干酪乳清中乳鐵蛋白分離純化的研究

蔣超，張彧，陳歷俊，姜鐵民

（1大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

干酪乳清中乳鐵蛋白分離純化的研究

蔣超1.2，張彧1，陳歷俊2，姜鐵民2

（1大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；2北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

采用超濾、陽(yáng)離子交換層析方法從熱鈣法處理過(guò)的干酪乳清中分離純化乳鐵蛋白。結(jié)果表明，經(jīng)預(yù)處理后的干酪乳清加入經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖液（pH值為8.0）平衡的樹(shù)脂中，分別用濃度為0.3 mol/L和0.8 mol/L的NaCl進(jìn)行階躍洗脫，所得乳鐵蛋白經(jīng)SDS-PAGE和免疫印跡法（Western Blotting）檢測(cè)，純度達(dá)93.6%。

干酪乳清；乳鐵蛋白；離子交換層析

0 引 言

乳清作為生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)物，含有多種功能性蛋白，如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等[1]，其中乳鐵蛋白（Lactoferrin,LF）具有促進(jìn)鐵的吸收，抑菌、抗病毒感染，調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的生成，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力等生理作用[2-5]，已成為當(dāng)前研究的“熱點(diǎn)”。

在我國(guó)，對(duì)乳鐵蛋白分離純化的研究多以牛初乳和脫脂乳為原料[6-8]，而直接從干酪乳清中分離純化乳鐵蛋白的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。相比牛初乳和脫脂乳，干酪乳清存在混濁度較高，處理過(guò)程復(fù)雜等問(wèn)題，因此從乳清中分離純化乳鐵蛋白較困難。本研究以干酪乳清為原料，經(jīng)熱鈣法澄清乳清，并優(yōu)化離子交換層析條件，建立適合工業(yè)化生產(chǎn)乳鐵蛋白的工藝路線，為合理利用乳清資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及儀器

干酪乳清，乳鐵蛋白標(biāo)品，乳鐵蛋白抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗羊IgG，BCIP/NBT，CM-Sepharose FastFlow。

穩(wěn)壓電泳儀，GIS-2010凝膠成像系統(tǒng)，板式超濾設(shè)備，YC-1層析實(shí)驗(yàn)冷柜，ALPHA1-2冷凍干燥機(jī)，LC-6M大容量冷凍離心機(jī)，Cintra 20分光光度計(jì)。

1.2 干酪乳清預(yù)處理

采用熱鈣法預(yù)處理干酪乳清[9]，向干酪乳清中加入氯化鈣，攪拌后用濃度為2 mol/L的NaOH調(diào)pH值至7.4，在50℃保溫8 min，冷凍離心8 min后取上清液，通過(guò)測(cè)定上清液的混濁度判斷乳清處理程度[10]。將獲得的上清液通過(guò)超濾，進(jìn)一步去除乳糖等小分子雜質(zhì)，制備層析樣品。

1.3 離子交換層析

乳清經(jīng)預(yù)處理后，加入經(jīng)濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡的CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱，以30 cm/h的速度進(jìn)行洗脫。同時(shí)，根據(jù)收集乳鐵蛋白的純度及回收率結(jié)果，優(yōu)化層析條件，提高乳鐵蛋白的分離純化效果。

1.3.1 平衡緩沖液pH值選擇

選擇不同pH值 （6.3～8.0）緩沖液平衡離子交換樹(shù)脂，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)樹(shù)脂對(duì)蛋白的吸附程度，確定平衡緩沖液pH值范圍；并在該范圍內(nèi)，選取不同pH值緩沖液平衡樹(shù)脂，通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附確定最適pH值。

1.3.2 洗脫離子強(qiáng)度選擇

用含NaCl濃度為0.3～1 mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡樹(shù)脂，通過(guò)檢測(cè)樹(shù)脂與乳鐵蛋白結(jié)合程度確定洗脫鹽范圍；在選定范圍內(nèi)，選取不同鹽濃度通過(guò)階躍洗脫收集乳鐵蛋白。

1.3.3 洗脫方法選擇

使用5倍于樹(shù)脂體積pH值為8.0濃度為0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液平衡樹(shù)脂，采用兩種洗脫方法分離乳鐵蛋白。方法一采用濃度為0～1 mol/L的NaCl磷酸鹽緩沖液梯度洗脫；方法二采用1.3.2確定的最適洗脫離子強(qiáng)度 （含有濃度為0.3和0.8 mol/L的NaCl磷酸鹽緩沖液）進(jìn)行階躍洗脫。通過(guò)比較確定最佳洗脫方法。

