨脹和后續(xù)的細胞生長提供空間[8,11]。芽胞的最內層是核心，含有大部分的酶、染色體DNA、核糖體和tRNA。大部分情況下，芽胞核心中的酶和核酸與生長細胞中基本相同，但芽胞核心中的自由水含量非常低，并含有一種特殊的小分子——嘧啶-2,6-二羧酸 (DPA)。DPA的主要作用是在芽胞形成的過程中降低核心的含水量，并且保護芽胞染色體免于受紫外光和化學物質的破壞[8]。

2 芽胞的形成

芽胞的形成是一系列調控基因和結構基因嚴格按照時序性和空間性調控表達的過程。部分外界因素主要是細胞密度和營養(yǎng)環(huán)境會影響芽胞的形成，而外部環(huán)境的改變最終影響到內部環(huán)境中芽胞形成的關鍵調節(jié)蛋白Spo0A的表達狀態(tài)，當Spo0A的含量和磷酸化水平達到一定閾值時，可直接或間接調節(jié)菌體內的多個基因表達，促使芽胞的形成[12-13]。

芽胞的整個形成過程從開始到結束大約需要8～10 h左右。大致可分為7個步驟。首先當遇到惡劣環(huán)境時細胞開始形成休眠孢子以抵御外界不良環(huán)境，此時細胞內的σ因子的活力開始增加，隨后細胞被特定不均勻的隔膜進行不等分裂，形成一個大的母細胞和一個小的前芽胞，這時在前芽胞中σF因子開始活躍，而在母細胞中則是σE因子。不均等分裂完成后，母細胞的質膜逐漸包裹前芽胞，使前芽胞的外部包裹兩層膜結構，隨后被激活或合成的具有特定空間作用的 σG因子和 σK因子開始誘導前芽胞和母細胞中的基因表達，在前芽胞的內外兩層膜中合成一層厚的糖蛋白皮層。在此過程中由 GerE蛋白和 σK因子相互協(xié)作共同引導基因表達的最后階段，同時前芽胞質體的水分含量大大降低，從而使前芽胞內的pH值降低。前芽胞在此后的過程中逐漸充滿在母細胞中合成的 DPA，DPA可使得前芽胞在后續(xù)過程中繼續(xù)脫水。隨后在芽胞衣蛋白CotE、CotG和CotB的相互作用下，芽胞衣逐漸形成，覆蓋在芽胞外；最后，母細胞被裂解釋放出成熟的芽胞[9]。

3 芽胞表面展示系統(tǒng)

在過去10年中，由于芽胞的特殊結構和生理性質，芽胞表面展示已成為抗體生產和酶催化的一種實用新型技術。2001年，Pozzi課題組以CotB為錨定蛋白將破傷風毒素展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面，建立了第一個芽胞表面展示系統(tǒng)，提供了一種新型高效的抗原免疫模式[14]。與其他表面展示系統(tǒng)相比，芽胞表面展示系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢：1) 客體蛋白在表面展示的過程中不需穿膜過程，因此提高了蛋白折疊效率和展示效率。2) 可展示分子量較大的蛋白。3) 可展示多聚體蛋白。4) 芽胞特有的抗逆性可增加客體蛋白的應用范圍[1]。

目前芽胞表面展示系統(tǒng)中的宿主應用最多的是枯草芽胞桿菌芽胞，因為目前枯草芽胞桿菌的芽胞研究的最為詳細，并具有完整的基因組信息和完善的遺傳操作體系，便于重組芽胞的構建；同時枯草芽胞桿菌是公認的益生菌，安全性高，可廣泛應用于食品和藥品領域[14-15]。除枯草芽胞桿菌外，蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽胞桿菌等也都曾被用作芽胞表面展示系統(tǒng)的宿主。

