益生菌中膽鹽水解酶作用機(jī)理研究現(xiàn)狀

任婧，吳正鈞，王蔭榆

（光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心基礎(chǔ)研究部，上海 200436）

益生菌中膽鹽水解酶作用機(jī)理研究現(xiàn)狀

任婧，吳正鈞，王蔭榆

（光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心基礎(chǔ)研究部，上海 200436）

對乳酸菌中膽鹽水解酶研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析，從編碼基因、蛋白氨基酸結(jié)構(gòu)以及酶與腸道間密切關(guān)系等方面入手，闡述了腸道益生菌通過膽鹽水解酶對膽鹽的水解，可以達(dá)到耐受腸道膽鹽壓力，增強(qiáng)細(xì)菌表面對體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抵抗能力建立長期感染，促進(jìn)在高等動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌的定殖，降低血清膽固醇水平等作用，為最終治愈高膽固醇血癥提供了良好的解決方案。

膽鹽；膽鹽水解酶；bsh益生菌；高膽固醇血癥

0 引 言

益生菌是指那些對人、動(dòng)物產(chǎn)生有益影響的活性微生物，通過攝入一定的數(shù)量后，對宿主可產(chǎn)生一種或多種特殊的、超越其固有基本營養(yǎng)價(jià)值的保健作用。動(dòng)物對益生菌具有選擇性，通常體現(xiàn)在很多物理壓力方面，如低pH值、耐膽汁、以及滲透壓和功能性選擇等；而可以耐受膽鹽是益生菌被選擇的重要特征。本文綜述了益生菌中膽鹽水解酶作用機(jī)理研究現(xiàn)狀。

1 膽酸循環(huán)及膽鹽水解過程

在哺乳動(dòng)物中膽固醇（cholesterol）代謝終產(chǎn)物就是在肝臟中從頭合成膽汁酸。膽汁酸通過與牛磺酸（taurine）或甘氨酸（glycine）交聯(lián)形成膽鹽（bile salt），然后隨膽汁一起分泌。膽汁是一種黃綠色溶液，主要成分除膽汁酸外還包括膽固醇、磷脂以及膽綠素等。它的功能主要是作為生物溶劑乳化和溶解脂肪，因此在脂肪代謝中具有重要意義。另外它也具有潛在的抗菌活性，因?yàn)榭梢匀芙馕⑸锬ぁ３跫壞懼?，包括膽酸（cholic acid）及牛黃鵝去氧膽酸（chenodeoxycholicacid）在肝臟中從膽固醇從頭合成。疏水的甾醇核通過與甘氨酸或牛磺酸交聯(lián)可溶性增加，因此形成兩性的可以溶解脂肪的混合微膠粒。隨著食物中脂肪的攝入，它們與脂肪混合、乳化，為下一步在十二指腸吸收做好準(zhǔn)備。膽汁酸通過腸肝再循環(huán)在體內(nèi)保持穩(wěn)定的水平。在整個(gè)腸道內(nèi)游離和結(jié)合膽汁酸通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式被吸收，在回腸末端則以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)形式吸收。被重吸收的膽汁酸進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)被肝實(shí)細(xì)胞攝入重交聯(lián)，再次釋放進(jìn)入膽汁[1]，如圖1。

近日來很多研究開始嘗試，利用哺乳動(dòng)物腸道微生物群與膽鹽交聯(lián)，來降低高膽固醇血癥患者血清中的膽固醇，以及預(yù)防正常膽固醇水平人群中高膽固醇血癥的發(fā)生。腸道微生物對膽固醇調(diào)控很重要一部分是通過膽鹽水解酶（Bile Salt Hydrolase,BSH）對交聯(lián)膽鹽水解，從而降低血清膽固醇含量來達(dá)到的。BSH催化?；撬峄蚋拾彼崤c甾醇基礎(chǔ)的膽汁酸之間的氨基骨架水解。去交聯(lián)的膽酸具有較低的水溶性，很容易被分泌到糞便中。由于糞便膽酸流失以及膽鹽的降低使得肝臟增加膽固醇轉(zhuǎn)化為膽鹽來維持膽鹽代謝平衡。已有實(shí)驗(yàn)證明，口服含膽鹽水解酶的乳酸菌可以在動(dòng)物及人體內(nèi)降低血清中膽固醇水平。

