微生物降解利用木質纖維素的協(xié)同作用

梁朝寧，薛燕芬，馬延和

1 中國科學院微生物研究所 微生物資源國家重點實驗室，北京 100101

2 中國科學院研究生院，北京 100049

1 概述

生物質 (Biomass) 主要由一系列作為結構支撐、儲能組分的多糖構成。而它的重要組成之一——木質纖維素分布廣泛、成本低廉并且在利用過程中對環(huán)境的副作用小，因而是生物能源研究領域中頗具潛力的原料。木質纖維素的重要來源是可再生的農(nóng)業(yè)殘料 (如秸稈) 和工業(yè)廢料 (如紙漿廢料等)。它的主要組成是纖維素、半纖維素和木質素[1]。纖維素是由葡萄糖單元經(jīng) β-1,4-糖苷鍵連接起來的同源多糖長鏈。最小的重復單位是纖維二糖。纖維素高級結構中，規(guī)則排列的糖鏈間易形成氫鍵，從而形成結構嚴謹、致密的微晶結構。在對里氏木霉Trichoderma reesei纖維素降解酶系研究后，發(fā)現(xiàn)天然纖維素降解是由多種酶協(xié)同作用完成的。首先，內切葡聚糖酶 (EC 3.2.1.4) 從內部隨機切割多糖糖鏈，從而生成長短不一的短鏈。隨后，外切纖維素酶 (EC 3.2.1.74) 從糖鏈末端進行水解，生成 D-葡萄糖；或者外切葡聚糖纖維二糖水解酶 (EC 3.2.1.91) 水解葡聚糖生成D-纖維二糖。最后，β-葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21) 將這些短鏈纖維素 (尤其是纖維二糖) 水解生成葡萄糖[2]。半纖維素是由幾種不同類型的單糖 (包括五碳糖和六碳糖) 構成的異質多聚體。它的含量和組成因來源于不同植物或同一植物的不同部位而有所差別。由于復雜的結構特征，水解利用半纖維素往往需要多種酶共同作用，如木聚糖酶、甘露聚糖酶等。木質素是由聚合的芳香醇構成的一類物質，主要存在于植物的次生壁中，通過與多糖組分 (尤其是半纖維素) 共價結合形成交織網(wǎng)來硬化細胞壁，起抗壓作用。木質纖維素結構組成的復雜性，是植物界對抗微生物侵擾的天然屏障，同時也制約了降解、利用這一生物資源的相關技術的開發(fā)[3-4]。

為了提高木質纖維素的水解利用、降低生產(chǎn)成本，一種策略是發(fā)掘新酶資源或者提高天然酶的性能；但單一酶往往難以實現(xiàn)這一復雜混合物的有效水解，于是另一研究策略是開發(fā)利用能通過協(xié)同作用、高效降解木質纖維素的體系，包括多酶體系和菌群[4]。這就好比構建一個降解木質纖維素的工作車間，而每一種酶 (菌) 都是車間內的機器。本文概述了現(xiàn)有微生物降解利用木質纖維素體系的研究進展，如纖維小體和在此基礎上理性設計的人工纖維小體、菌群共培養(yǎng)、工程菌改造等，展望了這些技術的應用前景，以期實現(xiàn)天然生物質木質纖維素到目的產(chǎn)品乙醇的高效轉化。

2 游離酶降解木質纖維素

可降解纖維素的好氧微生物，如好氧真菌 (如里氏木霉) 或絕大多數(shù)的好氧細菌 (如 Thermobifida fusca)，它們能合成多種纖維素水解酶。在降解木質纖維素底物時，這些酶蛋白在表達順序、組成比例、水解方式上相互協(xié)調，可逐步實現(xiàn)底物的有效降解[5-6]。酶系之間的協(xié)同作用包括：內切酶與外切酶的協(xié)同作用，外切酶之間的協(xié)同作用，以及外切酶與 β-葡糖苷酶的協(xié)同作用等。此外，酶系中還存在多功能酶，有些酶由多個不同家族的催化區(qū)域構成，如Anaerocellum thermophilum、Caldicellulosiruptor sp.或Paenibacillus polymyxa GS01產(chǎn)生的多功能纖維素酶，同時具備纖維素酶、半纖維素酶活性[2-3]；有些酶則具有多個底物結合區(qū) CBM[7]，可以與多種底物相結合。多功能酶蛋白分子內的催化單元促進了協(xié)同作用，使得水解過程能有序高效進行。關于這一部分內容可參考Lynd等的綜述[8]，本文不作詳述。

