甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

李 星，王 潔，王紅揚(yáng)，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

李 星，王 潔，王紅揚(yáng)，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

以新鮮甘薯老葉為材料，經(jīng)過勻漿、硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Superdex-200凝膠層析等步驟后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定獲得了電泳純的酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP），純化后ACP比活力為251.49 U/mg，純化了169.07 倍，回收率為3.50%。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：ACP為單亞基酶，全酶分子質(zhì)量為42.3 kD，單亞基分子質(zhì)量為41.2 kD；最適反應(yīng)溫度65 ℃，最適pH 5.2；在40 ℃以下和pH 4.0～6.0范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定；以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物時(shí)，測(cè)得其米氏常數(shù)Km值為0.258 mmol/L；Ca2+和Mg2+對(duì)ACP酶活性有明顯激活作用，K+和Li+對(duì)ACP酶活性無(wú)影響，甲醇、乙二胺四乙酸和草酸對(duì)ACP酶活性的抑制作用較大；Hg2+和Ag+對(duì)ACP酶活性的抑制作用非常明顯。

甘薯葉；酸性磷酸酶；分離純化；性質(zhì)

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP，EC 3.1.3.2）是一種在酸性環(huán)境中催化磷酸單酯水解釋放出無(wú)機(jī)磷酸的水解酶［1］，在動(dòng)植物和微生物中都廣泛存在［2-3］。該酶可作為食品添加劑，在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中有重要作用［4-5］。植物體內(nèi)存在3 種磷酸酶：酸性、中性和堿性磷酸酶，而ACP是植物體內(nèi)重要的一種酶，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響［4］。在植物體內(nèi)，ACP是一種誘導(dǎo)酶，在缺磷的條件下能顯著提高其活性［5］。但因種屬差異，目前關(guān)于ACP具體的生理生化機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。甘薯屬于旋花科甘薯屬甘薯種草本植物，若生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)為多年生植物，若生長(zhǎng)在溫帶地區(qū)則為一年生植物。甘薯作為一種糧食作物在我國(guó)廣泛種植，并且作為多種產(chǎn)品的原材料被大量加工使用［6］。本實(shí)驗(yàn)以甘薯老葉作為研究材料，分離純化酸性磷酸酶，并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為從植物中分離純化酸性磷酸酶以及甘薯的綜合開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

甘薯葉采自重慶市甘薯工程研究中心研究基地。

對(duì)硝基苯磷酸二鈉 美國(guó)A m r e s c o公司；DEAE-Sepharose層析柱、Superdex-200凝膠柱、凝膠層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 美國(guó)Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Seven Easy pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；AKTA Prime plus純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；Milli-Q Plus純水儀美國(guó)Millipore公司；MC4L冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Uni-Equip公司；垂直電泳槽和電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1甘薯葉ACP粗酶液的提取

新鮮甘薯葉，選擇老葉部分（預(yù)實(shí)驗(yàn)表明老葉酶活力較幼葉更高）洗凈擦干，準(zhǔn)確稱取100 g，剪碎，以1：4（m/V）的提取比例加入預(yù)冷的50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）；放入組織搗碎機(jī)中攪碎，4 ℃提取2 h，用4 層紗布過濾2 次后在4 ℃條件下12 000 r/min離心60 min，收集上清液，即為粗酶液，測(cè)定粗酶液的酶活力和蛋白質(zhì)含量。

1.3.2硫酸銨分級(jí)沉淀

硫酸銨粉末經(jīng)烘箱干燥后，緩慢加入粗酶液中，使粗酶液中硫酸銨含量為10%（體積分?jǐn)?shù)），4 ℃靜置2 h后，4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min，棄去沉淀，收集上清液；然后繼續(xù)向粗酶液中加入硫酸銨至40%，4 ℃冰箱靜置2.5 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min，棄去上清液，收集沉淀；50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）溶解沉淀，測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量后裝入透析袋中，于5 mmol/L乙酸-乙酸鈉透析液（pH 5.0）中4 ℃透析24 h。

1.3.3DEAE-Sepharose層析

DEAE-Sepharose層析柱用200 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）平衡后，取經(jīng)過透析的10 mL酶液上樣，用0～1.0 mol/L NaCl、50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）進(jìn)行線性梯度洗脫（10 h NaCl濃度由0變?yōu)? mol/L），收集洗脫液5 mL/管，流速設(shè)定為0.5 mL/min，測(cè)定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的幾管，透析12 h后冷凍干燥，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4Superdex-200柱層析