對于水解膽鹽活力最常用的檢測方式即在瓊脂平板上觀察菌落周圍水解圈的出現(xiàn)。由于乳酸菌發(fā)酵在腸道內(nèi)有時(shí)會形成局部pH較低的微環(huán)境，未交聯(lián)的膽酸相比交聯(lián)狀態(tài)的膽酸會對細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，從而產(chǎn)生沉淀。這是我們在瓊脂平板檢測BSH活性的基礎(chǔ)，如圖2[2]。

2 膽鹽水解酶bsh編碼基因背景研究

BSH活性已經(jīng)在乳酸菌Lactobacillus、雙歧桿菌Bifidobacterium、腸球菌Enterococcus梭菌Clostridium以及 類菌體Bacteroides等細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)[3-7]。其中乳酸菌及雙歧桿菌被常規(guī)認(rèn)作益生菌，而類菌體梭菌以及腸球菌則是腸道共生菌。目前為止，尚未在生活環(huán)境缺乏膽鹽的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)具有BSH活性的菌株。除了兩株類菌體以外，其他BSH活性陽性細(xì)菌均為革蘭氏陽性菌。在其他所有腸道革蘭氏陰性菌中，包括大腸桿菌Escherichia coli以及腸道沙門氏菌Salmonella enterica等均未發(fā)現(xiàn)BSH活性，也沒有找到bsh同源基因。在公共數(shù)據(jù)庫中包括美國國立衛(wèi)生院基因組數(shù)據(jù)庫http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/以及美國Joint基因組研究所微生物基因組網(wǎng)站http：//genome.jgi-psf.org/，我們可以檢索到在已發(fā)現(xiàn)的益生菌中存在的編碼BSH酶的基因組序列，如圖3[8]。包括產(chǎn)氣莢膜桿菌C.perfringens，植物乳桿菌La.plantarum，約氏乳桿菌La.johnsonii，長雙歧桿菌Bi.Longum，兩歧雙歧桿菌Bi.Bifidum，青春雙歧桿菌Bi.Adolescentis，以及單增李斯特氏菌Listeria monocytogenes等等.通過微生物基因組學(xué)的分析很多bsh同源基因以及預(yù)測基因也已被發(fā)現(xiàn)。有趣的是，在有些菌株如植物乳桿菌WCFS1中我們發(fā)現(xiàn)不止一個(gè)同源基因的存在[9]。同時(shí)存在多個(gè)bsh同源基因?qū)τ谘芯縝sh基因功能具有重要意義。

在植物乳桿菌中預(yù)測存在4個(gè)相關(guān)基因，分別命名為bsh1到bsh4。他們分散在整個(gè)基因組上，之間的氨基酸同源度從21%到39%。Lambert及Bongers等人對植物乳桿菌WCFS1中的4個(gè)bsh基因進(jìn)行了深入研究，在bsh缺乏的乳酸乳球菌中分別過表達(dá)這4個(gè)bsh基因，并且構(gòu)建了1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)以及全部bsh基因敲除模型，對每個(gè)基因水解底物能力及對底物耐受性進(jìn)行了相關(guān)評價(jià)。并且對若干株植物乳桿菌進(jìn)行全基因組雜交（complete genome hybridization,CGH）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，bsh2、bsh3及bsh4在植物乳桿菌各菌株間十分保守，具有重要的生理學(xué)意義，而bsh1基因則和植物乳桿菌BSH活性密切相關(guān)，如圖4[9]。