3.1 芽胞表面展示系統(tǒng)構建原則

芽胞表面展示系統(tǒng)由載體蛋白、目的蛋白和宿主 3部分組成，每一部分都是表面展示系統(tǒng)構建成功的關鍵，因此三者的選擇非常重要。

20世紀90年代，許多不同的載體蛋白 (錨定基序) 被用于異源蛋白的表面展示，但部分被應用的細胞功能蛋白或結構蛋白，如外膜蛋白和細胞附屬物的亞基，可導致細胞的生長缺陷和細胞膜不穩(wěn)定。一個成功的載體蛋白必須符合4項要求。首先，它必須具有一個結構域可使異源蛋白展示在芽胞的表面；其次，它必須具有一個強大的錨定結構域，以保證融合蛋白能夠固定在細胞表面而不被分開；第三，載體蛋白和外源蛋白必須兼容，可以形成融合蛋白，而不會出現由于外源蛋白的插入使載體蛋白或芽胞不穩(wěn)定的現象；最后，載體蛋白必須具有一定抵抗培養(yǎng)基或周質空間中蛋白酶的能力[7]。不同的載體蛋白具有不同的性質特點，可根據具體的展示系統(tǒng)來選擇。目前用于枯草芽胞桿菌芽胞表面展示的載體蛋白主要為CotB、CotC和CotG，研究表明這些蛋白的缺失不會影響芽胞的形成和正常的出芽。

芽胞表面展示系統(tǒng)中的目的蛋白又稱為客體蛋白，被展示在芽胞表面的客體蛋白是根據需要而選擇的，但客體蛋白本身也可影響整個轉運過程以及最終的表面展示結果。芽胞表面展示系統(tǒng)對客體蛋白的要求較低，不僅可展示分子量較大的蛋白還可展示多聚體蛋白，并且在展示到表面的過程中不影響蛋白的自身活力。

在表面展示系統(tǒng)中，宿主所起到的重要作用是不能忽略的。一個好的宿主必須能和客體蛋白兼容，易于培養(yǎng)而不被裂解，并且與細胞壁相關的蛋白酶和胞外蛋白酶的活力應盡量低[7]。芽胞是桿狀菌和梭菌在環(huán)境惡劣的情況下形成的一種休眠體結構，芽胞作為具有代謝能力的特殊結構，也可作為表面展示的宿主并具有其獨特的優(yōu)勢。在芽胞表面展示時，可根據需要選擇芽胞宿主。若固定的異源蛋白是用于進行免疫反應實驗和疫苗的生產，或是用于生產醫(yī)藥、食品化合物和中間體等生物安全性要求較高的領域，可選擇枯草芽胞桿菌作為芽胞表面展示的宿主菌株，因其是公認的益生菌，安全性較高。另外根據特殊的需要，一些致病菌株如蘇云金芽胞桿菌、炭疽芽胞桿菌也可作為表面展示的宿主。

3.2 枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)

芽胞表面展示系統(tǒng)的構建主要是基于外源DNA與芽胞衣蛋白DNA的基因融合。目前，芽胞外衣蛋白中已證實可用作錨定蛋白的有 3種，分別為CotB、CotC和CotG。這3類蛋白常以多聚體的形式存在于富含酪氨酸的芽胞衣外層中。cotB基因編碼一段大小為46 kDa的多肽，在經過翻譯后修飾變?yōu)?6 kDa。CotC是一個分子量只有8.8 kDa的小蛋白，富含酪氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，而CotG是分子量為24 kDa的蛋白，在核心區(qū)含有9個甘氨酸-絲氨酸-精氨酸的重復序列。對于CotG和CotC而言，它們的整個序列常被用作錨定基序，而對于CotB通常只涉及其中很短的一段序列[1,14,16]。目前，大多數的表面展示系統(tǒng)是利用CotB和CotC作為錨定蛋白來展示抗原，應用于疫苗免疫等領域，而CotG蛋白不僅可用來展示抗原，還可應用于生物催化領域展示不同酶。

