促紅細(xì)胞生成素衍生肽對順鉑所致大鼠急性腎損傷的劑量反應(yīng)關(guān)系的探討

柴 璐，王 鋒，范亞平， 楊斌，徐玉音，周建萍

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的兩大基本病理原因是缺血與腎毒性損傷。隨著多種新型藥物如抗腫瘤藥物、抗生素、非甾體抗炎藥等藥物的應(yīng)用，藥物引起的AKI越來越得到重視。國內(nèi)外已經(jīng)對腎毒性損傷所致AKI進(jìn)行了廣泛研究。已有前期的研究結(jié)果顯示人工合成的新型促紅細(xì)胞生成素衍生肽(HBSP)對缺血再灌注所致AKI大鼠具有較好的腎臟保護(hù)作用[1]，但其使用劑量與腎臟保護(hù)作用效果的關(guān)系，目前罕有報道。本研究探討HBSP對順鉑所致AKI是否有腎臟保護(hù)作用及其劑量反應(yīng)關(guān)系，為臨床治療提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性6月齡SD大鼠,SPF級,體質(zhì)量200～220 g,85只,由南通大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用符合江蘇省動物管理委員會管理條例規(guī)定，實驗者獲得江蘇省實驗動物從業(yè)人員崗位證書。大鼠自由攝食和飲水,室溫20～26 ℃,濕度40%～70%,光照條件:12 h明/12 h暗。

1.2 主要試劑 HBSP(上?？齐纳锟萍加邢薰?純度:98.12%)，順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司,產(chǎn)品批號：120804，規(guī)格：6 ml/30 mg,生成日期：2012-08-28)，TUNEL試劑盒(瑞士Roche，產(chǎn)品批號：11684817910，生成日期：2012-09-04)。

1.3 動物模型與分組 按隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠分為5組，分別為：對照組(5只)、順鉑組(20只)、HBSP(8 nmol/kg)組(20只)、HBSP(16 nmol/kg)組(20只)、HBSP(32 nmol/kg)組(20只)。除對照組外其他各組又分為第1、3、5、7天各亞組，每亞組5只。對照組5只大鼠腹腔單次注射0.9%氯化鈉溶液7 ml/kg。將順鉑用0.9%氯化鈉溶液配成1 mg/ml溶液，順鉑組20只大鼠腹腔單次注射順鉑7 ml/kg。HBSP(8 nmol/kg)組20只大鼠、HBSP(16 nmol/kg)組20只大鼠、HBSP(32 nmol/kg)組20只大鼠首次靜脈注射各對應(yīng)劑量的HBSP，5 h后腹腔單次注射順鉑7 ml/kg，后每隔24 h均靜脈注射各亞組對應(yīng)劑量的HBSP。所有大鼠予以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.4 檢測方法 全自動生化分析儀測定大鼠血尿素氮及血肌酐。大鼠腎組織采用4%多聚甲醛固定，后行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腎小管病理改變。采用TUNEL法觀察腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，以陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比雙盲法評分表示凋亡程度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能指標(biāo)的改變 各組大鼠不同時間血尿素氮及肌酐水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(尿素氮：F組間=441.456，F(xiàn)時間=10.643，P<0.001；肌酐：F組間=417.933，F(xiàn)時間=9.412，P<0.000 1)；其中第1、3、5、7天順鉑組、HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組血尿素氮及肌酐水平較對照組均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組血尿素氮及肌酐水平較順鉑組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBSP(16 nmol/kg)組第7天血尿素氮及肌酐水平較HBSP(8 nmol/kg)組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBSP(32 nmol/kg)第5天、第7天血尿素氮及肌酐水平較HBSP(8 nmol/kg)組和HBSP(16 nmol/kg)組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、2)。

2.2 各組大鼠血紅蛋白的改變 各組大鼠不同時間血紅蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=566 645.213，F(xiàn)時間=1.581，P=0.200,見表3)。

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)比較 HE染色可見對照組大鼠腎組織病理學(xué)正常(見圖1)。順鉑組大鼠腎皮質(zhì)損傷，腎小球輕度腫大，近端腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹并有空泡形成，并有小管上皮細(xì)胞脫落，透明管型形成，至第3天損傷達(dá)到頂峰，后腎組織損傷逐漸減輕，至第7天有腎小管再生現(xiàn)象(小管上皮細(xì)胞扁平，管腔擴(kuò)張，細(xì)胞核排列紊亂)(見圖2)。HBSP(8 nmol/kg)、HBSP(16 nmol/kg)、HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎組織損傷明顯減輕，第3天時管腔稍有腫脹，小管上皮細(xì)胞脫落不明顯，可見少量透明管型和紅細(xì)胞管型。在第5天時腎組織損傷程度進(jìn)一步減輕，已出現(xiàn)腎小管再生現(xiàn)象(小管上皮細(xì)胞扁平，管腔擴(kuò)張，細(xì)胞核排列紊亂)，且隨著HBSP劑量的加大，小管再生現(xiàn)象愈加明顯，至第7天時，上述3組的腎組織已基本同于對照組腎臟病理(見圖3～5)。

