HPLC-ELSD法測(cè)定不同廠家銀杏葉提取物分散片劑中萜類內(nèi)酯溶出度

周自桂， 蘇 晉， 金 春， 徐 成， 秦 勇

(江蘇弘惠醫(yī)藥有限公司研發(fā)部，江蘇南京210008)

銀杏葉分散片［1］是由銀杏葉提取物制成的片劑，其活性成分為總黃酮醇苷和二萜內(nèi)酯;銀杏酮酯［2-4］為第五代銀杏葉提取物，其活性成分也是總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯，銀杏酮酯分散片是以銀杏酮酯為原料制成的片劑。這兩類片劑均具有活血化瘀，通絡(luò)舒脈的功效，臨床用于治療血瘀型胸痹及血瘀型輕度腦動(dòng)脈硬化引起的眩暈、冠心病、心絞痛。但在臨床療效上，患者均反映銀杏酮酯分散片療效明顯好于銀杏葉分散片，且療效穩(wěn)定，而銀杏葉分散片不同廠家之間療效差異也很大。由于藥物的溶出度直接影響藥物在體內(nèi)的吸收和利用，而國內(nèi)現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均以分散時(shí)限作為分散片的控制指標(biāo)，但這并不能反映產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，片劑雖然分散了，但其有效成分并不能馬上溶出，對(duì)于那些水溶性差的成分更是難以溶出。有文獻(xiàn)報(bào)道［5］通過測(cè)定片劑中的總黃酮醇苷的溶出度來評(píng)價(jià)與控制藥品質(zhì)量，這確實(shí)在質(zhì)量控制上有了很大的提高。由于銀杏葉提取物的另一類有效成分萜類內(nèi)酯水溶性更低于黃酮醇苷，故本試驗(yàn)采用HPLCELSD法［6］測(cè)定不同廠家分散片中萜類內(nèi)酯的溶出度，以期為評(píng)價(jià)與控制藥品質(zhì)量提供更充分的依據(jù)，保證藥品療效。

1 儀器、藥品、試劑

儀器:ZRS-8智能溶出儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)、Waters 515泵高效液相，Varian380-LC蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;對(duì)照品:白果內(nèi)酯(批號(hào)110865-200404)、銀杏內(nèi)酯A(批號(hào)110862-200608)、銀杏內(nèi)酯B(批號(hào)110863-200508)、銀杏內(nèi)酯C(批號(hào)110864-200505)，均購自中國藥品生物制品檢定所;試劑:乙腈(色譜純)、水(超純水)、其它試劑均為分析純。供試藥品:銀杏酮酯分散片為江蘇A廠產(chǎn)品，其余廠家的產(chǎn)品均為銀杏葉分散片，具體規(guī)格見表1。

表1 各廠家分散片規(guī)格

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Alltech C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流動(dòng)相:水-乙腈-四氫呋喃(80 ∶8 ∶12);流速:1.0 mL/min;漂移管溫度:105℃，氮?dú)饬魉?2.70 mL/min。理論板數(shù)按銀杏內(nèi)酯A峰、銀杏內(nèi)酯B峰、銀杏內(nèi)酯C峰和白果內(nèi)酯峰計(jì)算均不低于3 000。

2.2 對(duì)照品制備方法

取銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含銀杏內(nèi)酯A 30 μg、銀杏內(nèi)酯B 15 μg、銀杏內(nèi)酯C 15 μg、白果內(nèi)酯 50 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品及自身對(duì)照溶液處理方法

2.3.1 供試品溶液

取溶出液7 mL，濾過，精密吸取5 mL，用醋酸甲酯振搖提取2次，每次10 mL，合并醋酸甲酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解置2 mL量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.2 自身對(duì)照溶液

取10片，研細(xì)，精密稱取相當(dāng)于1片的重量，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，超聲提取30 min，取溶液7 mL，濾過，照2.3.1項(xiàng)下供試品處理方法同法制備，即得。

2.4 陰性干擾試驗(yàn)

