PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷常見非整倍體疾病中的臨床應(yīng)用

董小歡 賀靜 綜述 朱寶生 審校

（昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心，云南 昆明 650032）

非整倍體疾病是一類因染色體數(shù)量異常引起的綜合征，目前尚無有效的治療方法。非整倍體疾病以三體型和單體型常見，95%以上的三體綜合征在出生前流產(chǎn)［1］。活產(chǎn)兒中最常見的三體綜合征包括21-三體綜合征（Down Syndrome）、18-三體綜合征（Edwards Syndrome）、13-三 體 綜 合 征 （Patau Syndrome）、Klinefilter綜合征，單體綜合征以Turner綜合征最為常見。常染色體單體綜合征幾乎不能存活到足月分娩。存活的非整倍體疾病患者表現(xiàn)出不同程度的智力低下、身材矮小、特殊面容、性發(fā)育不良以及其他各種組織器官的畸形等，生活難以自理，給患者、家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。這些疾病目前尚無有效的治療方法，僅能通過產(chǎn)前篩查和（或）產(chǎn)前診斷后通過選擇性人工流產(chǎn)措施避免此類患兒的出生。

染色體核型分析是診斷非整倍體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，它能提供準(zhǔn)確、豐富的信息量［2］。然而該技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)人員的操作技術(shù)要求高［3］。熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)雖無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，但染色體特異性探針的成本較高，每批次能檢測(cè)標(biāo)本的規(guī)模較小，而且勞動(dòng)力密集［2］。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)自20世紀(jì)80年代中期問世以來，憑借快速、簡(jiǎn)便、靈敏等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年P(guān)CR技術(shù)在非整倍體疾病快速診斷應(yīng)用中發(fā)展迅速，比較傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)而言，PCR技術(shù)具有試劑成本相對(duì)較低、檢測(cè)批量大和快速的優(yōu)勢(shì)。本文分別從定性、半定量、定量不同層次，探討PCR及相關(guān)技術(shù)在常見非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。

1 定性PCR

1.1 STR-PCR技術(shù) 短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandem Repeat，STR）即微衛(wèi)星位點(diǎn)，廣泛存在于人類基因組，以2～6個(gè)堿基為單位串聯(lián)重復(fù)排列。STR一般遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律，具有雜合度高、多態(tài)信息量大的特點(diǎn)，因此可作為一種遺傳標(biāo)記，用于染色體病、單基因病等多種遺傳病的產(chǎn)前診斷。其產(chǎn)生機(jī)制是復(fù)制滑脫或者DNA互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配導(dǎo)致重復(fù)單位的插入［4］。1991年，Edwards等［5］建立了STR-PCR分型技術(shù)。該法選用染色體上的STR位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯帶分型，根據(jù)條帶的數(shù)目及濃度判斷是否為三體綜合征。

朱金玲等［6］選擇21號(hào)染色體上的4個(gè)STR位點(diǎn)（D21S2055、D21S1244、D21S1435、D21S1809）用該法檢出了所有由核型分析確診的單純型21-三體，并可判定額外染色體的親代來源。王歡等［7］選擇21號(hào)染色體關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)部及附近的6個(gè)STR位點(diǎn) （D21S11、D21S1412、D21S1437、D21S1413、D21S1446、D21S1270），采用該技術(shù)快速產(chǎn)前診斷5例單純型21-三體綜合征。自2007年1月到2009年12月，本院常規(guī)選用5個(gè)STR位點(diǎn)（D21S11、D21S1437、D21S1411、D18S535、D18S1002），對(duì)1 968名孕婦進(jìn)行了快速產(chǎn)前診斷，共診斷19例唐氏綜合征、10例18-三體綜合征，其結(jié)果與染色體核型分析基本一致。

STR-PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)單、安全、成本低的優(yōu)點(diǎn)［8］。PCR反應(yīng)需選用具有高度多態(tài)性的STR位點(diǎn)，當(dāng)胎兒在某位點(diǎn)上為純合子時(shí)則無法提供診斷依據(jù)。本院診斷的1 968例標(biāo)本中出現(xiàn)了1例特殊樣本，在5個(gè)常規(guī)STR位點(diǎn)上均表現(xiàn)為純合子，因此無法明確診斷。應(yīng)用該方法，同時(shí)結(jié)合親代的基因型可以判斷子代額外染色體的來源，還可判斷染色體不分離發(fā)生的時(shí)間［9］。當(dāng)三體綜合征的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為濃度1：1：1的3條帶時(shí)，提示減數(shù)分裂I期同源染色體不分離；表現(xiàn)為濃度1：2的2條帶時(shí)，提示減數(shù)分裂II期姐妹染色單體不分離。