第一個芽胞表面展示系統(tǒng)是以 CotB為錨定蛋白，將具有高免疫原性的模式抗原破傷風毒素C末端 (TTFC) 展示在了枯草芽胞桿菌芽胞的表面。由459個氨基酸組成的破傷風毒素分別與CotB的N末端、有所縮短的C末端相連或直接插入到 CotB序列中間，隨后將展示有 TTFC的芽胞用于進行小鼠口腔和鼻內免疫反應實驗。實驗證明重組芽胞可同時引起鼠科動物粘膜和全系統(tǒng)的免疫應答[14]。隨后，有研究者將表面展示有CotB-TTFC融合蛋白的芽胞在小鼠的體內培養(yǎng)，發(fā)現小鼠血清中 TTFC特異性抗體IgG產生了高水平應答[17]。

除 CotB外，2004年英國皇家霍洛威大學的Cutting課題組利用芽胞外衣蛋白CotC展示了TTFC和LTB (大腸桿菌不耐熱腸毒素)。通過基因融合的方式將TTFC和LTB的基因插入至cotC基因的C末端，并利用染色體重組技術將融合基因插入枯草芽胞桿菌淀粉酶基因的位置，得到可穩(wěn)定遺傳的重組菌株。通過體外注射的形式將表面展示有 TTFC和LTB的芽胞注入小鼠體內，發(fā)現CotC-TTFC重組芽胞不僅可引起局部免疫反應還可產生系統(tǒng)免疫反應，而對于CotC-LTB重組芽胞，其局部免疫應答比全身免疫應答更為有效。與 CotB-TTFC相比，CotC-TTFC重組芽胞在進行小鼠口服免疫實驗時的劑量低了2倍，但同樣可產生保護性免疫應答。然而對于CotB-TTFC重組芽胞可抵抗50倍抗毒素半數致死量的能力，CotC-TTFC重組芽胞20倍的抵抗能力顯得稍弱。此外，該研究還發(fā)現，體外注射的一小部分完整芽胞可穿過黏膜到達派氏淋巴結，并可與腸道相關淋巴組織相互作用，芽胞的這種能力對細胞內的免疫反應具有重要的指導意義[18]。

中國廣州中山大學的Yu課題組同樣利用CotC將華支睪吸蟲外殼蛋白TP20.8展示在枯草芽胞桿菌芽胞的表面，并將重組的芽胞以口服的形式注入小鼠體內，發(fā)現在小鼠體內產生了黏膜應答，并且提高了 IgA的分泌水平。IgA在動物體內具有重要的生理作用，它可聚集病原體、抑制病原體的移動、防止其與上皮細胞的發(fā)生吸附。因此，芽胞表面展示系統(tǒng)可作為防止和控制寄生蟲的有效免疫工具[19]。

2005年，韓國Kim課題組以CotG為載體蛋白，將鏈霉菌的鏈霉毒素基因插入cotG基因的C末端，然后將鏈霉毒素以融合蛋白的形式展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面。鏈霉毒素的活性形式同四聚體，并且在活性蛋白中具有 4個生物素結合位點。生物素是生物體內重要的生理活性物質，易與蛋白、核酸和碳水化合物等生物分子相結合，因此利用展示有鏈霉毒素的芽胞可非常有效地檢測與生物素相結合的生物分子。就目前鏈霉毒素的生產方法，其DNA序列中的高 GC含量、細胞內生物素的結合以及四聚體的活性形式都限制了鏈霉毒素的細胞內表達及活性分子的分泌，而利用芽胞表面展示系統(tǒng)可有效解決這些問題[16]。2006年，該課題組又以CotG為載體蛋白將綠色熒光蛋白 (GFP) 展示在芽胞表面，GFP在紫外光的激發(fā)下可產生綠色熒光，表面展示有 GFP的芽胞在紫外線下有熒光出現而沒有 GFP的芽胞則沒有熒光產生。根據這一特性，GFP可作為報告基因，用于鑒定其他的可用作錨定基序的外層芽胞衣蛋白[20]。