Superdex-200層析柱經(jīng)50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）平衡后，取濃縮后的酶液3 mL上樣，用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）進(jìn)行洗脫，每管收集3 mL，流速設(shè)定為0.3 mL/min，測(cè)定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的1至2 管，用超純水透析12 h后冷凍干燥，得到的酶純品于-20 ℃保存?zhèn)溆?，酶純品粉末?0 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）溶解，使酶液酶活力約為50 U/mL，用于做酶性質(zhì)研究。

1.3.5ACP活力的測(cè)定

［7］方法并改進(jìn)：向試管中加入2.9 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）（含5 mmol/L的β-巰基乙醇 ）和底物（1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉），于37 ℃水浴鍋保溫5 min后，再加入100 μL酶液，反應(yīng)10 min后加入2.5 mL的0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。以100 μL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉（pH 5.0）緩沖液代替酶液作為對(duì)照調(diào)零，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度對(duì)應(yīng)對(duì)硝基苯酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)物生成量。酶活力單位（U）定義為：在37 ℃條件下，以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物，每分鐘每升溶液中底物水解后生成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。

1.3.6蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用紫外分光光度法和考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定［8-9］。

1.3.7ACP純度鑒定以及分子質(zhì)量的測(cè)定

用SDS-PAGE對(duì)凝膠層析過后的樣品進(jìn)行純度鑒定以及單亞基分子質(zhì)量的測(cè)定［10］，凝膠過濾法對(duì)全酶分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定［11］。

1.3.8ACP部分理化性質(zhì)的研究

1.3.8.1ACP最適溫度和最適pH值測(cè)定

分別在30～70 ℃和pH 3～8的條件下測(cè)定酶活力，分別以最適條件下測(cè)定的酶活力為100%，其余條件下的酶活力與之相比得到相對(duì)酶活力。

1.3.8.2不同溫度和pH值條件下ACP的穩(wěn)定性

分別在30～70 ℃和pH 3～8條件下，處理1～5 h，每隔1 h測(cè)定酶活力。分別以未處理時(shí)的溫度和pH值條件下的酶活力為100%，其余溫度和pH值條件下測(cè)得的酶活力分別與之相比為相對(duì)酶活力。

1.3.8.3米氏常數(shù)Km的測(cè)定

在根據(jù)1.3.8.1節(jié)所測(cè)得的最適溫度和最適pH值條件下，在不同底物濃度（對(duì)硝基苯磷酸二鈉0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L）條件下，測(cè)定ACP活力，采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）求出其Km值。

1.3.8.4不同有機(jī)溶劑對(duì)ACP活性的影響［12］

分別將甲醇、乙醇和異丙醇與酶液混合，混合后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%，37 ℃條件下處理30 min，再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min，最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同有機(jī)溶劑影響下的酶活力，以不加有機(jī)溶劑時(shí)的酶活力為100%。

1.3.8.5不同化合物對(duì)ACP活性的影響［12］

分別將尿素、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetra acetic acid，EDTA）、抗壞血酸和草酸與酶液混合，混合后化合物的濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L，37 ℃條件下處理30 min，再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min，最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同化合物對(duì)酶活力的影響，以不加化合物時(shí)的酶活力為100%。

1.3.8.6不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性的影響［12］

分別將各種不同金屬離子與酶液混合，混合后反應(yīng)液中金屬離子的濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L，37 ℃條件下處理30 min，再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min，最后再加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同金屬離子對(duì)酶活力的影響，以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100%。

2　結(jié)果與分析

2.1甘薯葉ACP的分離純化結(jié)果

圖1　甘薯葉ACP的DEAE-Sepharose離子交換柱層析色譜圖Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ACP from sweet potato leaves

圖2　甘薯葉ACP的Superdex-200凝膠柱層析色譜圖Fig.2 Superdex-200 chromatography of ACP from sweet potato leaves

硫酸銨分級(jí)沉淀透析后的酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析后的結(jié)果見圖1，酶活力最高管為第46管。收集酶活力較高的組分，經(jīng)透析冷凍干燥濃縮后，Superdex-200凝膠柱層析結(jié)果見圖2，酶活力最高管為第36管，收集酶活力最高的組分，冷凍干燥后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。整個(gè)分離純化過程的結(jié)果如表1所示。

表1　甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化結(jié)果Table1 Purification of ACP from sweet potato leaves

2.2甘薯葉ACP的純度鑒定和分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

圖3　甘薯葉ACP的SDS-PAGGEE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified ACP from sweet potato leaves