此外，本方法可以鑒別標(biāo)本中是否存在母血污染，但對(duì)于易位型或嵌合型的染色體三體可能漏診。該方法在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷上易受主觀因素的干擾從而影響其準(zhǔn)確性，因此該方法終會(huì)被定量PCR所取代，以降低漏診率和假陰性。

1.2 甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP） MSP法的原理是基于DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，所有未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶無此改變?；谶@種堿基的改變，分別設(shè)計(jì)2對(duì)針對(duì)甲基化與非甲基化等位基因的引物，PCR擴(kuò)增后聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物就可以將甲基化與非甲基化等位基因區(qū)分開。

Sergio等［10］利用X染色體上FMR-1基因來進(jìn)行X染色體的倍性分析，并設(shè)計(jì)了2對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)。用亞硫酸氫鈉處理DNA樣品后甲基化的X染色體上CpG島的胞嘧啶并未發(fā)生改變，這樣其中一對(duì)引物的PCR產(chǎn)物為142 bp的片段；另一對(duì)引物針對(duì)處理后未甲基化的Cp G島合成84 bp的產(chǎn)物。在整個(gè)基因組中，Cp G島通常位于基因的啟動(dòng)子區(qū)域，在正常情況下，Cp G島是以非甲基化形式存在于基因的啟動(dòng)子內(nèi)。但有兩個(gè)例外，其中1個(gè)是在已失活的X染色體上的基因，如女性的1條X染色體。在這種情況下，其啟動(dòng)子區(qū)域的Cp G島是甲基化的，而且這種甲基化是與該基因的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。應(yīng)用該法，正常女性可見142 bp和84 bp的2個(gè)片段，而特納綜合征的女性僅見84 bp的片段，同時(shí)利用15號(hào)染色體上SNRPN基因的Cp G島作為內(nèi)對(duì)照。在研究中，作者對(duì)1例特納綜合征的胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，并對(duì)20例已確診的特納綜合征患者及42例正常女性對(duì)照進(jìn)行X染色體的倍性分析。研究結(jié)果顯示該種診斷方法靈敏度高，準(zhǔn)確率達(dá)100%，而且該方法簡(jiǎn)單易行、快速高效（整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在48小時(shí)以內(nèi)完成）、準(zhǔn)確、并無需使用昂貴的設(shè)備。該方法的建立為進(jìn)行X染色體的倍性分析提供了一條簡(jiǎn)單易行的途徑，但是該方法是利用X染色體的失活來進(jìn)行檢測(cè)的，所以只能用于進(jìn)行X染色體的倍性分析。

1.3 多連接依賴性探針擴(kuò)增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA） MLPA是一種高通量、針對(duì)待測(cè)核酸中靶序列進(jìn)行定量分析的技術(shù)，基本原理包括探針和靶序列DNA進(jìn)行雜交，之后通過特異化連接，PCR擴(kuò)增連接完好的探針，產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，相關(guān)軟件對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出產(chǎn)物峰的峰面積、峰高度，根據(jù)特定基因拷貝數(shù)的改變，即可確定染色體數(shù)目的異常。

Dan等［11］對(duì)517例自然流產(chǎn)胎兒進(jìn)行染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)其中7例表現(xiàn)為2條染色體三體，對(duì)這7例樣本進(jìn)行MLPA，準(zhǔn)確的診斷了這7例樣本的核型。范新萍等［12］采用該技術(shù)檢測(cè)34份標(biāo)本13、18、21、X和Y染色體拷貝數(shù)的變化，其結(jié)果除一份提示母血污染外，其余33份外周血、臍帶血或羊水標(biāo)本報(bào)告均與染色體核型分析結(jié)果一致，臨床符合率97.1%。

MLPA是一種敏感性高、準(zhǔn)確性高、快速經(jīng)濟(jì)的診斷方法，但不能應(yīng)用于檢測(cè)被污染的羊水標(biāo)本，亦不能用于檢測(cè)STR位點(diǎn)及染色體的平衡易位。

2 半定量PCR

2.1 引物原位標(biāo)記（primed in situ labeling，PRINS） PRINS是由細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)以及免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合形成的一種新技術(shù)，該技術(shù)將FISH與PCR結(jié)合起來，其基本原理是應(yīng)用寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結(jié)合，然后用非同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸（d UTP）參與延伸反應(yīng)，標(biāo)記了的d UTP將以堿基配對(duì)的形式摻入新合成的DNA單鏈中，最后用相應(yīng)的熒光抗體與標(biāo)記物結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。

Kirsten等［13］用該技術(shù)成功地對(duì)262例未培養(yǎng)的羊水標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，診斷其中的2例18三體，無假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果。劉楊等［14］采用該技術(shù)對(duì)10例典型三體型唐氏綜合征患者進(jìn)行基因診斷，結(jié)果均顯示3個(gè)明顯的標(biāo)記信號(hào)。

