澤蘭飲片及不同部位HPLC指紋圖譜研究

陳慕媛， 黃月純， 劉東輝， 魏 剛， 劉翠玲

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405)

雙柏散是廣州中醫(yī)藥大學(xué)用于外科、骨傷科的經(jīng)驗(yàn)方，由大黃、側(cè)柏葉、黃柏、澤蘭、薄荷五味藥組成，常用比例為2∶2∶1∶1∶1，具有活血化瘀、清熱解毒、消腫止痛等功效，用于治療跌打損傷早期、急性軟組織損傷、急性踝關(guān)節(jié)扭傷、瘡瘍腫毒等有顯著療效［1］。方中澤蘭具有顯著的改善血液流變性質(zhì)，同時(shí)還具備抗凝血、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、保護(hù)修復(fù)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制氧化損傷等作用，其中有效成分咖啡酸發(fā)揮著抑制血小板聚集、抗菌消炎等作用［2］。澤蘭主要含黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、揮發(fā)油等有效成分，目前澤蘭的質(zhì)量研究主要是咖啡酸等酚酸類(lèi)成分的含量測(cè)定［3-4］，尚未見(jiàn)采用指紋圖譜技術(shù)控制澤蘭藥材質(zhì)量的報(bào)道。因此，為探討雙柏制劑的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和提高質(zhì)量控制水平，本研究擬采用HPLC法研究澤蘭飲片指紋圖譜。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent HP-1100)，光二極管陣列檢測(cè)器(DAD);色譜柱:Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);12批澤蘭藥材飲片分別購(gòu)自廣東六家藥材公司(見(jiàn)表1)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定系澤蘭Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel的干燥地上部分;咖啡酸對(duì)照品(批號(hào)110885-200102，含量測(cè)定用)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純，其它試劑為分析純，試驗(yàn)用水為純化水。

表1 澤蘭飲片來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Zorbax Esclipe XDB C18(250 mm×46 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫:0～20 min乙腈由13%變?yōu)?5%，20～40 min乙腈由25%變?yōu)?8%，40～50 min乙腈由38%變?yōu)?0%，50～60 min乙腈由70%變?yōu)?5%;檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;柱溫:40℃;流速:1.0 mL/min。

2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取澤蘭粉末1 g于100 mL的雞心瓶中，加入80%甲醇40 mL，水浴回流1.5 h，取出，放冷，濾過(guò)，藥渣及濾紙剪碎同置于雞心瓶中，加40%甲醇40 mL，水浴回流1.5 h，取出，放冷，濾過(guò)，用40%甲醇洗滌藥渣及濾紙，合并濾液和洗液，蒸干，加80%甲醇適量溶解，離心(4 000 r/min，5 min)，取上清液于5 mL量瓶中，沉淀加80%甲醇洗滌，取上清液并入量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 精密度試驗(yàn) 吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明:18個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，提示精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液10 μL，分別在0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣。結(jié)果表明:18個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，提示24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品粉末6份，平行操作。結(jié)果表明:18個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，提示重復(fù)性良好。

2.6 樣品檢測(cè) 取供試品溶液10 μL，依法檢測(cè)。

2.7 指紋圖譜的建立分析

2.7.1 共有峰的確定 以上12批澤蘭HPLC色譜圖均有18個(gè)共有峰。經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器的紫外光譜分析，不同批次澤蘭所對(duì)應(yīng)的同一共有峰紫外光譜一致，表明澤蘭均具有相似主要特征成分。各批樣品的共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積見(jiàn)表2，且各共有峰相對(duì)含量較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性，可初步擬定為澤蘭的指標(biāo)成分群。經(jīng)對(duì)照品對(duì)照及紫外光譜對(duì)照，1號(hào)峰為咖啡酸峰，6號(hào)峰為澤蘭的第一大峰，其峰面積百分含量在19.95% ～41.38%范圍內(nèi)。

表2 12批澤蘭樣品HPLC指紋圖譜分析結(jié)果

2.7.2 指紋峰相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥指紋圖譜相似度軟件2004年A版計(jì)算均值相似度。以12批澤蘭的測(cè)定結(jié)果擬定澤蘭HPLC指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為對(duì)照計(jì)算各批澤蘭的相似度，結(jié)果見(jiàn)表3。12批澤蘭指紋圖譜重疊圖見(jiàn)圖1，12批澤蘭生成的共有模式指紋圖譜見(jiàn)圖2。