3 纖維小體降解木質纖維素

發(fā)現(xiàn)于厭氧微生物中的多酶催化體系——纖維小體 (Cellulosome) 具有完備的協(xié)同方式。纖維小體是多種纖維素酶、半纖維素酶依靠錨定-粘附機制形成的、能通過細胞粘附蛋白附著在細菌細胞壁上，高效徹底地降解天然纖維素材料的多酶復合體結構。它是由 Bayer等從纖維素降解細菌 Clostridium thermocellum中首次分離得到的[9]。通常，纖維小體由兩部分組成：其一是各種具有催化能力且能協(xié)同作用的酶類；其二是非催化功能的支架 (Scaffoldin)，由于它由多種黏連蛋白 (Cohesin) 模塊組成，因此是多種水解酶組合形成復合體的支撐結構[10]?，F(xiàn)已在多種微生物中發(fā)現(xiàn)纖維小體，它們主要分布于厭氧細菌Clostridium屬Cluster Ⅲ中[2]，但有研究表明在好氧細菌 (如 Thermobifida fusca) 或一些厭氧真菌 (如 Neocallimastix、Piromyces和 Orpinomyces)中可能也存在類纖維小體結構[11-12]。纖維小體高效降解天然纖維素的 2個關鍵因素是：第一，結構中包含多個對不同底物具有結合功能的CBM；第二，多個不同家族的酶蛋白在空間位置上鄰近，在催化方式上具有協(xié)同作用。纖維小體對纖維素類生物質的降解有廣闊的工業(yè)應用前景，在此基礎上，模擬纖維小體的協(xié)同作用方式、人工設計構建纖維小體也是世界范圍內的研究課題。

3.1 纖維小體的結構研究

為了合理設計人工纖維小體，有必要深入理解纖維小體的構型和組成。Hammel等用X射線散射的方法深入研究了纖維小體的結構。研究表明，纖維小體組裝過程與被稱為連接區(qū)的支架蛋白上的特定區(qū)域有關。這一區(qū)域的結構柔性有效地克服了相鄰黏附蛋白之間的空間位阻效應[13]。Madkour和Mayer用電子顯微鏡 (Electron microscopy，EM) 觀察了C. thermocellum的纖維小體的超微結構，發(fā)現(xiàn)在球狀顆粒的孔洞中存在的可能是支架蛋白的微絲結構，而催化蛋白則分布于外殼層上[14]。但是Mingardon指出，EM觀察中因為使用了固定技術，可能不能真實反映纖維小體的生理結構；在結合并降解包含結晶纖維素和無定形纖維素的異質底物時，纖維小體的拓撲結構可能會發(fā)生變化[15]。

3.2 人工設計纖維小體

人工纖維小體的概念1994年由Bayer等提出。它的基本理念是設計構建一個分泌型的纖維素酶類或半纖維素酶類的復合體，通過各酶之間的協(xié)同作用，高效降解木質纖維素[16]。為了實現(xiàn)這一設想，通過基因重組技術，不同來源的纖維素酶與來自于纖維小體的錨定蛋白 (Dockerin) 相融合，并組裝在能與錨定蛋白互補結合的黏連蛋白構成的人工支架蛋白上形成有機復合體。Murashima等首次實現(xiàn)了體外重組人工纖維小體的合成與組裝。他們構建的纖維小體結構包括：催化區(qū)域、支架蛋白、CBM區(qū)、細胞壁結合區(qū)和黏連蛋白[16]，見圖 1。這一基本結構框架為日后人們設計人工纖維小體提供了依據(jù)。

3.2.1 人工纖維小體的設計實例

人工纖維小體技術的優(yōu)勢在于：首先，為了更好地發(fā)揮協(xié)同作用，來自不同天然纖維小體的酶蛋白可以重新組合；其次，將不同來源、可作用于不同底物的水解酶組合構建的人工纖維小體，有助于擴大底物作用范圍。比之天然游離酶，通過合理設計纖維小體、發(fā)揮各催化單元之間的協(xié)同作用，人工纖維小體在催化能力和底物作用范圍等方面都有所改進。

圖1 纖維小體結構框架示意圖[17]Fig. 1 A simplified schematic of general cellulosome composition[17].