與FISH相比，該方法更快速、簡(jiǎn)便（僅需1～2小時(shí)，前者常需過夜）、價(jià)格低廉（費(fèi)用為FISH的1／10），可鑒別13與21號(hào)染色體（FISH由于采用著絲粒探針，13與21號(hào)染色體存在高度同源性故常發(fā)生交叉反應(yīng)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果），多色PRINS反應(yīng)中每一個(gè)引物與靶序列的退火反應(yīng)都在各自的最適溫度下進(jìn)行，從而保證了其特異性［15］。

2.2 同源基因定量PCR（HGQ-PCR） HGQ-PC法設(shè)計(jì)一對(duì)公用引物，同時(shí)擴(kuò)增一對(duì)同源基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)掃描后用軟件分析，檢測(cè)這兩個(gè)同源基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)比值并統(tǒng)計(jì)分析其變異范圍，可以檢測(cè)出非整倍體中增加的染色體的基因拷貝。

王謙等［16］針對(duì)178名正常人和38名唐氏綜合征患者，用該法同時(shí)擴(kuò)增21號(hào)染色體唐氏綜合征致病關(guān)鍵區(qū)域的人肝型磷酸果糖激酶基因（PFKLCH21）和位于1號(hào)染色體的人肌型磷酸果糖激酶基因（PFKM-CH1），2組研究對(duì)象的同源基因比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

該方法需要使用光密度掃描儀，快捷、較QFPCR法費(fèi)用低廉。除PCR循環(huán)周期外，DNA質(zhì)量是影響PCR擴(kuò)增的主要因素。如果DNA質(zhì)量太差，將僅能擴(kuò)增出較小的PFKL基因片段，而較大的PFKM基因片段擴(kuò)增失?。?7］。

3 定量PCR

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。而在非整倍體的診斷中多采用比較閾值法實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定而無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增目的基因和管家基因，反應(yīng)結(jié)束后分別獲得兩基因的CT值，根據(jù)數(shù)學(xué)方法推導(dǎo)得出目的基因相對(duì)于管家基因的量。

高斌等［18］選擇21號(hào)染色體上唐氏綜合征特異區(qū)域基因片段（DSCR3）為目的基因，以12號(hào)染色體上的GAPDH為參照基因，設(shè)計(jì)引物以及分別以不同熒光標(biāo)記的Taq Man探針，在同一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)20例經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析確診為三體型的唐氏綜合征患者血標(biāo)本和30例正常血標(biāo)本，分別獲得患者和正常人的ΔCT值，兩組數(shù)據(jù)間有非常明顯的差異，且無交叉重疊。余蓉等［19］應(yīng)用該技術(shù)擴(kuò)增12號(hào)染色體上GAPDH基因、21號(hào)染色體上S100B基因和DSCR1基因，比較得病例組與對(duì)照組ΔCT值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且病例組低于對(duì)照組。Jerome等［20］同時(shí)擴(kuò)增非多態(tài)性目的基因DSCR1和內(nèi)參基因CFTR（囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白），然后計(jì)算兩基因的比值，在154例羊水標(biāo)本中共檢測(cè)出2例21-三體，所有標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果均與核型分析一致。Tomoko等［21］同時(shí)擴(kuò)增目的基因鉀離子電壓門控通道基因（21q22.12）和內(nèi)參基因核糖體磷蛋白基因（18q21.1），然后計(jì)算2基因的ΔCT值，唐氏綜合征的ΔCT值明顯高于正常對(duì)照組，且兩者間無重疊。

比較閾值法多選用非多態(tài)性的遺傳標(biāo)記（不同于QF-PCR中常用的STR位點(diǎn)），因此不必尋找基因上的多態(tài)片段，只需要一對(duì)探針標(biāo)記的引物即可；但與此同時(shí)又帶來一個(gè)缺陷，那無法鑒別標(biāo)本中的母血污染。此外，該法簡(jiǎn)單（設(shè)置管家基因作為內(nèi)參照，省去了制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的復(fù)雜過程，滿足了對(duì)原始模板的定量需要）、成本低、通量大，但需優(yōu)化條件使目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率一致［22］。該法可以診斷三體型和易位型患者，但是對(duì)平衡易位患者（因?yàn)榛蚩偭坎蛔儯?、嵌合型患者難以明確診斷，需要進(jìn)一步研究、完善。

3.2 定量熒光PCR（Quantitative Fluorescence PCR，QF-PCR） QF-PCR法通過熒光標(biāo)記的引物，PCR擴(kuò)增DNA樣本，經(jīng)毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)內(nèi)標(biāo)（相當(dāng)于DNA marker）的指示，軟件自動(dòng)計(jì)算出檢測(cè)片段的信息（出峰時(shí)間、片段大小、峰高、峰面積及根據(jù)橫坐標(biāo)的出峰位置），并通過點(diǎn)擊每個(gè)檢測(cè)峰而顯示。由片段大小可判斷出該峰所指示的是何種引物擴(kuò)增出的標(biāo)記物。根據(jù)峰個(gè)數(shù)、峰高、峰面積值就可判斷出該標(biāo)記物指示的染色體數(shù)目。多選用雜合度、特異性高的STR位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記。若為雜合子，顯示為2個(gè)峰，定量之比為1：1；若為純合子，顯示為1個(gè)峰，其定量值為正常對(duì)照的2倍。