表1 各組大鼠不同時間血尿素氮水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與HBSP(8 nmol/kg)組比較，▲P<0.05；與HBSP(16 nmol/kg)組比較，●P<0.05

表2 各組大鼠不同時間血肌酐水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與HBSP(8 nmol/kg)組比較，▲P<0.05；與HBSP(16 nmol/kg)組比較，●P<0.05

圖2 順鉑組腎組織病理學(xué)(HE染色，×400)圖3 HBSP(8 nmol/kg)組腎組織病理學(xué)(HE染色，×400)

Figure2 Renal tissue pathological section in cisplatin groupFigure3 Renal tissue pathological section in HBSP(8 nmol/kg)group

圖4 HBSP(16 nmol/kg)組腎組織病理學(xué)(HE染色，×400)圖5 HBSP(32 nmol/kg)組腎組織病理學(xué)(HE染色，×400)

Figure4 Renal tissue pathological section in HBSP(16 nmol/kg)groupFigure5 Renal tissue pathological section in HBSP(32 nmol/kg)group

Table3 Comparison of serum hemoglobin levels at different time points among various rat groups

組別只數(shù)實驗前第1天第3天第5天第7天對照組5139±14139±14139±14139±14139±14順鉑組5141±14135±11139±13140±15137±12HBSP(8nmol/kg)組5135±13133±13139±15139±13142±13HBSP(16nmol/kg)組5143±14136±14133±13133±14139±13HBSP(32nmol/kg)組5140±13134±14130±13131±13136±14

2.4 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況 各組大鼠不同時間腎組織TUNEL染色百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=226.100，F(xiàn)時間=9.553，P<0.001)；其中第1、3、5、7天順鉑組、HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎組織TUNEL染色百分比較對照組均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組較順鉑組均降低(P<0.05)；HBSP(16 nmol/kg)組第7天較HBSP(8 nmol/kg)組降低(P<0.05)；HBSP(32 nmol/kg)組第5天較HBSP(8 nmol/kg)組、第7天較HBSP(8 nmol/kg)組和HBSP(16 nmol/kg)組均降低(P<0.05，見表4)。對照組可見腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核排列整齊，無深褐色TUNEL染色陽性細(xì)胞(見圖6)。順鉑組在第3天時可見腎小管管腔重度改變，腎小管上皮細(xì)胞重度裸露，TUNEL染色陽性細(xì)胞較多，至第5天、第7天腎小管管腔擴(kuò)張減少，TUNEL染色陽性細(xì)胞顯著減少(見圖7)。HBSP(8 nmol/kg)、HBSP(16 nmol/kg)、HBSP(32 nmol/kg)組第3天均可見較多TUNEL染色陽性細(xì)胞，在第5天、第7天時均有明顯減少，且隨著HBSP劑量的加大，TUNEL陽性細(xì)胞減少趨勢愈加明顯(見圖8～10)。

圖1 對照組腎組織病理學(xué)(HE染色，×400)

表4 各組大鼠不同時間腎組織TUNEL染色百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與HBSP(8 nmol/kg)組比較，▲P<0.05；與HBSP(16 nmol/kg)組比較，●P<0.05

圖7 順鉑組腎組織病理學(xué)(TUNEL染色，×400)圖8 HBSP(8 nmol/kg)組腎組織病理學(xué)(TUNEL染色，×400)

Figure7 Renal tissue pathological section in cisplatin groupFigure8 Renal tissue pathological section in HBSP(8 nmol/kg)group

圖9 HBSP(16 nmol/kg)組腎組織病理學(xué)(TUNEL染色，×400)圖10 HBSP(32 nmol/kg)組腎組織病理學(xué)(TUNEL染色，×400)

Figure9 Renal tissue pathological section in HBSP(16 nmol/kg)groupFigure10 Renal tissue pathological section in HBSP(32 nmol/kg)group

圖6 對照組腎組織病理學(xué)(TUNEL染色，×400)

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示AKI的發(fā)生率不斷升高，且病死率依然居高不下，盡管對AKI的了解和認(rèn)識不斷增多和深入，支持或輔助的治療措施也有進(jìn)展，但AKI的預(yù)后仍惡劣，特別是缺乏早期特異有效的干預(yù)和治療措施。