Fierobe等設計合成了一種由 2種纖維素酶(Cel9G和Cel48F) 構成雙功能的纖維小體[18]。在此基礎上，這一小組又將不同來源的黏連蛋白將 2種纖維素酶和 1種半纖維素酶組合起來。這一三功能人工纖維小體的催化能力較之游離酶提高了7倍[19]。Cha等設計構建的微型人工支架用來自 Clostridium cellulovorans的黏連蛋白將內切葡聚糖酶或木聚糖酶組合起來，使這一復合體對多種纖維素類底物的催化能力較游離酶都有顯著提高[20]。同樣，Mingardon等將一種真菌來源的纖維素酶插入細菌纖維小體，使得水解活力較之游離酶提高了26倍[11]。

雖然有很多成功的人工纖維小體報道，但并不能把纖維小體簡單地理解為纖維素酶類的聚合體。天然纖維小體微妙的結構、組成說明它的催化能力和底物作用范圍的設計遵循著一定的內在規(guī)律。如Thermobifida fusca的糖苷水解酶家族6的兩種纖維素酶的CBM區(qū)被替換成錨定蛋白，從而將在天然纖維小體中從未發(fā)現(xiàn)過的家族6纖維素酶引入纖維小體，但這一人工纖維小體盡管對不定型纖維素底物的催化能力是游離型酶的14倍，卻對可溶底物 (如羧甲基纖維素鈉) 的催化能力卻有所下降[21]。而用同樣方法將糖苷水解酶家族 48的外切纖維素酶插入纖維小體，與游離酶相比，纖維小體對可溶纖維素和結晶纖維素的催化能力都有所提高[22]。這說明，纖維小體各催化單元的選擇上具有一定的偏好性；比之糖苷水解酶家族6的纖維素酶，家族48的纖維素酶可能更適于纖維小體的構建。

纖維小體的組成、各組成單元的空間位置等都對這一復合體的協(xié)同方式、催化能力有影響。Mingardon等試圖通過對纖維小體的兩種主要構成酶 (Cel48和Cel9的纖維素酶) 融合CBM區(qū)或錨定蛋白來提高纖維小體的催化能力，但是結果表明，改造后的纖維小體雖然對結晶型纖維素的催化能力提高，但是對不定型纖維素的水解能力下降。同時，比之僅包含野生型蛋白的人工纖維小體，改造后、包含不同CBM區(qū)或者錨定蛋白的纖維素酶構建的各種纖維小體對結晶纖維素的催化能力均有所下降[15]。對人工纖維小體來說，組成單元的拓撲結構和各組成纖維素酶的可活動范圍都對纖維小體的催化能力有重要影響。在另一篇文章中，為了研究催化區(qū)域的柔性與催化能力的關系，纖維素酶 Cel5A的催化區(qū)域與錨定蛋白由不同長度的連接區(qū)相連接后插入纖維小體中后，測試各組合的性質發(fā)現(xiàn)：催化能力與連接蛋白的長度無關，而與錨定蛋白與催化中心結合的位置相關[23]。為了研究纖維小體各組成單元之間以及纖維小體酶蛋白與游離酶的相互作用關系，Bayer等在纖維小體組成酶 Cel48和 Cel9構建了一系列包含不同 CBM或錨定蛋白組合的嵌合重組蛋白，但有趣的是，纖維小體構成酶轉化為游離酶時仍具有一定協(xié)同能力，而反之，大多數(shù)游離酶只有在不作改造 (如不增加 CMB區(qū)或錨定蛋白)，以野生型的形態(tài)組裝成為纖維小體時才具有協(xié)同能力[23-24]。

這些實驗說明為了開發(fā)高效降解人工纖維小體，研究者仍需要深入研究纖維小體的協(xié)同機制和各個組成部分在整個催化體系中發(fā)揮的功用。

3.2.2 人造纖維小體的異源合成和組裝

人工纖維小體可在多種原核表達系統(tǒng)中合成并組裝，生成有催化活性的復合體。

Murashima曾利用胞外蛋白酶缺陷型 Bacillus subtilis WB800合成來自于C. cellulovorans的微型纖維小體[25]。能夠產(chǎn)生不具有纖維素酶活性的纖維小體的C.acetobutylicum ATCC 824也被用于來自C. thermocellum和C. cellulolyticum的纖維小體的合成并分泌至胞外[26]。而C. thermocellum的一種甘露聚糖酶和部分支架蛋白也可以C. acetobutylicum作為宿主得到活性表達[27]。

4 纖維素降解細菌共培養(yǎng)