按處方比例稱取空白輔料，置100 mL量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，超聲提取30 min，取溶液7 mL，濾過，照2.3.1項(xiàng)下供試品處理方法同法制成陰性樣品溶液。取對(duì)照品溶液20 μL、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(見圖1)，結(jié)果表明陰性樣品對(duì)萜類內(nèi)酯的測(cè)定無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液 2、5、10、15、20 μL 注入液相色譜儀，以對(duì)照品進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明白果內(nèi)酯在102.8～1028 ng、銀杏內(nèi)酯A在65.4～654 ng、銀杏內(nèi)酯B在32.8～328 ng、銀杏內(nèi)酯C在34.4～344 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為:白果內(nèi)酯:Y=1.062 3X+6.534 5，r=0.999 9、銀杏內(nèi)酯 A:Y=1.017 5X+6.456 1，r=0.999 8、銀杏內(nèi)酯B:Y=1.056 2X+6.054 8，r=0.999 6、銀杏內(nèi)酯C:Y=1.033 1X+6.882 3，r=0.999 8。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯峰面積的 RSD分別為0.9%、1.3%、1.1%、0.7%，表明本法精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述供試品溶液(A 廠)室溫放置，分別于 0、2、4、6、8 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，峰面積的RSD為1.2%，表明本供試品溶液室溫8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品(A廠，批號(hào)090407，含銀杏萜類內(nèi)酯為5.761 mg/片，其中白果內(nèi)酯2.578 mg/片、銀杏內(nèi)酯A 1.546 mg/片、銀杏內(nèi)酯B 0.987 mg/片、銀杏內(nèi)酯C 0.65 mg/片)約75 mg，共5份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(每1 mL 含白果內(nèi)酯 514 μg、銀杏內(nèi)酯 A 327μg、銀杏內(nèi)酯 B 164μg、銀杏內(nèi)酯 C 172 μg)2 mL，置100 mL 量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，超聲提取30 min，照2.3項(xiàng)供試品處理方法同法制備，進(jìn)樣10 μL，用上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C的平均回收率分別為100.2%、98.3%、99.3%、98.5%，RSD分別為2.0%、2.1% 、2.6% 、2.4% 。

2.9 溶出度的測(cè)定

取6片，照溶出度測(cè)定法(中國藥典2005年版二部附錄ⅩC第三法)，以0.1 mol/L的鹽酸溶液100 mL為溶劑，(37 ±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為 100 r/min，分別于 3、10、20、30、45、60 min取溶液7 mL(同時(shí)補(bǔ)充等溫介質(zhì)7 mL)濾過，照2.3.1項(xiàng)同法制成供試品溶液并按上述色譜條件測(cè)定(注:溶出度低于50%時(shí)進(jìn)20 μL，其它進(jìn)10 μL)，將峰面積取自然對(duì)數(shù)后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出供試品濃度的自然對(duì)數(shù)，再轉(zhuǎn)換成供試品的量。同時(shí)取同一廠家的樣品10片，照2.3.2項(xiàng)制成自身對(duì)照溶液，同法測(cè)定，并以此做為百分之百的溶出量。再將供試品各時(shí)間點(diǎn)的溶出量與相應(yīng)的百分之百溶出量比較，得出累積溶出百分率，繪制累積溶出曲線(圖2)，結(jié)果見表2。

表2 各廠家樣品的累積溶出量(mg)與溶出率(%)

圖2 各廠家樣品的累積溶出曲線

2.10 溶出參數(shù)的計(jì)算［7］

將各廠家在各時(shí)間的累積溶出度輸入計(jì)算機(jī)，按Weibull分布模型圖 Excel 2003 計(jì)算溶出參數(shù)［6］T50、Td、m并做方差分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 各廠家溶出度參數(shù)

表4 廠家間的F檢驗(yàn)

結(jié)果表明:A廠與B、D、F廠有顯著性差異，B廠與D、F廠，C廠與D、F廠，D廠與E、F廠，E廠與F廠之間的溶出度均有顯著性差異;而A廠與C、E廠，B、C、E 3廠之間的溶出度無顯著性差異。