3 BSH膽鹽水解酶氨基酸結(jié)構(gòu)及底物識別分析

在各個(gè)種屬之間bsh編碼區(qū)的調(diào)節(jié)和組織都有所差異。BSH酶的亞基組成、大小、最適pH值、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、底物特異性等等也變化較大。然而這些BSH卻擁有一些保守的活性氨基酸位點(diǎn)：cysteine 2（Cys2）,arginine 18（Arg18）,aspartic acid 21（Asp21）,asparagines 175（Asn175）,and arginine 228（Arg228）（圖5）。

膽鹽水解酶屬于膽酰甘氨酸水解酶家族（choloylglycine hydrolase family）。 青 霉 素 酰 胺 酶（penicillin amidases）也屬于該家族成員，該酶可水解青霉素（penicillin）變?yōu)?-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillinic acid），這一產(chǎn)物被廣泛應(yīng)用于半合成抗生素的工業(yè)生產(chǎn)中。膽鹽水解酶和青霉素酰胺酶都被歸類為親核水解酶（N-terminal nucleophilic（Ntn）hydrolases），在N端帶有半胱氨酸（cysteine 2，Cys2）殘基。在蛋白自身酶解過程中初始的甲硫氨酸Met被去除后Cys2便成為催化中心，這也是Ntn水解酶超家族的共同點(diǎn)。近日產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens中的BSH酶被結(jié)晶出來，同時(shí)發(fā)現(xiàn)以脫輔酶（apoenzyme）及與?；敲撗?膽 酸 鹽 （taurodeoxycholate）（TDCA;hydrolyzed product）結(jié)合成復(fù)合物形式存在。結(jié)構(gòu)分析表明Cys2殘基處于被親核攻擊的位置。已有實(shí)驗(yàn)表明Cys2的巰基（SH）基團(tuán)對膽鹽水解酶催化能力十分重要，在兩歧雙歧桿菌中將BSH帶有硫醇基的Cys2置換為帶羥基的親核氨基酸Ser或Thr，則BSH失去活性[10]。在長雙歧桿菌中若把BSH的Cys2置換為Ala，同樣得到的是失活蛋白[11]。

圖4中，橫坐標(biāo)從左到右依次代表：WCFS1為 野 生 型 ；NZ5330為 Δbsh2，Δbsh3，Δbsh4；NZ5328為Δbsh1，Δbsh3，Δbsh4；NZ5326為Δbsh1，Δbsh2，Δbsh4；NZ5324為Δbsh1，Δbsh2，Δbsh3；NZ5332為Δbsh1，Δbsh2，Δbsh3，Δbsh4。

同時(shí)和球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）的青霉素V?；福╬enicillin V amidase）具有高度同源性。青霉素V?；傅膖yrosine 82（Tyr82）與BSH酶氨基酸Asn82的差異由于不同底物空間需要的差異引起。

BSH對底物膽酸的識別很可能既通過對膽酸甾類化合物的識別，也通過氨基酸集團(tuán)的識別。Moser和Savage等人曾經(jīng)報(bào)道在布氏乳桿菌L.buchneri JCM1069可以表達(dá)?；撬崦撗跄懰崴饷富钚?，但是卻不具有?；撬崮懰崴饷富钚訹12]。?；撬崦撗跄懰崤c牛磺酸膽酸都具有?；撬岬陌被岵糠郑欢麄兊溺薮疾糠謪s不同。另外在嗜酸乳桿菌NCFM中，當(dāng)使bshA基因失活，該菌株水解含鵝脫氧膽酸甾醇部分 （如TCDCA和GCDCA）的膽鹽活力降低[13]。不過在大多數(shù)動(dòng)力學(xué)研究報(bào)告中，底物識別仍然是以氨基酸部分優(yōu)先識別。大多數(shù)BSH酶水解甘氨酸交聯(lián)的膽鹽能力要強(qiáng)于?；撬峤宦?lián)的膽鹽。序列分析表明雖然BSH活性位點(diǎn)的氨基酸十分保守，然而底物識別的位點(diǎn)卻不是十分保守。

