血管內(nèi)皮細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療疾病的相關(guān)研究

冉昌麗　李耀彩　張其梅　彭　玉

【摘要】血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是機體內(nèi)促進血管生長最主要的生長因子,VEGF特異性地作用于內(nèi)皮細胞,促進其增殖和血管生成。因此,以VEGF為基礎(chǔ)的治療性血管生成的研究備受關(guān)注。

【關(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮細胞；生長因子；干細胞移植

【中圖分類號】R318.06【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2009)08-0032-02

1骨髓間充質(zhì)干細胞

1.1BMSC的生物學特性間充質(zhì)干細胞是中胚層發(fā)育的早期細胞,為多能干細胞,主要存在于全身結(jié)締組織器官間質(zhì)中,其中以骨髓組織中含量最為豐富,稱為骨髓間充質(zhì)干細胞。其具有自我更新和多向分化的潛能,在不同的微環(huán)境中能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、纖維細胞、內(nèi)皮細胞等,特別是能夠橫向分化為神經(jīng)細胞。其具有取材方便、擴增迅速、可自體移植等特點。BMSC沒有特異性的表面標志，在其表面存在一些與造血干細胞不同的表面抗原，目前一致認為BMSC對于CD29，CD44，CD90，CD105，CD71，SH-2,SH-3等呈陽性反應(yīng)，同時對于造血干細胞的表面標志CD11b、CD45、CD34等呈陰性反應(yīng)^[1,2]。形態(tài)上多呈扁平梭形或星形細胞，因此BMSC可通過細胞的表面標志和細胞形態(tài)進行初步鑒定。目前常用的BMSC分離的方法主要有三種：貼壁篩選法、密度梯度離心法和流式細胞儀分離法。

1.2BMSC作為種子細胞治療疾病的優(yōu)越性BMSC具有很多其他干細胞沒有的特性,使其成為很多治療疾病的種子細胞:①可來源于自體,取材方便,分離獲取容易,沒有倫理學爭議。②在體外培養(yǎng)能快速擴增,且能永久分化,可誘導分化為各種細胞。免疫原性弱,安全性好。④能在組織中成活、遷移和分化。⑤可分泌多種細胞因子、集落刺激因子、干細胞生長因子、多種黏附分子等 ,在組織發(fā)育及分化過程中發(fā)揮重要作用。因其有以上優(yōu)越性,表明BMSC是疾病治療的理想種子細胞之一。

1.3BMSC作為外源性基因細胞載體的優(yōu)越性①轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細胞仍可以保持其干細胞的多向分化潛能。②外源性基因的產(chǎn)物可隨骨髓間充質(zhì)干細胞遷移至缺血損傷區(qū),充分發(fā)揮其作用,改善組織修復的微環(huán)境。③骨髓間充質(zhì)干細胞可轉(zhuǎn)染外源性營養(yǎng)因子促進自身和神經(jīng)干細胞存活、增殖、分化,同時亦可轉(zhuǎn)染凋亡基因如 bcl-2等抑制腦細胞凋亡,減輕神經(jīng)組織的進一步缺血損傷。因此,通過導入目的基因,將細胞治療與基因治療相結(jié)合,對腦梗死的治療將具有更廣泛的前景。

2血管內(nèi)皮細胞生長因子

2.1VEGF的生物學特性VEGF特異性促使血管內(nèi)皮增殖的有絲分裂原，是機體內(nèi)促使血管生成的最主要生長因子，其功能是刺激血管內(nèi)皮細胞生長，啟動血管形成和增加血管通透性，并能與內(nèi)皮細胞表面的特異性受體結(jié)合，強烈的促進血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導血管生成，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、側(cè)枝循環(huán)建立等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。VEGF165在組織和細胞中的含量最豐富，而且它是一種分泌性生長因子，廣泛地在多種組織細胞中表達，不僅具有促進血管生成活性，而且其表達產(chǎn)物是可溶性的。從細胞中分泌出來，擴散性強，易到達靶細胞，能很好的發(fā)揮生物學活性。

2.2VEGF基因轉(zhuǎn)染BMSC移植治療疾病的優(yōu)勢對于移植的BMSC進行VEGF基因修飾后，就會從幾個方面加強疾病的治療作用。㈠大量的血管新生可以改善梗死邊緣區(qū)休眠細胞的血供，改善和恢復其功能；㈡血管內(nèi)皮細胞生長因子在促進血管新生的同時，還可以直接刺激血管擴張，血供的改善可以提高移植細胞的成活率并為其以后的長期增殖分化提供一個良好的生存環(huán)境；㈢移植細胞存活數(shù)量可能增多，因為通過對移植細胞的基因修飾可提高其移植后的存活率。因此，將細胞治療和基因治療結(jié)合起來將是一種新的較好的方法。