表3 12批澤蘭HPLC指紋圖譜相似度結(jié)果

圖1 12批澤蘭樣品HPLC指紋圖譜疊加圖

圖2 12批澤蘭樣品HPLC指紋圖譜共有模式

2.8 不同部位的指紋圖譜比較研究 稱(chēng)取澤蘭地上部分、莖、葉粉末各1 g，按2.2項(xiàng)下方法制備，按擬定方法進(jìn)樣分析，結(jié)果莖具有18個(gè)特征指紋峰，葉具有17個(gè)特征指紋峰，見(jiàn)表4、表5。全粉、莖與葉的指紋圖譜重疊圖譜見(jiàn)圖3。

表4 4批澤蘭飲片及不同部位HPLC指紋圖譜分析結(jié)果

圖3 澤蘭不同部位HPLC指紋圖譜

3 討論

經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化確定以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫系統(tǒng)為流動(dòng)相。經(jīng)采用254、330、350 nm等不同的檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)及用光二極管陣列檢測(cè)器分析，在330 nm波長(zhǎng)處指紋峰較多，多數(shù)特征成分的響應(yīng)值均較大，而且基線較平穩(wěn)，故選擇330 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。

供試品溶液的制備比較了超聲處理和水浴回流兩種提取方法，結(jié)果水浴回流提取較完全。采用不同濃度的甲醇和乙醇溶液作為提取溶媒，結(jié)果甲醇對(duì)30 min之后的色譜峰提取效果較好，60% ～80%甲醇對(duì)8～30 min之間的色譜峰提取效果較好，40%甲醇對(duì)咖啡酸等極性較大的成分提取效果最好;8～30 min的色譜峰總共有峰占總峰面積的81.32%～86.92%，咖啡酸峰面積百分含量在6.07% ～8.05%范圍內(nèi);而且不同溶媒提取液出峰數(shù)基本一致，主要表現(xiàn)為峰面積響應(yīng)值的不同，綜合分析，本試驗(yàn)選擇80%甲醇和40%甲醇為提取溶媒。為顯示圖譜全貌，通過(guò)制備不同濃度的供試品溶液進(jìn)行分析比較，結(jié)果供試品溶液為0.2 g/mL生藥量，各共有峰的相對(duì)含量較穩(wěn)定，色譜峰響應(yīng)值較大，故確定供試品溶液的濃度為0.2 g/mL生藥量。

表5 4批澤蘭不同部位HPLC指紋圖譜葉、莖峰面積比值結(jié)果

按擬定的方法，測(cè)定了12批澤蘭樣品，共標(biāo)出18個(gè)共有峰，各樣品間峰面積相對(duì)百分含量具一定特征性，均以1、3、6、13號(hào)峰為四強(qiáng)峰，可初步擬訂為澤蘭特征指紋峰。18個(gè)共有峰峰面積的相對(duì)含量均較穩(wěn)定，相似度為0.957～0.999，說(shuō)明不同來(lái)源的澤蘭飲片質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。

按已擬定的方法，分析了4批澤蘭莖、葉的HPLC指紋圖譜，結(jié)果莖具有18個(gè)特征指紋峰，葉具有17個(gè)特征指紋峰，莖、葉均以1、3、6、13號(hào)峰為主要特征峰;對(duì)同一批樣品莖、葉不同部位進(jìn)行分析，結(jié)果表明莖、葉的特征指紋峰相對(duì)含量具顯著性差異，其中全粉的4號(hào)峰僅來(lái)源于莖，而且除9、12、15號(hào)峰有部分樣品的葉峰面積小于莖峰面積外，其它特征指紋峰的葉峰面積均大于莖峰面積，提示澤蘭葉所含特征指紋峰成分的含量高于澤蘭莖。因此，為保證澤蘭藥材的質(zhì)量，建議應(yīng)規(guī)定藥材中葉的比例。

［1］魏 剛.雙柏散臨床應(yīng)用與研究進(jìn)展［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，15(增刊):60-62.

［2］劉 君.澤蘭的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(1):23-24.

［3］聶 波，劉 勇，徐 青，等.高效液相色譜法測(cè)定不同澤蘭中咖啡酸的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(11):882-884.

［4］黃宏偉，鄒盛勤.反相高效液相色譜法測(cè)定澤蘭中烏索酸和齊墩果酸的含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(15):4409，4457.