4 BSH與腸道的關(guān)系

膽鹽水解與耐膽鹽能力：因?yàn)榫哂腥ソ宦?lián)膽鹽的能力，膽鹽水解酶被認(rèn)為可能具有解除膽鹽毒性的作用。有4個(gè)獨(dú)立研究小組利用野生型和bsh突變型細(xì)菌對膽鹽水解與膽鹽耐受力之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。在用亞硝基胍對食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus）進(jìn)行突變篩選中，得到一株BSH活力顯著下降的突變株，在膽鹽存在的情況下生長速度明顯減緩[14]。在植物乳桿菌和單增李斯特菌中bsh基因產(chǎn)生突變，其對膽汁和膽鹽十分敏感，耐受力明顯下降[15]。然而BSH酶在膽汁耐受過程中的作用機(jī)理目前仍不明確。有假說提出，質(zhì)子化未解離的膽鹽可以如同有機(jī)酸一般通過細(xì)胞內(nèi)酸化產(chǎn)生毒性，而具BSH活力細(xì)胞可以形成弱結(jié)合對抗物保護(hù)自己，對捕獲以及轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子造成的PH下降具有緩沖作用。

在人體內(nèi)甘氨酸結(jié)合膽鹽與牛磺酸結(jié)合膽鹽比例為3∶1。體外實(shí)驗(yàn)表明，?；撬峤宦?lián)膽鹽通常在任何pH情況下對細(xì)菌都僅有輕微影響，而甘氨酸交聯(lián)的膽鹽在酸性條件下以及bsh突變時(shí)則具有非常強(qiáng)的毒性。因此我們認(rèn)為BSH在低pH條件下對解除甘氨酸交聯(lián)膽鹽毒性十分重要。當(dāng)膽汁進(jìn)入十二指腸時(shí)胃部會產(chǎn)生反酸，或者在腸道局部會產(chǎn)生pH較低的微環(huán)境，這時(shí)BSH意義重大。有文獻(xiàn)報(bào)道BSHs通常會優(yōu)先水解甘氨酸結(jié)合的膽鹽,也有研究小組證實(shí)BSHs會傾向于微酸的環(huán)境（5到6之間）。這些報(bào)道是對這一結(jié)論有力的支持。

細(xì)菌膜特性改變：溶菌酶溶酶體（bacteriolytic enzymes lysozyme）、磷脂酶以及抗菌肽等都是高等生物腸道內(nèi)體內(nèi)免疫的重要執(zhí)行者。細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)的組成、滲透性、流動(dòng)性、凈電荷以及疏水性都與細(xì)菌對寄主防御能力息息相關(guān)。有研究提出BSH可以促進(jìn)膽固醇或膽汁參與細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)構(gòu)成，使膜抗張強(qiáng)度增加，改變膜流動(dòng)性及電荷等。BSH對細(xì)胞表面的改變可以增強(qiáng)細(xì)菌表面對體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抵抗能力，這種抵抗機(jī)制對建立長期感染具有重要作用。在商業(yè)中對于篩選強(qiáng)力BSH酶對抗BSH陰性病原菌效果顯著。

促進(jìn)高等動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌的定植：在BSH作用下膽鹽去交聯(lián)所產(chǎn)生的氨基酸，可以當(dāng)作碳源、氮源以及能量來源被廣泛利用。甘氨酸的代謝產(chǎn)物為氨和二氧化碳，而?；撬釀t可被代謝為氨、二氧化碳及硫酸鹽。因此具有水解能力的菌株可能在生長時(shí)獲得營養(yǎng)優(yōu)勢。Huijghebaert等人和Van Eldere等人[16]曾經(jīng)觀察到一株BSH陽性梭菌利用水解釋放的?；撬嶙鳛殡娮邮荏w，因此在牛磺酸和?；撬峤宦?lián)膽鹽存在的情況下生長速度明顯加快。在長雙歧桿菌中也觀察到，bsh基因總是同時(shí)伴隨編碼谷氨酰胺合成腺苷轉(zhuǎn)移酶glnE同源基因共轉(zhuǎn)錄，該基因同時(shí)也是氮元素調(diào)節(jié)級聯(lián)反應(yīng)的一部分。