細菌共培養(yǎng)體系也是提高木質纖維素水解、增加產(chǎn)物利用率，從而提高最終目的產(chǎn)物得率的技術。設計一個穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系，不僅要考慮各組成菌的代謝過程中的協(xié)同作用，而且需優(yōu)化培養(yǎng)條件 (如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度等) 以維持組成菌群的平衡。

現(xiàn)有的共培養(yǎng)體系多是以僅能發(fā)酵六碳糖的C. thermocellum為核心，組合其他嗜熱厭氧微生物 (如 Thermoanaerobactium saccharolyticum、Thermoanaerobacter ethanolicus、C. thermohydrosulfuricum、Thermoanaerobium brockii等) 構建[28-30]，見圖2。菌群在代謝作用上具有協(xié)同作用，如纖維素可被C. thermocellum高效水解成纖維二糖，進而發(fā)酵成乙醇等目的產(chǎn)物；而半纖維素被C. thermocellum水解生成木二糖等五碳糖產(chǎn)物，隨之可被其他組成菌發(fā)酵成乙醇等終產(chǎn)物。

共培養(yǎng)體系的優(yōu)勢在于有機結合了多種代謝途徑，降低了單一菌發(fā)酵產(chǎn)生的有害產(chǎn)物對整個發(fā)酵系統(tǒng)的負面影響，同時簡化了發(fā)酵工藝的操作流程。但是，在木質纖維素的降解中，共培養(yǎng)體系技術仍處于研究初期，菌群之間的協(xié)同方式有待進一步研究。

5 其他策略

以上分別介紹了利用酶系或菌系降解木質纖維素的體系，而進一步的研究目標是將這兩者有機結合起來，將多酶體系協(xié)同作用的策略應用于工業(yè)菌株的改造中。利用基因工程技術，將異源的纖維素水解酶類轉入工程菌中，一方面可提高天然纖維素降解菌株發(fā)酵生成產(chǎn)物的得率，降低產(chǎn)物抑制作用；另一方面，通過引入新酶、利用其在功能上與菌株原有代謝途徑的協(xié)調，可改造非纖維素水解類菌株，使其直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等目的產(chǎn)物。Kondo的研究小組將里氏木酶的內切葡聚糖酶和纖維二糖酶，以及Aspergillu aculeatus的β-葡萄糖苷酶用表面展示技術在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的細胞表面表達，改造后菌株可利用不定型纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[31]。同樣，將木聚糖酶[32]或淀粉酶[33]在釀酒酵母的細胞表面表達后，改造菌株可發(fā)酵利用木聚糖或淀粉類底物合成乙醇。這一技術將纖維素降解酶類生產(chǎn)與工程菌相結合，實現(xiàn)了一步轉化木質纖維素底物為目的產(chǎn)品乙醇，有利于提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，是頗具應用潛力的新型技術。

圖2 以C. thermocellum為中心、降解木質纖維素共培養(yǎng)體系示意圖[17]Fig. 2 Simplified process using C. thermocellum and other microorganisms in co-culture for degradation of lignocellulose[17].

6 小結

木質纖維素作為植物界抵抗微生物侵擾的天然屏障，結構復雜，組成多樣。單一功能的酶往往無法勝任木質纖維素的降解，難以實現(xiàn)對它的充分利用。為了實現(xiàn)這一天然生物資源的高效降解，研究者提出聯(lián)合生物加工技術 (Consolidated bioprocessing，CBP) 的概念，將纖維素酶生產(chǎn)、纖維素水解和乙醇發(fā)酵結合起來，旨在實現(xiàn)一步發(fā)酵完成木質纖維素到生物乙醇的轉化[34]。而多酶 (菌) 體系可通過纖維素降解酶或代謝途徑之間的協(xié)同作用，能以“加工工廠”的形式、以群體協(xié)同作用的方式實現(xiàn)這一天然多聚物的有效降解。為了實現(xiàn)這一目的，有必要對多酶體系各組成單元的協(xié)同作用機理進行深入的研究，比如酶單元的催化中心與底物結合區(qū)之間的關系，酶與底物之間的關系，纖維小體中各成員的空間位置、結構組成對有效降解底物 (尤其是結晶纖維素) 的影響，共培養(yǎng)體系中各菌群代謝之間的協(xié)同方式等?；谶@些研究，人工設計構建的多酶體系 (如人工纖維小體)、多菌體系 (如共培養(yǎng))以及將酶和菌株有機結合的體系 (工程菌代謝網(wǎng)絡改造) 將有助于研究者認識纖維素降解的有機體系，在生物煉制細胞工廠中發(fā)揮作用。

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