江帆等［23］針對(duì)21號(hào)染色體上特異的3個(gè)STR位點(diǎn)（D21S1435、D21S1411、D21S11），X 染色體上的兩個(gè)STR位點(diǎn)（DXS981、DXS6809），X、Y 染色體上共有的STR位點(diǎn)X22及性別特異性位點(diǎn)AMXY設(shè)計(jì)引物，引物的5端標(biāo)記熒光，對(duì)202份外周血標(biāo)本提取基因組DNA進(jìn)行七重定量熒光PCR擴(kuò)增，使用ABI310測(cè)序儀進(jìn)行PCR結(jié)果分析，根據(jù)國(guó)際統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判斷，與染色體核型診斷結(jié)果具有同一性。Celia等［24］對(duì)2000年6月至2004年3月英國(guó)泰姆地區(qū)接受遺傳服務(wù)的8 983例標(biāo)本進(jìn)行了QF-PCR，共檢測(cè)出18例嵌合體，含3例13-三體、7例18-三體、7例21-三體、1例嵌合三體。他們同時(shí)還發(fā)現(xiàn)聯(lián)用核型分析和QFPCR比單用其中任一方法能檢測(cè)出更多的嵌合體。

QF-PCR法常選用高度多態(tài)性的STR位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，當(dāng)胎兒在某位點(diǎn)上為純合子時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法提供診斷信息，此時(shí)就應(yīng)增加位點(diǎn)數(shù)以滿足診斷需要。Levett等［25］開展的一項(xiàng)含有5 000份羊水標(biāo)本的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，約2%的標(biāo)本在某一個(gè)染色體上有7～8個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為純合子，因此無法明確診斷。此外，該方法診斷染色體異常疾病的靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以分析出異常染色體的雙親來源，判斷異常染色體是來源于減數(shù)分裂1期還是減數(shù)分裂2期［26］。羊水中常見的少量母血污染并不影響QF-PCR，而大量的母血污染可能掩蓋胎兒的基因型。Celia等［24］認(rèn)為當(dāng)異常細(xì)胞株的比例不小于15%時(shí)，QF-PCR才能檢測(cè)出嵌合體的存在。

3.3 數(shù)字PCR（digital-PCR） 數(shù)字PCR將DNA樣本稀釋后分裝到芯片的每個(gè)孔中，其平均含量少于一個(gè)拷貝。數(shù)字PCR通過計(jì)數(shù)從單個(gè)模板分子擴(kuò)增而來的DNA量實(shí)現(xiàn)精確定量測(cè)定，反應(yīng)后產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的孔數(shù)與原始樣本中的DNA模板分子數(shù)相關(guān)。

Christina等［2］從正常細(xì)胞株和21三體細(xì)胞株中提取人類基因組DNA，隨后分別以不同比例混合2個(gè)基因組，針對(duì)21號(hào)染色體上的淀粉樣蛋白基因以及12號(hào)染色體上的磷酸甘油醛脫氫酶基因設(shè)計(jì)特異性引物和Taqman探針，適當(dāng)稀釋后的DNA模板加載于微流控芯片，在熒光成像熱循環(huán)系統(tǒng)上進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的兩步法PCR。反應(yīng)結(jié)束后計(jì)數(shù)陽(yáng)性信號(hào)的孔數(shù)，可得出在正常人中2基因的比值為1∶1，21-三體病例中2個(gè)基因的比值為3∶2。

該法不具有其他分子技術(shù)的局限性，比定量PCR的精確度更高，受擴(kuò)增效率波動(dòng)的影響較小，不依賴于等位基因的分布，即使是嵌合體和母血污染的DNA都可以檢測(cè)到信號(hào)［2］，可用于檢測(cè)任何一種非整倍體疾病。

4 小結(jié)

綜上所述，各種基于PCR的定性、半定量、定量技術(shù)廣泛應(yīng)用于常見非整倍體疾病的快速診斷，每種方法都各有利弊。目前，國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)中涉及的診斷方法多采用STR-PCR法、QF-PCR等，國(guó)外開始有應(yīng)用數(shù)字PCR的文獻(xiàn)報(bào)道，但仍以QF-PCR的應(yīng)用更為普遍。數(shù)字PCR能夠提供更多的診斷信息，結(jié)果的可靠性將會(huì)更高，成本也更高一些，值得進(jìn)一步的應(yīng)用研究。

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