3VEGF基因轉(zhuǎn)染入BMSC的方法

3.1重組載體導入真核細胞的方法將重組載體導入真核細胞的方法主要有以下幾種：磷酸鈣共沉淀法，電穿孔法，DEAE-葡聚糖法，脂質(zhì)體介導法，原生質(zhì)融合法；病毒載體轉(zhuǎn)染法，細胞核直接注射法。其中陽離子脂質(zhì)體介導基因轉(zhuǎn)染是近年來外源性基因?qū)胨拗骷毎某Ｓ梅椒ㄖ弧?/p>

脂質(zhì)體是由生物可降解成分組成，以其靶細胞范圍寬、轉(zhuǎn)化效率高、應(yīng)用簡便、毒性小、對包裹的基因沒有限制，又沒有病毒做載體引發(fā)生物變異和癌變的可能性等優(yōu)點正受到越來越多的重視。因此在實驗室研究和臨床基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基因的作用方式主要是通過脂質(zhì)體與細胞膜相結(jié)合，由于其與細胞膜有相似的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了脂質(zhì)體與細胞膜融合，或者通過內(nèi)吞的形式使得外源基因進入胞內(nèi)，但是陽離子脂質(zhì)體介導的外源基因主要是通過內(nèi)吞的形式進入胞內(nèi)，在胞內(nèi)釋放外源基因或者進一步與核摸結(jié)合使得外源基因直接進入細胞核，減少了外源基因被溶酶體降解，同時由于陽離子脂質(zhì)體帶有正電荷而核酸分子及細胞膜的電荷都是負電荷，所以陽離子脂質(zhì)體與核酸和細胞膜的結(jié)合力都大大增加，從而增強了脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染效率。

3.2影響脂質(zhì)體介導VEGF基因轉(zhuǎn)染入BMSC的因素①陽離子脂質(zhì)體的組成；②脂質(zhì)體與DNA的比率；③脂質(zhì)體的總量；④細胞密度以及脂質(zhì)體/DNA復合物與細胞作用的時間；⑤轉(zhuǎn)染時所用的培養(yǎng)液是否含有血清等。由于脂質(zhì)體具有細胞毒性作用是影響基因轉(zhuǎn)染效率的重要因素,因此適時終止其胞毒作用是很關(guān)鍵的。

4BMSC修復組織損傷的機制

大量研究表明BMSC能有效修復組織損傷, 使其功能和結(jié)構(gòu)缺損得到恢復, BMSC的組織修復機制有以下幾方面:①BMSC能直接分化為相應(yīng)的組織細胞；②分泌營養(yǎng)因子促進修復；③促進內(nèi)源性干細胞遷移與分化；④促進新生血管形成；⑤BMSC對損傷部位靶點的歸巢；⑥抑制炎癥因子的表達。

5影響B(tài)MSC移植治療效果的因素

5.1移植BMSC的時機移植時機的選擇需要考慮兩個方面的影響:一是在缺血的早期,毒性物質(zhì)、促炎遞質(zhì)和氧自由基的釋放等微環(huán)境的改變對移植細胞的影響。同時,組織損傷亦釋放趨化因子等使干細胞遷移至損傷部位參與修復,即缺血后組織的自身修復過程有利于細胞的存活、分化。二是在缺血的慢性期,纖維組織的形成阻礙了移植細胞的遷移、生長、整合。

5.2移植BMSC的途徑腦局部立體定向注射細胞移植是一種創(chuàng)傷性手術(shù),有可能會損傷正常腦組織,不易為患者接受,而經(jīng)靜脈或動脈注射較腦局部注射優(yōu)越,因移植細胞分布更廣,每次可移植的細胞數(shù)更多,操作更為方便,不需特殊裝置,將來臨床應(yīng)用中患者更容易接受。

5.3移植BMSC的濃度BMSC的濃度影響著移植治療的效果,研究表明,MAPCs濃度為3～6×106時,神經(jīng)功能缺失癥狀均有恢復,而MAPCs濃度為1×106時,神經(jīng)功能恢復不明顯。MAPCs濃度太低,達不到治療效果,濃度太高又易致靜脈栓塞。