1.4 蛋白檢測(cè)方法

（1）總蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定：原料預(yù)處理過(guò)程中總蛋白質(zhì)量濃度檢測(cè)采用Lowry法[11]。

（2）乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定：原料及凍干后乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定采用SDS-PAGE法[12]，并采用Bandscan分析軟件對(duì)電泳條帶純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 乳鐵蛋白免疫原性分析

將純化的乳鐵蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過(guò)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，利用Western Blotting進(jìn)行免疫原性分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總蛋白、脂肪質(zhì)量濃度及混濁度變化

由于車(chē)間生產(chǎn)干酪的乳清，混濁度很高，其中殘余酪蛋白、脂類會(huì)嚴(yán)重影響分離效果。因此，在上樣液準(zhǔn)備前需進(jìn)行處理。表1為熱鈣處理對(duì)乳清中總蛋白、乳鐵蛋白質(zhì)量濃度及混濁度的影響。由表1可以看出，熱鈣處理后總蛋白及乳鐵蛋白質(zhì)量濃度有所下降，原因可能是在處理過(guò)程中殘余酪蛋白減少以及脂肪、酪蛋白與乳鐵蛋白結(jié)合減少所致。但經(jīng)過(guò)處理后的乳清，混濁度（500 nm吸光值）由2.74減小到0.07，可以極大改善后期分離純化的效率。

表1 熱鈣處理對(duì)乳清的影響

2.2 乳鐵蛋白分離純化條件的確定

2.2.1 平衡緩沖液pH值

平衡緩沖液pH值主要取決于與被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳鐵蛋白等電點(diǎn)在8.0～9.0[14]，因此選擇pH值小于8.0的緩沖液平衡離子交換樹(shù)脂，通過(guò)電泳檢測(cè)樹(shù)脂與目的蛋白及雜蛋白的結(jié)合程度，確定平衡緩沖液pH值范圍，結(jié)果如圖1所示。圖1中，1為乳鐵蛋白標(biāo)品；2～9為平衡緩沖液pH值分別為6.3，6.5，6.8，7.0，7.3，7.5，7.8，8.0。

由圖1可以看出，在pH值為6.3～8.0范圍內(nèi)，每毫升樹(shù)脂都可以結(jié)合15 mg左右的乳鐵蛋白，但是pH值低于6.8時(shí)，雜蛋白也與樹(shù)脂結(jié)合，這在洗脫過(guò)程中可能會(huì)影響到乳鐵蛋白的純度，因此確定平衡緩沖液pH值范圍為6.8～8.0。

在確定緩沖液pH值范圍條件下，分別用pH值為6.8，7.3，7.8，8.0磷酸鹽緩沖液平衡樹(shù)脂，通過(guò)對(duì)洗脫蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，乳鐵蛋白得率及純度隨著平衡緩沖液pH值增加逐漸增加，在平衡緩沖液pH值為8.0時(shí)，獲得的乳鐵蛋白得率和純度均高于其他pH值，因此，確定平衡緩沖液最適pH值為8.0。

表2 不同緩沖液pH值效果比較

2.2.2 洗脫離子強(qiáng)度

在優(yōu)化洗脫離子強(qiáng)度前，首先確定了洗脫鹽濃度范圍，選擇含有NaCl濃度為0.3～1 mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡樹(shù)脂，將乳鐵蛋白樣品加入樹(shù)脂中，通過(guò)SDSPAGE電泳檢測(cè)樹(shù)脂上清液中蛋白，由電泳圖可知（圖2），在洗脫鹽濃度為0.3 mol/L時(shí)，沒(méi)有乳鐵蛋白條帶，這說(shuō)明在此濃度下，可以很好的洗脫雜蛋白，而不會(huì)導(dǎo)致乳鐵蛋白的損失；當(dāng)隨著洗脫離子強(qiáng)度達(dá)到0.6 mol/L后，出現(xiàn)明顯的蛋白條帶并逐漸變寬，但在濃度達(dá)到0.8 mol/L之后，條帶不再變化，因此在試驗(yàn)中選擇濃度為0.6，0.8，1.0 mol/L的NaCl洗脫乳鐵蛋白，確定最佳洗脫離子強(qiáng)度。圖2中，1為乳鐵蛋白標(biāo)品；2～9為洗脫鹽質(zhì)量濃度為0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mol/L。

