Folin-Ciocalteu比色法測定花椒中多酚含量的研究

吳亮亮,石雪萍,張衛(wèi)明

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 210042;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

花椒屬 (ZanthoxylumL.),屬蕓香科 (Rutaceae),全世界約有 250種,分布于亞洲、美洲、非洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國約有 45種,13個變種,在我國大面積人工栽培的品種主要為青椒(Z.schinifoliumSieb.et Zucc.),又名青川椒、崖椒、野椒、香椒子和花椒 (Z.bungeanumMaxim.)又名川椒、秦椒、蜀椒、大紅袍等[1]?；ń返囊掖继崛∥锞哂休^強(qiáng)的抗氧化能力,主要原因可能與含有酚類、黃酮類和生物堿類等物質(zhì)有關(guān)[2]。目前對花椒中多酚化合物的定量測定尚未見報道。為了更深入的研究花椒抗氧化作用,本研究采用 Folin-Ciocalteu比色法對花椒的多酚含量的進(jìn)行了測定,并對常見幾種花椒多酚含量進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:茂漢大紅袍、韓城大紅袍、云南青花椒及四川青花椒。市售。

試劑:Folin-Ciocalteu試劑 (鉬酸鈉、鎢酸鈉、85%濃磷酸、37%濃鹽酸、硫酸鋰、液溴)、10%Na2CO3、均為國產(chǎn)分析純;對照品沒食子酸,化學(xué)純,上海國藥試劑有限公司。

儀器:T6紫外 /可見光分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市江南儀器廠);高速萬能粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 (河南省泰康科教儀器廠);KQ3200E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將茂漢大紅袍、韓城大紅袍、四川青花椒及云南青花椒果皮粉碎,過 40目篩。各稱取 1 g,用 30 mL 60%的乙醇于 25℃條件下,超聲 0.5 h提取,過濾收集提取液。

1.2.2 Folin-Ciocalteu試劑配制[3]

在 1L磨口回流裝置內(nèi)加入 50 g鎢酸鈉,12.5 g鉬酸鈉,350 mL蒸餾水,25 mL 85%濃磷酸及 50 mL 37%濃鹽酸,充分混勻以小火回流 10 h,加入 75 g硫酸鋰,25 mL蒸餾水,數(shù)滴溴水,然后開口繼續(xù)加熱至沸,維持 15 min,驅(qū)除多余的溴,溶液呈金黃色,冷卻后補(bǔ)足蒸餾水至 500 mL,置于冰箱中長期冷藏備用,臨用時稀釋 1倍。

1.2.3 樣品測定

準(zhǔn)確吸取 0.1 mL樣品液于 100 mL容量瓶中,加入 50 mL蒸餾水,再加入 4 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻,靜置 4～5 min,加入 8 mL 10%Na2CO3,用蒸餾水定容,置于 25℃的恒溫水浴鍋中 120 min,顯色后于最大波長下測定吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相對應(yīng)的濃度,并按下列公式計算出多酚的含量。

式中,ω為多酚含量 (mg/g);C為沒食子酸質(zhì)量濃度 (μg/mL);V為提取液體積 (mL);N為稀釋倍數(shù);M為取樣量 (g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長的選擇

準(zhǔn)確吸取 0.5 mL濃度為 100μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和 4 mL Folin-Ciocalteu試劑于 10 mL容量瓶中搖勻,靜置 4～5 min,加入 5 mL 10%Na2CO3,搖勻置于 25℃的恒溫水浴鍋中 120 min,用蒸餾水定容,顯色后置于紫外可見分光光度計中,在波長 600～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的紫外掃描圖譜

在 600～900 nm之間,吸收隨著波長的增大先增大后減少,在 765 nm處吸光度最大。因此選擇765 nm作為多酚含量測定的檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[4]

用蒸餾水溶解 0.1 g沒食子酸,定容至 100 mL,得 1.0 mg/mL沒食子酸溶液。分別移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL到 100 mL容量瓶中 ,加入 50 mL蒸餾水,加入 4 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻,靜置 4～5 min,加入 8 mL 10%Na2CO3,用蒸餾水定容,置于 30℃的恒溫水浴鍋中 120 min,顯色后于765 nm波長下測定吸光度,可得濃度與吸光度的曲線。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示,沒食子酸在濃度為 1～6μg/mL內(nèi),與其吸光度呈良好的線性關(guān)系,在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為 y=0.1315x+0.0225,相關(guān)系數(shù) R2=0.993 8。

2.3 Folin-Ciocalteu試劑與 10%Na2CO3比例的選擇

準(zhǔn)確吸取 0.1 mL樣品 (茂漢大紅袍)于 100 mL的容量瓶中定容,加入 50 mL蒸餾水,再加入 2 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻,靜置 4～5 min,加入不同體積的 10%Na2CO3,使 Folin-Ciocalteu試劑與10%Na2CO3體積之比分別為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,用蒸餾水定容,置于 25℃的恒溫水浴鍋中 120 min,顯色后于 765 nm波長下測定吸光值。結(jié)果見圖3。

圖3 試劑比例與吸光度的關(guān)系

2.4 反應(yīng)時間的選擇

準(zhǔn)確吸取 0.1 mL樣品 (茂漢大紅袍)于 100 mL的容量瓶中定容,加入 50 mL蒸餾水,再加入 4 mL Folin-Ciocalteu試劑搖勻,靜置 4～5 min,加入 8 mL的 10%Na2CO3,用蒸餾水定容,置于 25℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng) 30～150 min,顯色后于 765 nm波長下測定吸光度。結(jié)果見圖4。

圖4 反應(yīng)時間與吸光度的關(guān)系

隨著反應(yīng)時間的延長,吸光度先增大,120 min之后增加不明顯,曲線變得平坦,因此選擇 120 min作為花椒多酚含量測定的操作條件。

2.5 四種花椒多酚含量比較

按照 1.2.4方法對四種花椒提取液進(jìn)行多酚測定,結(jié)果見圖5。

圖5 不同花椒品種多酚含量

由圖5可知,四川青花椒的多酚含量最高,達(dá)68.7 mg/g,其次是韓城大紅袍 67.9 mg/g。云南青花椒 62.7 mg/g,茂漢大紅袍 61.5 mg/g。

3 結(jié) 論

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,采用 Folin-Ciocalteu比色法測定花椒多酚含量時,多酚含量在 1～6μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。通過對四種不同種類花椒多酚含量的測定可知,不同種類花椒中多酚含量各不相同,其中四川青花椒多酚含量最高,可達(dá) 68.7 mg/g。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1981.

[2] 豆海港,陳文學(xué),仇厚援,等.花椒提取物抗氧化作用研究[J].食品研究與開發(fā),2006,27(7):14-16.

[3] SI NGLETON V L,ROSSIJ A.Colorimetry of total phenolics with phosphomoly bdic-phosphotungstic acid regents[J].Am J Enol Vitic,1965,16:144-158.

[4] 王岸娜,徐山寶,劉小彥,等.福林法測定獼猴桃多酚含量的研究[J].食品科學(xué),2008,29(7):398-401.