3 討論

3.1 溶出方法的選擇 由于分散片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定必須在3 min內(nèi)崩解，不必?fù)?dān)心片會(huì)漂浮而影響溶出，故直接選擇漿法，比較了轉(zhuǎn)速為50、75、100 r/min的溶出度，結(jié)果50、75 r/min均低于100 r/min，加快攪拌速度則加快擴(kuò)散，有助于溶出，但過快的攪拌速度與人體內(nèi)的蠕動(dòng)不相符，故選擇100 r/min。

3.2 溶出介質(zhì)及體積的選擇 分別以蒸餾水、0.1 mol/L鹽酸、1.5% 十二烷基硫酸鈉為溶出介質(zhì)，測(cè)定同一廠家(A廠)的藥品在45 min內(nèi)的溶出度，結(jié)果溶出度蒸餾水(77.8%)低于0.1 mol/L鹽酸(96.7%)與1.5%十二烷基硫酸鈉(97.4%)，而0.1 mol/L鹽酸與1.5% 十二烷基硫酸鈉無明顯區(qū)別，故選擇0.1 mol/L鹽酸為溶出介質(zhì)。由于本品內(nèi)酯規(guī)格較小(4.8 mg/片與2.4mg/片)，故選擇介質(zhì)體積為100 mL。

3.3 結(jié)果表明，各廠家樣品的溶出行為有顯著性差異，總體看來A廠的溶出要優(yōu)于其它廠家，且內(nèi)酯的含量也明顯高于其它廠家，說明銀杏酮酯做為第五代銀杏葉提取物，其純度確實(shí)高于普通的銀杏葉提物，這也可能是患者反映的銀杏酮酯類制劑療效優(yōu)于銀杏葉提取物類制劑的因素之一吧。對(duì)相同規(guī)格的不同廠家，其T50大規(guī)格(4.8mg/片)樣品D廠家約為其它廠的2倍，小規(guī)格(2.4 mg/片)樣品的F也是E廠的2倍多，這表明各廠的產(chǎn)品質(zhì)量有差異，這可能也是引起臨床療效不穩(wěn)定的因素之一。

溶出度是評(píng)價(jià)制劑處方、生產(chǎn)工藝、制劑生物利用度的重要指標(biāo)，而中藥制劑由于成分及樣品處理復(fù)雜，使得其建立有效可控的溶出度方法較為困難，中藥分散片常以分散時(shí)限來控制產(chǎn)品質(zhì)量，實(shí)際結(jié)果表明，雖然每個(gè)廠家的樣品均在3 min內(nèi)崩解了，但其溶出度卻存在顯著的差異，因?yàn)闃悠繁澜?、分散后還需經(jīng)歷成分的溶出，而對(duì)一些疏水性成分則更難溶出，因此測(cè)定疏水性成分萜類內(nèi)酯的溶出能更好的反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量，且通過溶出度的檢查，能更好的反映藥品制備工藝的優(yōu)劣，保證臨床療效的穩(wěn)定有效。

［1］中國藥典［S］.一部.2005.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)，WS-228(z-028)-2000，銀杏酮酯［S］.

［3］楊 光，劉曉軍.重新評(píng)價(jià)銀杏葉制劑的質(zhì)量與功效［J］.北京中醫(yī)，1999，(3):60-62.

［4］謝德隆，高 崎，黃新生.中國銀杏藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的建立［J］，世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2002，4(10):61-62.

［5］國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)，YBZ077432005，銀杏酮酯分散片［S］.

［6］陶 紅，張 韜，單 義.RP-HPLC測(cè)定不同廠家銀杏葉片劑中總黃酮醇苷溶出度［J］.中成藥，2009，31(8):1226-1229.

［7］胡祥珍，董 藎.Excel在測(cè)定藥物制劑溶出度參數(shù)數(shù)據(jù)處理中的應(yīng)用［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(1):74-76.