按照電泳確定的洗脫離子強(qiáng)度范圍，在優(yōu)化試驗(yàn)中選擇濃度為0.3 mol/L的NaCl洗脫雜蛋白，然后分別采用濃度為0.6，0.8，1.0 mol/L的NaCl洗脫乳鐵蛋白。結(jié)果表明，采用濃度為0.8 mol/L的NaCl洗脫乳鐵蛋白的得率為29.56%，純度為93.60%，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，雖然純度比濃度為0.6 mol/L的NaCl洗脫略低，但是得率是最高的。因此，從工業(yè)化生產(chǎn)考慮，確定最佳洗脫鹽濃度為0.8 mol/L的NaCl。

表3 洗脫鹽濃度效果比較

2.2.3 洗脫方法

為確定乳鐵蛋白最佳洗脫方法，試驗(yàn)中比較了梯度洗脫和階躍洗脫兩種方法對(duì)乳鐵蛋白分離效果的影響，由收集峰圖可知（圖3），采用梯度洗脫，收集峰變化緩慢，很難將乳鐵蛋白收集，原因可能是流動(dòng)相的濃度增大太慢，導(dǎo)致峰型變寬，影響分離效果；而換用濃度為0.3 mol/L與0.8 mol/L的NaCl進(jìn)行階躍洗脫，則會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)尖銳的峰，可以很好的收集乳鐵蛋白。

根據(jù)對(duì)不同洗脫方法收集的乳鐵蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，在上樣量相同條件下，階躍洗脫與梯度洗脫相比，用時(shí)較短，得率較高。因此，試驗(yàn)中選擇階躍洗脫，這樣可以省去梯度洗脫裝置、節(jié)約時(shí)間，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。

表4 梯度洗脫與階躍洗脫結(jié)果比較

2.3 優(yōu)化后分離LF的SDS-PAGE及WesternBlotting結(jié)果

最終對(duì)純化的蛋白與乳鐵蛋白標(biāo)品進(jìn)行SDSPAGE電泳和Western Blotting檢測(cè)。圖4為乳鐵蛋白的SDS-PAGE電泳及Western Blotting結(jié)果。 由圖4（a）可以看出，純化蛋白分子量在78 000 u左右，與標(biāo)準(zhǔn)乳鐵蛋白分子量一致；由圖4（b）可以看出，樣品經(jīng)Western Blotting檢測(cè)，在標(biāo)準(zhǔn)品相同位置出現(xiàn)特異性條帶，由此證明分離純化的乳鐵蛋白具有免疫活性；在試驗(yàn)中采用的一抗是通過(guò)人乳鐵蛋白制備的抗體，這說(shuō)明牛乳鐵蛋白與人乳鐵蛋白有較高同源性，免疫血清有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)能力，這與其他人報(bào)道的試驗(yàn)結(jié)果是一致的[15]。圖4中，M為marker（低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白）；A為乳鐵蛋白標(biāo)品；B為分離純化樣品；1為乳鐵蛋白標(biāo)品；2為分離純化樣品。

3 結(jié) 論

本研究主要以生產(chǎn)干酪的副產(chǎn)物乳清為原料分離純化乳鐵蛋白，通過(guò)熱鈣法預(yù)處理干酪乳清，經(jīng)超濾、離子交換層析，最終獲得分子量為78 000 u，純度為93.6%的乳鐵蛋白，此法簡(jiǎn)單易行，成本較低，為工業(yè)化分離乳鐵蛋白及乳清的合理利用提供了理論依據(jù)。

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Study on separation and purification of lactoferrin in cheese whey

JIANG Chao1,2,ZHANG Yu1,CHEN Li-jun2,JIANG Tie-min2
（1.Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Beijing Sanyuan Foods Co.Ltd.,Beijing 100085,China）

This paper was intended to separate and purify lactoferrin from cheese whey through thermocalcic?precipitation,ultrafiltration and cation-exchange chromatography.It was showed that the pretreated cheese whey was applied to the resin,which was previously equilibrated on static state with phosphate buffer（pH=8.0）at 4℃,and eluted with 0.3 mol/L and 0.8 mol/L NaCl respectively in two stages.In addition,lactoferrin was analyzed qualitatively and quantitatively by Western Blotting and SDS-PAGE.The purity of lactoferrin product reached 93.6%.

cheese whey;lactoferrin;cation-exchange chromatography

TS252.59

A

1001-2230（2010）02-0010-03

2009-09-04

蔣超（1983-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。

陳歷俊