除了用于展示抗原外，芽胞表面展示系統(tǒng)也可用于生物催化過程。2007年韓國Pan課題組以CotG為載體蛋白將大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面。具有生物活性的 β-半乳糖苷酶是以同四聚體的形式存在的，每個單體的分子量為116 kDa，常被用作生物學研究中的報告蛋白。表面展示有 β-半乳糖苷酶的芽胞經由流式細胞儀檢測和蛋白酶可及性測試 (Protease accessibility test) 驗證發(fā)現，相對于其他的細菌表面展示系統(tǒng)，芽胞表面展示系統(tǒng)對展示的客體蛋白沒有大小和多聚體的限制。β-半乳糖苷酶除了可水解乳糖為葡萄糖和半乳糖外，還可催化水-有機溶劑兩相系統(tǒng)中的糖基轉移反應，產生烷基-β-半乳糖苷——一種具有抗微生物活性的藥物中間體。與游離的 β-半乳糖苷酶相比，展示在芽胞表面的 β-半乳糖苷酶在有機溶劑，尤其是乙醚、甲苯、乙酸乙酯及乙腈中的穩(wěn)定性大大增加，同時熱穩(wěn)定性也有所增加。通過芽胞表面展示的方法，不僅酶在有機溶劑中低穩(wěn)定性的問題得到了有效解決，而且還消除了由于酶和底物分散在兩相引起的傳質問題[1,6]。

3.3 其他芽胞表面展示系統(tǒng)

在土壤中存在很多桿菌尤其是腐生物，大多數不是致病菌，但是蠟樣芽胞桿菌B. cereus、炭疽芽胞桿菌B. anthracis和蘇云金芽胞桿菌B. thutringiensis對動物和昆蟲是病原微生物。這些病原微生物與腐生物的芽胞結構與枯草芽胞桿菌芽胞的結構不同，在其最外層有一層孢子外壁。孢子外壁包裹在芽胞衣外，由基本的類晶體層和外部毛發(fā)般的絨毛組成[1]。孢子外壁中的一些蛋白同樣可作為表面展示系統(tǒng)中的載體蛋白，并且已有成功的報道。

2008年，美國密蘇里州立大學的研究者們分別克隆了不同長度的炭疽芽胞桿菌孢子外壁類糖蛋白BclA和BclB的基因，將其連入芽胞表面展示的表達載體中，以BclA的啟動基因為啟動子，以綠色熒光蛋白為報告基因，驗證了BclA和BclB作為表面展示系統(tǒng)中錨定蛋白的功能，同時還闡述了BclA在孢子外壁中的組裝模式。該研究發(fā)現BclA的N末端對蛋白在芽胞表面的定位起著至關重要的作用，而C末端的最后35個氨基酸不是BclA行使生物功能的必須區(qū)域，可作為外源蛋白的替代區(qū)域；與BclA不同，BclB在母細胞中的含量較少，并且組裝機制與BclA不同，可能與其N末端的結構有關，但這并不影響其在芽胞表面展示系統(tǒng)中行使錨定蛋白的功能。利用炭疽芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)所固定的疫苗，在抵抗炭疽熱和其他具有生物威脅性的試劑方面更為安全有效，使炭疽芽胞桿菌成為極具前途的重組疫苗運輸載體之一。此外，使用芽胞作為疫苗載體可同時引發(fā)Th1和Th2免疫反應，而現有的AVA疫苗則不能，因此將某些異源蛋白如具生物威脅性個體 (Biothreat agents) 的表面蛋白展示在芽胞的表面，可有效建立針對一系列病原微生物的多樣疫苗[21]。