隨著大量新型藥物如抗腫瘤藥物、抗生素、生物制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，藥物引起的AKI呈逐漸上升趨勢，腎中毒已經(jīng)成為AKI的重要因素，國內(nèi)外已經(jīng)對腎毒性損傷所致AKI進(jìn)行了廣泛研究。順鉑是一種細(xì)胞增殖抑制劑,廣泛用于睪丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、骨癌和頭頸癌等實體腫瘤的治療。順鉑的抗腫瘤效率高，但同時具有明顯的劑量依賴性腎毒性[2]，以腎小球與腎小管均受損為特征，主要表現(xiàn)為氮質(zhì)血癥、多尿和腎衰竭等。本實驗采用順鉑誘導(dǎo)的AKI大鼠模型,該動物模型有成模時間短、成功率高、實驗操作簡單等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種有關(guān)AKI的研究中[3]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)對順鉑所致AKI的腎臟有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激及抗炎、抑制細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)[4-5]。但根據(jù)多種動物和臨床實驗，啟動EPO組織保護(hù)作用需要較高的劑量，而由此產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成及血栓形成的不良反應(yīng)已限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)腎臟及其他多種器官存在一種保護(hù)性的β共同體(β common recptor，βcR)，其能與EPO受體(EPOR)形成異源二聚體，不啟動造血信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，但可減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮組織保護(hù)作用[6]。Brines等[7]對EPO的蛋白分子結(jié)構(gòu)及其受體進(jìn)行了研究，表明EPO由4個螺旋結(jié)構(gòu)(Helix A～D)連接成環(huán)，當(dāng)EPO與其同源二聚受體結(jié)合時，Helix B的親水表面并不與其接觸，且其不含賴氨酸，不能被氨甲?；?，不能與EPOR結(jié)合而發(fā)揮促紅細(xì)胞生成的作用，即證實βcR的配體為Helix B，研究者隨即在Helix B螺旋親水表面上挑選出11個氨基酸殘基，人工合成線性多肽鏈HBSP，達(dá)到了其發(fā)揮組織保護(hù)作用和促紅細(xì)胞生成作用分離的目的。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)HBSP可減輕炎癥反應(yīng)及抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，對腎臟缺血再灌注的腎功能損傷有明顯的保護(hù)作用[8-9]。

已有研究證實了HBSP對缺血再灌注所致AKI的保護(hù)作用，對AKI大鼠采用8 nmol/kg劑量重復(fù)靜脈注射HBSP[1]，但相同劑量乃至更高劑量的HBSP對順鉑所致的AKI大鼠靜脈注射能否帶來更好的腎臟保護(hù)作用，目前罕有報道。本實驗采用大劑量(16 nmol/kg、32 nmol/kg)、多次注射(每隔24 h重復(fù)靜脈注射)的方法盡可能使HBSP穩(wěn)定地發(fā)揮出腎功能保護(hù)作用。各組大鼠腎組織HE染色顯示：與順鉑組大鼠腎組織相比，HBSP(8 nmol/kg)組、HBSP(16 nmol/kg)組、HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎小管損傷明顯減輕，提示HBSP對順鉑所致AKI有保護(hù)作用。且本實驗證實各種劑量的HBSP對血紅蛋白無明顯生成作用，這一點正是HBSP優(yōu)于EPO的方面。大鼠腎組織TUNEL染色百分比結(jié)果顯示與HBSP(8 nmol/kg)組相比，HBSP(16 nmol/kg)組于第1天、第3天、第5天有所降低，但無差異，于第7天降低；HBSP(32 nmol/kg)組大鼠腎組織TUNEL染色百分比于第1天、第3天有所降低，但無差異，第5天、第7天降低。該結(jié)果顯示HBSP的劑量使用越大，其發(fā)揮腎功能保護(hù)作用越明顯，可縮短其腎功能恢復(fù)的時間，提示HBSP使用劑量與順鉑所致AKI的腎臟保護(hù)作用可能存在正相關(guān)關(guān)系，其機(jī)制考慮可能與HBSP的劑量加大，其在循環(huán)系統(tǒng)中的有效濃度時間延長有關(guān)。

綜上所述，HBSP是一種新型的腎功能保護(hù)藥物，其作用機(jī)制以及使用方法還有待于進(jìn)一步的研究來確定，其突出的組織保護(hù)作用和較小的不良反應(yīng)為藥物導(dǎo)致AKI的治療開辟了新的治療思路和途徑，為藥物治療AKI帶來廣闊的應(yīng)用前景。

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