• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組Pol D DNA聚合酶的純化及其功能初步研究*

    2022-02-09 12:51:48張雪松李德鳳薛姜珊陳孜孟蒙健宗
    廣西科學(xué) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:核酸酶外切凝膠電泳

    張雪松,李德鳳,薛姜珊,陳孜孟,李 卓,蒙健宗

    (1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005;2.自然資源部第三海洋研究所,福建廈門 361000;3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)食品藥品研究院,廣西南寧 530007)

    DNA復(fù)制在生命領(lǐng)域中是必不可少的生物學(xué)過程,DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中起著十分關(guān)鍵的作用,它確保了遺傳信息的準(zhǔn)確復(fù)制和傳遞。迄今報(bào)道的DNA聚合酶家族有7個(gè),根據(jù)對(duì)其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的分析可劃分為A、B、C、D、E、X和Y家族[1-7],其中D家族(Pol D)DNA聚合酶是在古菌中被發(fā)現(xiàn)的,并且只存在于古菌中[5]。1997年Uemori等[8]從超嗜熱古菌Pyrococcusfuriosus中克隆出Pol D DNA聚合酶基因,該聚合酶由DP1和DP2兩個(gè)亞基組成,大小分別為69 294 Da和143 161 Da,且兩亞基需要共表達(dá)或混合存在時(shí)才會(huì)各自表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性;1998年Ishino等[5]從古菌Methanococcusjannaschii中克隆表達(dá)了與P.furiosusDNA聚合酶同源的聚合酶蛋白,并發(fā)現(xiàn)其DP1亞基有3′→5′外切核酸酶活性;同時(shí)發(fā)現(xiàn),相比于雙鏈DNA,DP1更容易降解單鏈DNA。研究發(fā)現(xiàn)大部分古菌中存在B家族(Pol B)與Pol D兩種DNA聚合酶,若將細(xì)胞內(nèi)的Pol B DNA聚合酶基因敲除,古菌依舊可以存活;若將細(xì)胞內(nèi)的Pol D DNA聚合酶基因敲除,則古菌無(wú)法存活[9]。由此可見Pol D DNA聚合酶在古菌DNA復(fù)制過程中的重要性。相比于Pol A、Pol B等家族的DNA聚合酶,國(guó)內(nèi)外對(duì)Pol D DNA聚合酶的研究仍然較少,多種古菌中Pol D DNA聚合酶的理化性質(zhì)和功能仍處于未知狀態(tài)。

    我國(guó)自然資源部第三海洋研究所從采集的海底熱液口樣品中分離得到一株超嗜熱古菌Thermococcussp.4557 (CGMCC 1.517 2),該菌是一種嚴(yán)格厭氧的超嗜熱硫還原古菌[10],前期已克隆表達(dá)其小亞基DP1和大亞基DP2,并研究了DP1與Sld5和Psf1蛋白復(fù)合體(Sld5 and Psf1 Complex,GINS 51)、GINS關(guān)聯(lián)核酸酶(GINS-Associated Nuclease,GAN)等相關(guān)蛋白的體外相互作用[11],但還未研究該P(yáng)ol D DNA聚合酶大、小兩個(gè)亞基的功能及其相互作用,以及GINS 51蛋白對(duì)小亞基外切酶活性的影響等。本研究分別純化重組表達(dá)Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1和大亞基DP2,并利用熒光標(biāo)記核酸對(duì)其體外功能進(jìn)行研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 表達(dá)質(zhì)粒與重組蛋白

    分別用于表達(dá)超嗜熱硫還原古菌Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1和大亞基DP2的表達(dá)質(zhì)粒pET21a/His-PolD-(S)、pET21a/His-PolD-(L)[11],以及純化的重組表達(dá)Thermococcussp.4557 GINS 51蛋白,均由自然資源部第三海洋研究所提供。

    1.1.2 試劑

    Ni-NTA樹脂、Q陰離子層析樹脂、DEAE樹脂和Butyl樹脂購(gòu)自GE Healthcare Life Sciences,牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,dNTP購(gòu)自New England Biolabs,Trition X-100購(gòu)自Takara Bio Group。