除炭疽芽胞桿菌外，蘇云金芽胞桿菌芽胞也可作為芽胞表面展示系統(tǒng)中的宿主[22-23]。2004年，韓國Choi課題組首次以蘇云金芽胞桿菌芽胞為載體，展示了綠色熒光蛋白，并借助酶聯(lián)免疫吸附技術、微陣列技術和微接觸印刷技術，構建芽胞微模式模型 (Micro pattern)。微模式在高通量細胞分析系統(tǒng)、高靈敏細胞生物傳感器的建立和稀有元素的探測方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，而芽胞微模式在傳感器和探測器領域與傳統(tǒng)的細胞微模式相比，具有更的高穩(wěn)定性并且便于操作，因此芽胞表面展示技術在生物傳感方面的應用前景也十分廣闊[23]。

蘇云金芽胞桿菌的芽胞含有一個大小為130 kDa的原毒素蛋白，是芽胞層的重要組成部分，屬于殺蟲晶體蛋白Cry1Ac亞群，形成最初位于孢子外壁的伴孢晶體。有學者推測伴孢晶體的N末端暴露在芽胞表面，而C末端則在芽胞衣內與蛋白相連。目前GFP和識別化學組分的單鏈抗體 (ScFv) 這兩種客體蛋白通過替代載體蛋白N末端、形成融合蛋白的方法已成功展示在芽胞表面[24]。利用蘇云金芽胞桿菌芽胞進行表面展示的優(yōu)勢一方面是其產孢率較高，產孢率可達98%～100%；另一方面客體蛋白僅存在于伴孢晶體，而伴孢晶體并不是整個芽胞所必須的結構，因此其展示的空間不受限制，而在枯草芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)中融合蛋白與其原始的芽胞衣蛋白在空間上存在競爭作用，因此展示效率低于蘇云金芽胞表面展示系統(tǒng)[1,24]。雖然蘇云金芽胞桿菌芽胞表面展示系統(tǒng)較其他芽胞表面展示具有獨特的優(yōu)勢，但由于其具有致病性，所以蘇云金芽胞桿菌的生物安全性問題仍需考慮。

4 展望

近10年來，由于芽胞獨特的優(yōu)勢，芽胞表面展示技術逐漸受到越來越多的關注。芽胞獨特的抗逆性，使芽胞在惡劣環(huán)境中具有抵抗熱、化學試劑和輻射的能力，同時枯草芽胞桿菌是公認的生物安全菌株，因此枯草芽胞桿菌芽胞在醫(yī)藥領域有著廣泛的應用。

以枯草芽胞桿菌芽胞為載體生產的口服疫苗，克服了傳統(tǒng)可溶性口服疫苗在腸胃中耐受性差、易被降解、吸收有限的缺陷。芽胞良好的抗逆性使疫苗能夠耐受胃液中的酸性環(huán)境，儲存時間長，可順利通過胃腸屏障，快速誘導機體產生保護性免疫反應。不僅口服疫苗可誘導機體正常的免疫應答，腹膜注射仍然可以產生免疫應答，使枯草芽胞桿菌芽胞在疫苗領域的應用極為廣泛。

現在，芽胞表面展示技術不僅在疫苗領域得到廣泛應用，在生物催化和細胞工廠研究領域也越來越受重視。芽胞表面展示技術作為酶固定化方式的一種，無需純化蛋白，可直接將異源蛋白固定在載體芽胞表面，免去繁瑣的酶純化過程，使生物催化過程更加便捷高效；同時展示在芽胞表面的蛋白借助芽胞的抗逆性，在惡劣環(huán)境中的穩(wěn)定性也大大增加，為高附加值化合物的工業(yè)生產提供了重要參考。

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Recent progress of the research on spore surface display

Xiaoman Xu1, Xiaochen Wang2, and Cuiqing Ma1

1State Key Laboratory of Microbial Technology,Shandong University,Jinan250100,China
2School of Life Science,Sichuan University,Chengdu610065,China

Received:May 24, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707803).

Corresponding author:Cuiqing Ma. Tel: +86-531-88364003; Fax: +86-531-88369463; E-mail: macq@sdu.edu.cn

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973 計劃) (No. 2007CB707803) 資助。