如圖3所示，甘薯葉ACP純化后，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示為單一條帶，說(shuō)明該酶樣品已達(dá)到電泳純，通過遷移率計(jì)算出單亞基分子質(zhì)量約為41.2 kD；而凝膠過濾層析法測(cè)定的全酶分子質(zhì)量約為42.3 kD（圖4），由此推斷甘薯葉ACP是為單亞基酶，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的多數(shù)ACP為單亞基酶的結(jié)論一致［12-15］。

圖4　Superdex-200層析法測(cè)得甘薯葉ACP的全酶分子質(zhì)量Fig.4 Estimation of the molecular weight of ACP from sweet potato leaves by Superdex-200 chromatography

2.3甘薯葉ACP部分性質(zhì)研究

2.3.1甘薯葉ACP反應(yīng)最適溫度和最適pH值

在不同溫度和pH值條件下測(cè)定ACP活力，結(jié)果表明：該酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃（圖5），最適反應(yīng)pH值為5.2（圖6）。

圖5　溫度對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of ACP from sweet potato leaves

圖6　pH值對(duì)甘薯葉酸性ACP活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of ACP from sweet potato leaves

2.3.2甘薯葉ACP的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性

圖7　甘薯葉ACP的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of ACP from sweet potato leaves

圖8　甘薯葉ACP的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH Stability of ACP from sweet potato leaves

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACP在40 ℃以下較穩(wěn)定，60～70 ℃溫度范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性較低，在70 ℃保溫1 h以后，酶活力幾乎完全喪失（圖7）。在pH 4～6條件下，穩(wěn)定性較好，酶活力變化趨勢(shì)比較緩慢，pH 5條件下放置5 h后，相對(duì)酶活力還高達(dá)90%以上； pH值＜4或者≥7時(shí)，酶蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶活力下降很快，5 h后相對(duì)酶活力只剩下不到10%（圖8）。

2.3.3甘薯葉ACP的米氏常數(shù)Km

在最適溫度和pH值條件下，將不同濃度底物（對(duì)硝基苯磷酸二鈉0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L）加入酶反應(yīng)體系中，測(cè)定不同濃度底物下的ACP酶活力，利用雙倒數(shù)作圖法得Km為0.258 mmol/L（圖9）。

圖9　雙倒數(shù)法測(cè)得甘薯葉ACP的米氏常數(shù)KmFig.9 KmDetermination of ACP from sweet potato leaves by Lineweaver-Burk plot

2.3.4不同有機(jī)溶劑對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

圖10　不同有機(jī)溶劑對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.10 Effects of various organic solvents on the activity of ACP from sweet potato leaves

如圖10所示，ACP在甲醇、乙醇作用下，酶活力均受到強(qiáng)烈抑制，隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，甲醇幾乎抑制了該酶40%的酶活力，而異丙醇體積分?jǐn)?shù)在低于20%時(shí)，對(duì)酶有少許的激活作用，體積分?jǐn)?shù)高于20%后，則表現(xiàn)出對(duì)酶有抑制作用。

2.3.5不同化合物對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

如圖11所示，隨著濃度的增大，多數(shù)化合物對(duì)甘薯葉ACP的酶活力表現(xiàn)出了抑制作用，其中，草酸對(duì)該酶的抑制作用非常明顯，當(dāng)草酸濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí)，ACP基本上檢測(cè)不到酶活力，尿素對(duì)該酶影響作用不明顯，而EDTA在高濃度下也對(duì)酶活性表現(xiàn)出抑制作用，抗壞血酸在低于40 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出對(duì)酶活力少許的激活作用，而在高于40 mmol/L后又體現(xiàn)出對(duì)ACP活力有抑制作用。

圖11　不同化合物對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ACP from sweet potato leaves

2.3.6不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

圖12　不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.12 Effect of various metal ions on the activity of ACP from sweet potato leaves

如圖12所示，不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性有不同的影響。隨著離子濃度的增加，Ca2+、Ba2+和Mg2+對(duì)酶活力稍有激活作用，Pb2+、Zn2+、Hg2+、Ag+則對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制作用，其中Hg2+、Ag+對(duì)該酶抑制作用最明顯，當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到0.2 mmol/L時(shí)，ACP活力完全喪失。

3　討 論

酶的分離純化是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，本實(shí)驗(yàn)從甘薯的老葉中得到了電泳純的ACP。但是與其他材料中分離純化的ACP相比較，回收率偏低，可能原因有：ACP在甘薯中的同工酶較多［12］，純化過程中可能丟失了部分同工酶；另外，在上柱過程中溫度不同和洗脫液條件對(duì)酶穩(wěn)定性的影響使酶活力降低，從而也可能致使回收率降低；在透析過程以及上離子柱之前的離心過程中可能損失了部分酶活力，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