    單鏈DNA模板ZXS001序列:5′-GTAACGC-

    CAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAA-

    CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGC-

    AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCG-

    AGC-3′。

    熒光引物Cy3-ZXS002序列:5′-GCTCGGTAC-

    CCGGGGATCCTCTAGAGTCGA-3′。

    熒光底物Cy5-0A01序列:5′-GGGGCGAGTCCAGGTCAGGACCTTGCGGGG-3′。

    熒光引物和熒光底物均從深圳華大基因股份有限公司訂購(gòu)合成。

    1.1.3 儀器

    AKTA avant 25蛋白純化系統(tǒng)(GE Healthcare Life Sciences),Typhoon掃描儀(GE Healthcare Life Sciences),垂直電泳儀Mini-PROTEANR Tetra Handcast System [伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司],JS-3000凝膠成像儀(上海培清科技有限公司),Nano Drop微量核酸蛋白測(cè)定儀(ThermoFisher Scientific),恒溫?fù)u床(上海知楚儀器有限公司),Biosafer超聲破碎儀[賽飛(中國(guó))有限公司],高壓均質(zhì)機(jī)[永聯(lián)生物科技(上海)有限公司],100 L自控式發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司),Avanti J-26冷凍離心機(jī)(Beckman coulter)。

    1.2 方法

    1.2.1 重組蛋白表達(dá)

    表達(dá)質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化液涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)的LB平板,37℃倒置培養(yǎng)過夜。

    Pol D DNA聚合酶小亞基DP1重組菌的表達(dá):挑取單菌落在LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩級(jí)種子,以2%的接種量轉(zhuǎn)接到3瓶2.5 L的LB/Amp液體培養(yǎng)基,37℃、150 r/min搖床培養(yǎng)6-8 h,待其OD600值達(dá)1.0時(shí),加入終濃度為50 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8-10 h,離心收集菌體,-80℃凍存。

    Pol D DNA聚合酶大亞基DP2重組菌的表達(dá):由于DP2表達(dá)量較低,因而采用發(fā)酵罐進(jìn)行大量培養(yǎng);挑取單菌落在 LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)三級(jí)種子,以1%的接種量轉(zhuǎn)接到100 L LB/Amp液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,在溫度37℃、轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量為0.5 vvm、罐壓0.05 MPa的條件下發(fā)酵培養(yǎng),待其OD600值達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為50 mmol/L的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)8-10 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá),用管式離心機(jī)離心收集菌體,-80℃凍存。

    1.2.2 重組蛋白純化

    (1)Ni-NTA柱層析。

    取10 g表達(dá)Pol D DNA聚合酶小亞基DP1的菌泥重懸于50 mL Ni-NTA Binding Buffer,置70℃水浴熱處理20 min,使大部分非耐熱蛋白失活沉淀;用超聲波破碎儀破碎菌體后,于4℃、13 000 r/min離心40 min,收集上清;取160 g表達(dá)Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的菌泥重懸于500 mL Ni-NTA Binding Buffer,置70℃水浴熱處理20 min后,用高壓均質(zhì)機(jī)在4℃下高壓研磨破碎菌體約10 min,4℃、13 000 r/min離心40 min,收集上清。

    在AKTA avant25蛋白純化系統(tǒng)上進(jìn)行Ni-NTA柱層析純化,將細(xì)胞破碎液上清與5 mL平衡好的Ni-NTA樹脂結(jié)合,采用3倍柱體積的Binding Buffer清洗后,用咪唑濃度為0-250 mmol/L的線性梯度液進(jìn)行洗脫,洗脫液按20 mL/管進(jìn)行收集并置4℃冰箱暫存;取少量洗脫液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,并用ImageJ軟件分析計(jì)算每管洗脫液中目的蛋白條帶的占比,根據(jù)電泳結(jié)果選取含有目的蛋白的樣品,用強(qiáng)陰離子吸附柱進(jìn)一步純化。

    (2)強(qiáng)陰離子吸附柱(Q柱)層析。

    將經(jīng)Ni-NTA純化后的含有目的蛋白的組分混合,用含25 mmol/L Tris (pH值為8.0)溶液進(jìn)行降鹽透析24 h,每6 h換一次透析液,使樣品中NaCl濃度降至10 mmol/L以下;取透析完成的樣品與5 mL Q陰離子交換樹脂結(jié)合,用NaCl線性梯度洗脫液進(jìn)行升濃度梯度洗脫,NaCl線性梯度液濃度為0-1 000 mmol/L,洗脫液按10 mL/管收集并置4℃暫存;取少量洗脫液樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,根據(jù)電泳結(jié)果選取含有目的蛋白的樣品,分別用DEAE柱(DEAE樹脂)或疏水柱(Butyl樹脂)進(jìn)一步純化。