6VEGF基因轉(zhuǎn)染BMSC的治療應(yīng)用

6.1缺血性心肌病周文武等心肌缺血動物模型中，移植后4周用Buxco系統(tǒng)于Wistar大鼠心尖置測壓管進行有創(chuàng)動態(tài)心功能測定。結(jié)果表明：冠狀動脈結(jié)扎后各組的大鼠收縮功能及舒張功能均受損，導致了心功能不全；在治療后，聯(lián)合組、細胞組及基因組動物均顯示有不同程度的心功能改善，以聯(lián)合組最明顯，且心肌梗死面積明顯小于對照組、細胞組、基因組，同時，細胞組、基因組動物又明顯小于對照組。這說明聯(lián)合治療在抑制心室擴張、限制心室重構(gòu)及促進心肌細胞修復，緩解心功能進行性下降等方面要優(yōu)于單純的細胞治療或基因治療；即認為血管內(nèi)皮細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染BMSC移植于心肌缺血區(qū)，其療效可能優(yōu)于細胞治療與基因治療的單獨應(yīng)用。因此采用基因轉(zhuǎn)染的方法將VEGF導入 MSC中就有可能使BMSC在發(fā)揮心肌修復作用的同時表達分泌 VEGF,從而促進血管的生成,有利于血管化心肌組織的新生,提高組織工程心肌組織修復缺血心肌的效果。

6.2骨缺損對骨發(fā)生，骨修復的研究證實，血管入侵是骨形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血管內(nèi)皮細胞生長因子是其中的關(guān)鍵生長因子，不僅可促使血管內(nèi)皮細胞的募集，遷移，增殖，協(xié)調(diào)著血管生成，并且介導成骨細胞，軟骨細胞，破骨細胞等的分化及功能。骨內(nèi)血管生成是骨形成早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，骨生發(fā)中心即位于血管化的環(huán)境中，無論膜內(nèi)成骨，軟骨內(nèi)成骨都與血管生成密切相關(guān)。禹志宏等在腺病毒介導人血管內(nèi)皮生長因子165基因轉(zhuǎn)染促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨特點的研究中證實人血管內(nèi)皮生長因子165基因重組腺病毒基因轉(zhuǎn)染對人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨能力具有促進作用，驗證了轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮生長因子165的人骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療骨疾病的可行性。 Zelzar等表明血管內(nèi)皮細胞生長通過增加格根包爾氏細胞在骨膜內(nèi)和軟骨內(nèi)的活性來促使骨的形成。J.Wang 等表明Ad-VEGF165組誘導骨形成的時間比陽性對照組早2周，這說明Ad-VEGF165能縮短骨形成的時間。在臨床上，我們可以發(fā)現(xiàn)它能縮短治療周期和降低細胞污染的危險性。

7小結(jié)與展望

血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是機體內(nèi)促進血管生長最主要的生長因子,VEGF特異性地作用于內(nèi)皮細胞,促進其增殖和血管生成。因此,以VEGF為基礎(chǔ)的治療性血管生成的研究備受關(guān)注。VEGF在很多正常及病理的人或動物組織中的表達水平較低無法形成有效濃度，并且VEGF蛋白的生物半衰期非常短，僅為6分鐘，即使直接將VEGF應(yīng)用于損傷處也會被周圍組織中的酶類很快降解，不能持續(xù)發(fā)揮作用，為了解決這個問題，許多學者采取了基因治療的手段通過許多實驗也都證實了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以使VEGF蛋白在機體局部持續(xù)、高效表達，為治療各種缺血性疾病、骨折、骨缺損、骨壞死等提供了一種有效的途徑。骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）由于具有多向分化潛能，取材方便安全、來源豐富、損傷小，易于體外培養(yǎng)擴增，在體外可長時間保持未分化狀態(tài)，體外基因轉(zhuǎn)染率高，并能穩(wěn)定高效表達多種治療性外源基因，而且自體獲取的BMSC回植后不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點，BMSC已經(jīng)成為重要的組織工程種子細胞，因此隨著組織細胞工程學和基因工程學的興起，若與其多向分化潛能相結(jié)合，通過導入目的基因，將細胞治療和基因治療結(jié)合在一起，這在臨床應(yīng)用中將會有廣闊的前景。如將二者結(jié)合起來治療神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病，這將為神經(jīng)臨床科醫(yī)生開拓新的思路和方法。

雖然對BMSC的研究已經(jīng)取得了驚人的成果，但是也還有許多問題沒有解決。目前BMSC的鑒定、分離純化等還未形成成熟的技術(shù)體系,BMSC在體外誘導和體內(nèi)移植的生物學機制還未闡明，以及通過病毒載體如腺病毒將VEGF轉(zhuǎn)染到BMSC中，雖然效率高，但存在著免疫反應(yīng)的危險，何適時調(diào)控VEGF表達等問題還需要深入研究。

(收稿日期：2009.02.02)