甘薯葉ACP全酶分子質(zhì)量約為42.3 kD，一般低于其他材料的ACP分子質(zhì)量，如韭菜（59.58 kD）［12］、斑玉蕈（65 kD）［13］、長(zhǎng)毛對(duì)蝦（73 kD）［14］，遠(yuǎn)低于意蜂工蜂（135 kD）［15］和海參（147.9 kD）［16］，但比綠豆（34.6 kD）［17］高，說(shuō)明了不同種類材料的ACP分子質(zhì)量之間存在著較大的差異，推測(cè)可能是由于生物體為了適應(yīng)環(huán)境形成的。

甘薯葉ACP的最適溫度為65 ℃，與其他材料的ACP最適溫度相比較高，與韭菜（65 ℃）［12］相同，高于綠豆（40 ℃）［17］、背角無(wú)齒蚌（50 ℃）［18］、草魚（45 ℃）［7］、刺參（45 ℃）［19］。該酶在40 ℃以下活力較穩(wěn)定，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的情況相符。最適pH值為5.2，與綠豆（pH 5.2）［17］相同，與背角無(wú)齒蚌（pH 4.8）［18］和麥芽（pH 5.4）［20］相近，略高于草魚（pH 4.4）［7］，遠(yuǎn)高于真菌類樹狀多節(jié)孢（pH 3.0）［21］和海洋藻類三角褐指藻、塔胞藻、海鏈藻（pH 3.0）［22］，甘薯葉ACP在pH 4.0～6.0條件下較為穩(wěn)定，并且在pH 5.0時(shí)放置5 h后酶活力幾乎不發(fā)生變化，說(shuō)明甘薯葉ACP在其最適pH值附近穩(wěn)定性較好。

甘薯葉ACP的Km約為0.258 mmol/L，與來(lái)自草魚的ACP（Km值為0.232 mmol/L）［7］較為相近，比綠豆酸性磷酸酶（Km值為4.28 mmol/L）［17］低很多，和其他植物材料相比都要低很多，說(shuō)明甘薯葉ACP對(duì)底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉的親和力較大。

Pb2+、Zn2+、Hg2+、Ag+對(duì)甘薯葉ACP活力都有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是Hg2+、Ag+，在較低濃度下即能對(duì)甘薯葉ACP的酶活力產(chǎn)生抑制作用，這與Pb2+及Ag+對(duì)斑玉蕈［13］和刺參［19］中ACP的強(qiáng)烈抑制作用相似，Zn2+與重金屬離子均為該酶的抑制劑，這些離子直接作用于ACP活性中心的巰基從而導(dǎo)致酶活性喪失。Ca2+和Mg2+對(duì)甘薯葉ACP酶活力有明顯的激活作用，推測(cè)可能是金屬離子與酶的活性中心結(jié)合促進(jìn)了酶的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合，從而促進(jìn)酶的催化反應(yīng)，這與多數(shù)文獻(xiàn)一致［19-22］，只在洋蔥［23］中發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)ACP活力反而有抑制作用，說(shuō)明了同一種金屬離子對(duì)不同材料來(lái)源的ACP活性有不同的影響作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ MACDONALD K. The hydrolysis of phenyl phosphate by mouseliver acid phosphatase［J］. Biochemical Journal， 1961， 80（1）: 154-161.

［2］ DEXTER R. Acid phosphatases of Escherichia coli［J］. Archives Biochemistry and Biophysics， 1960， 89: 97-104.

［3］ YOKOTA Y， NAKANO E. Two acid phosphatases in sea urchin eggs and embryos［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry， 1984， 79（1）: 17-22.

［4］ 李傳保， 龔守富. 植物體內(nèi)酸性磷酸酶研究進(jìn)展［J］. 信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)， 2005，15（3）: 88-89.

［5］ 黃宇， 張海偉， 徐芳森. 植物酸性磷酸酶的研究進(jìn)展［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 27（1）: 148-154.

［6］ 胡立明， 高蔭榆， 陳才水， 等. 甘薯葉研究進(jìn)展［J］. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)， 2002， 23（1）: 79-84.

［7］ 楊立紅， 肖波， 王曉潔， 等. 草魚酸性磷酸酯酶的性質(zhì)及金屬離子對(duì)其活性 的影響［J］. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)， 2010， 17（5）: 969-976.