    (3)弱陰離子交換柱層析

    將經(jīng)Q柱純化后的含有重組Pol D DNA 聚合酶小亞基DP1的樣品混合,按(2)的方法透析;取透析完成的樣品與5 mL DEAE陰離子交換樹脂結(jié)合,用NaCl線性梯度洗脫液進(jìn)行升濃度梯度洗脫,NaCl梯度液濃度為0-1 000 mmol/L,洗脫液按5 mL/管收集并置4℃冰箱暫存;取少量洗脫液樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

    (4)疏水柱層析。

    將Q柱純化后含有重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的樣品組分混合,計(jì)算并加入5 mol/L NaCl溶液,使樣品中NaCl濃度達(dá)到3.5 mol/L;將此樣品溶液與用3.5 mol/L NaCl溶液平衡過的5 mL Butyl樹脂結(jié)合,用NaCl線性梯度洗脫液進(jìn)行降濃度梯度洗脫,NaCl梯度液濃度為3 500-0 mmol/L,洗脫液按5 mL/管收集并置4℃暫存;取少量洗脫液樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

    (5)蛋白的透析與保存。

    將純化后的目的蛋白樣品混合,用含25 mmol/L Tris (pH值為8.0)、0.1 mmol/L EDTA、200mmol/L KCl、1 mmol/L DTT和50%甘油的Storage Buffer在4℃透析18 h,每6 h換一次Storage Buffe,透析完畢用微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,置-20℃保存。

    1.2.3 重組Pol D DNA聚合酶大小亞基的功能實(shí)驗(yàn)

    (1)重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的延伸活性。

    根據(jù)單鏈DNA模板ZXS001的序列設(shè)計(jì)和合成帶有5′-Cy3熒光標(biāo)記的引物Cy3-ZXS002,配制熒光引物-模板混合物(100 pmol Cy3-ZXS002、200 pmol ZXS001、7 mmol/L pH 值為8.0的Tris、50 mmol/L NaCl、7 mmol/L MgCl2),沸水浴5 min后自然冷卻至室溫,使熒光引物互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合到單鏈DNA模板;配制10 μL延伸反應(yīng)體系:20 mmol/L pH 值為8.0的Tris、10 mmol/L MgSO4、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、0.1% Trition X-100、0.5 mmol/L dNTP、0.8 μL熒光引物-模板混合物、1 μL 不同濃度(0 pmol、0.1 pmol、0.2 pmol、0.5 pmol、1.5 pmol、5 pmol、15 pmol、40 pmol)的DP2或DP2與DP1的混合物,在70℃孵育2 min使熒光引物發(fā)生DNA復(fù)制延伸反應(yīng);加入等體積的2×Stop Buffer (90%甲酰胺、10 mmol/L EDTA、10% TBE)終止反應(yīng),接著煮沸5 min,冰水浴使其快速冷卻,此時(shí)未經(jīng)過延伸的熒光引物會(huì)與單鏈DNA模板分離,游離于體系內(nèi);延伸反應(yīng)物在含8 mol/L尿素的TBE溶液中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,最后用GE Typhoon掃描儀Cy3頻段掃描檢測(cè)。

    (2)重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1外切酶活性。

    合成5′-Cy5熒光標(biāo)記的單鏈DNA底物Cy5-0A01,構(gòu)建20 μL降解反應(yīng)體系:50 mmol/L pH 值為8.0的Tris,4 mmol/L MgCl2、100 μg BSA、2 pmol Cy5-0A01、1 μL 不同濃度(0 pmol、1.562 5 pmol、3.125 pmol、6.25 pmol、12.5 pmol、25 pmol、50 pmol、100 pmol)的DP1或DP1與DP2的混合物或DP1與GINS 51的混合物,ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)體系在70℃孵育一定時(shí)間(0 s、30 s、1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min)后加入等體積的2×Stop Buffer中止反應(yīng),煮沸5 min,待其冷卻后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,最后用GE Typhoon掃描儀Cy5頻段進(jìn)行掃描檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 重組Pol D DNA聚合酶大小亞基的純化

    重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1先后經(jīng)過Ni-NTA柱、Q柱和DEAE柱層析純化,DP1在每次層析的收集組分中的占比依次增加。收集合并DEAE柱層析中DP1占比分別為77.9%、95.3%和98.6%的第5-7管組分,經(jīng)Storage Buffer透析后收得含DP1蛋白溶液22.5 mL,微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度為1.49 mg/mL。