降低血清膽固醇：高膽固醇血癥近年來被認(rèn)為是冠狀動(dòng)脈心臟病的罪魁禍?zhǔn)?。雖然已有不少治療藥物如他汀類藥物（tatins）及膽酸結(jié)合劑等，但存在價(jià)格昂貴、副作用大等問題?？诜嫔壳氨粡V泛報(bào)道具有明顯降低膽固醇的能力，病例中約有22%到33%的患者膽固醇含量明顯下降[17]。而小鼠實(shí)驗(yàn)也表明在肥胖小鼠飲食中添加益生菌可阻止膽固醇水平繼續(xù)提高。益生菌降低膽固醇水平有多種途徑，包括細(xì)菌對膽固醇同化作用，細(xì)菌胞壁結(jié)合膽固醇，以及短鏈脂肪酸發(fā)酵終產(chǎn)物作用等等，但BSH降低膽固醇是非常重要的途徑。去交聯(lián)的膽酸比交聯(lián)狀態(tài)膽酸更不易吸收，因此大量自由膽酸通過糞便排泄出體外。同樣自由膽酸也使腸道對脂肪的溶解及吸收效率降低。因此去交聯(lián)膽酸可以導(dǎo)致血清膽固醇含量降低，一方面為補(bǔ)償通過糞便排泄損失的自由膽酸而要求膽固醇從頭合成膽酸，另一方面降低膽固醇溶解度減少了腸道對其的吸收。

5 展 望

綜上所述，膽鹽水解對于脊椎動(dòng)物脂肪代謝起著重要作用。在食物脂肪被攝入后，隨著帶有膽鹽水解酶活力的腸道益生菌作用下，血清膽固醇被降低，腸道菌定殖能力提高，從而更好地維持腸道生態(tài)平衡。不過在眾多的研究中仍存在一些不同看法。有研究者提出，由于去交聯(lián)膽酸相對乳化食物脂肪和形成微粒能力降低會使得一部分正常脂肪吸收被影響。研究表明在雞中BSH活性和雞的發(fā)育不良有關(guān)[18]，但在小鼠中未見報(bào)道。另外也有稱去交聯(lián)膽酸產(chǎn)生的二級膽酸可能對腸道功能造成一定紊亂。有一些實(shí)驗(yàn)也報(bào)道在膽鹽耐受力與BSH活性之間未找到直接證據(jù)，但他們有的使用了牛磺酸結(jié)合膽酸而非BSH傾向結(jié)合的甘氨酸膽酸來檢測BSH活性，有的則采用非等位基因菌株來研究，這對于腸道內(nèi)復(fù)雜的影響因素來說不是合適的研究對象。因此這些研究并不能說明BSH真正的活性與耐膽鹽能力關(guān)系。隨著對BSH酶研究的越來越多，我們對于其作用機(jī)制和原理也會了解更多，這使我們闡明腸道微生物選擇生存機(jī)理成為可能，同時(shí)也為發(fā)展更強(qiáng)健的益生菌提供了很好的研究基礎(chǔ)。

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Research progress on mechanism of bile salt hydrolase in probiotics

REN Jing,WU Zheng-jun,WANG Yin-yu
（Basic Research Department,Technical Center of Bright Dairy&Food Co.Ltd.,Shanghai 200436,China）

Bile salt hydrolysis plays an important role in digestion of lipids and fat metabolism in vertebrates.We analyse the research progress of bile salt hydrolase base on the works of coding sequences,structure of amino acids and relationship between bile salt hydrolase and intestine.It is shown that the intestinal microbiota can resistant the bile salt stress and increase the ability of resistance of innate immune system.This give a great hint that we can imagine the day hypercholesterolemia be cured and serum lipids are reduced by intestinal microbiota colonization.

bile salt；bile salt hydrolase；bsh probiotics；hypercholesterolemia

Q556

B

1001-2230（2010）02-0045-04

2009-09-11

任婧（1980-），女，博士，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)及遺傳學(xué)。