［8］ 李建武， 余瑞元. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法［M］. 北京: 北京大學(xué)出版社， 1994: 171-176.

［9］ LAYNE E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins［J］. Methods in Enzymology， 1957， 3: 447-454.

［10］ 朱廣廉， 楊中漢. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量［J］.植物生理學(xué)通訊， 1992（2）: 43-47.

［11］ 楊安鋼. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］. 北京: 高等教育出版社， 2001: 248-252.

［12］ 孫芳， 任美鳳， 胡瑞斌， 等. 韭菜酸性磷酸酶的分離純化和部分性質(zhì)研究［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（17）: 187-191.

［13］ 楊立紅， 高興喜， 繆靜， 等. 斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.菌物學(xué)報(bào)， 2011， 30（5）: 744-752.

［14］ 陳素麗， 陳清西， 胡天惠， 等. 長(zhǎng)毛對(duì)蝦酸性磷酸酶功能基團(tuán)的研究［J］.臺(tái)灣海峽， 1997， 16（1）: 81-84.

［15］ 江琰， 劉克武， 雷遠(yuǎn)成. 意蜂工蜂酸性磷酸酶的純化及其酶學(xué)特性［J］.昆蟲學(xué)報(bào)， 2004， 47（3）: 310-315.

［16］ ZHU Beiwei， YU Jianwei， ZHANG Zongshen， et al. Purification and partial characterization of an acid phosphatase from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus［J］. Process Biochemistry， 2009，44（8）: 875-879.

［17］ 高亞朋， 蘇茉， 梁建榮， 等. 綠豆酸性磷酸酶的分離純化和部分性質(zhì)研究［J］. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)， 2011， 26（5）: 92-96.

［18］ 魏煒， 張洪淵， 石安靜. 背角無(wú)齒蚌酸性磷酸酶的分離、純化及部分性質(zhì)研究［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版， 1999， 36（3）: 570-572.

［19］ 楊立紅， 孫振興， 王曉潔， 等. 刺參酸性磷酸酯酶的分離純化及部分性質(zhì)研究［J］. 食品科學(xué)， 2008， 29（10）: 441-442.

［20］ 楊彩蘭， 陳巍， 茍春寶， 等. 一種麥芽酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究［J］. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版， 2011， 48（1）: 207-212.

［21］ 張國(guó)慶， 王有志， 王守現(xiàn)， 等. 樹狀多節(jié)孢酸性磷酸酶的分離純化與性質(zhì)研究［J］. 菌物學(xué)報(bào)， 2011， 30（5）: 753-759.

［22］ 王洪斌， 繆雨溪， 李信書， 等. 4種海洋微藻酸性磷酸酶的分離純化及其性質(zhì)的研究［J］. 水產(chǎn)科學(xué)， 2013， 32（3）: 153-156.

［23］ GUO Jie， PESACRETA T C. Purification and characterization of an acid phosphatase from the bulb of Allium cepa L. var. Sweet Spanish［J］. Journal of Plant Physiology， 1997， 151（5）: 520-527.

Isolation， Purification and Characterization of Acid Phosphatase from Sweet Potato Leaves

LI Xing， WANG Jie， WANG Hongyang， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Electrophoresis-pure acid phosphatase （ACP） was obtained from sweet potato old leaves via a series of consecutive procedures， including homogenization， extraction， ammonium sulfate fractional precipitation， DEAE-sepharose chromatography and Superdex-200 gel filtration and then identified with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）. In this process， the purification fold was 169.07 and the recovery of ACP activity was 3.50%. The specific activity of the purified enzyme was 251.49 U/mg. The result showed that the enzyme was a single subunit protease with a relative molecular weight of 42.3 kD， and the subunit molecular weight was 41.2 kD. The optimum temperature and pH of the ACP enzyme were 65 ℃ and 5.2， respectively. This ACP was stable below 40 ℃ and in the pH range from 4.0 to 6.0. Its Michaelis-Menten Kinetics （Km） towards p-nitrophenyl phosphate was 0.258 mmol/L. The enzyme activity could be obviously inhibited by methanol， EDTA and oxalic acid and also strongly inhibited by Hg2+and Ag+.

sweet potato leaves； acid phosphatase； isolation and purification； characterization

Q946.5

A

1002-6630（2015）03-0152-06

10.7506/spkx1002-6630-201503029

2014-03-24

重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（CSTC2011AB1027）

李星（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶工程。E-mail：848322361@qq.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶工程。E-mail：tbright@swu.edu.cn