    重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2先后經(jīng)過Ni-NTA、Q柱和Butyl疏水柱層析純化,DP2在每次層析的收集組分中的占比依次增加。收集合并Butyl疏水層析后DP2占比分別為70.5%、82.4%、81.2%、91.5%、90.6%、79.0%的第11-16管組分,經(jīng)Storage Buffer透析后收得含DP2蛋白溶液11 mL,微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度為0.56 mg/mL。

    將以上較高純度的DP1蛋白和DP2蛋白用于研究其功能。

    2.2 重組Pol D DNA聚合酶大小亞基的功能

    2.2.1 重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2的延伸活性

    在延伸反應(yīng)體系中分別加入0-40 pmol的DP2蛋白反應(yīng)2 min后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,含有DP2蛋白的實(shí)驗(yàn)樣品完成了熒光核酸引物的復(fù)制延伸,DP2蛋白為零的對(duì)照樣品未完成熒光核酸引物的復(fù)制延伸,說明重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2具有核酸復(fù)制延伸活性,且延伸活性較強(qiáng),在用量低至0.1 pmol時(shí)仍可完成熒光核酸引物的復(fù)制延伸。

    圖1 DP2濃度對(duì)其延伸活性的影響

    2.2.2 重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1的外切酶活性

    在降解反應(yīng)體系中分別加入0-100 pmol的DP1蛋白降解反應(yīng)15 min后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,加入DP1蛋白后熒光核酸底物被降解而逐漸變短,且在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi),隨著DP1用量的增加,熒光核酸底物被降解得更短,表明Pol D DNA聚合酶小亞基DP1具有3′→5′外切核酸酶活性。

    圖2 DP1濃度對(duì)其3′→5′外切核酸酶活性的影響

    在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為50 pmol 的條件下,經(jīng)不同降解反應(yīng)時(shí)間后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,DP1對(duì)熒光核酸底物的降解程度逐漸增大。

    圖3 DP1反應(yīng)時(shí)間對(duì)DP1降解核酸底物的影響

    2.2.3 重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1對(duì)大亞基DP2延伸活性的影響

    在延伸反應(yīng)體系中DP2蛋白用量為5 pmol 的條件下,分別加入0-40 pmol的DP1蛋白,延伸反應(yīng)2 min后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,在DP1含量較低時(shí),DP2的延伸活性仍可以使DNA鏈正常復(fù)制延伸,但DP1用量達(dá)到1.5 pmol時(shí)(第4泳道)已開始導(dǎo)致延伸鏈被降解,出現(xiàn)游離的熒光分子;當(dāng)DP1與DP2的量相當(dāng)時(shí)(第5泳道),DP2延伸的DNA開始明顯被降解,但仍有完整的延伸鏈保留;當(dāng)DP1用量大于DP2時(shí)(第6,7泳道),體系內(nèi)延伸復(fù)制的DNA和熒光引物都被降解。因此可以推測(cè),至少在細(xì)胞外體系中,在Pol D DNA聚合酶執(zhí)行復(fù)制功能時(shí),復(fù)制效率達(dá)到最高時(shí)的小亞基DP1與大亞基DP2的最佳濃度比低于0.3∶1,并且至少在DP1的量提高到與DP2的量相當(dāng)時(shí)(即1∶1),就有必要使用其他的功能蛋白來(lái)抑制小亞基DP1的外切酶活性。

    圖4 DP1濃度對(duì)DP2延伸活性的影響

    2.2.4 重組Pol D DNA聚合酶大亞基DP2對(duì)小亞基DP1外切酶活性的影響

    在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為20 pmol 的條件下,分別加入0-100 pmol 的 DP2蛋白,降解反應(yīng)2 min后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,在無(wú)DP1的情況下,DP2自身不存在外切核酸酶活性,但DP2對(duì)DP1的外切核酸酶活性有影響,在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi),隨著DP2的增加,DP1對(duì)熒光核酸底物的降解更徹底,說明DP2對(duì)DP1的外切核酸酶活性具有促進(jìn)作用。

    圖5 DP2濃度對(duì)DP1降解核酸底物的影響

    在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為50 pmol的條件下,添加50 pmol的DP2蛋白,經(jīng)不同降解反應(yīng)時(shí)間后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。圖6與圖3比較可知,在DP2存在時(shí)DP1降解熒光核酸底物所需的時(shí)間明顯縮短,10-15 min已基本降解完畢,也進(jìn)一步表明DP2具有促進(jìn)DP1外切核酸酶活性的作用。

    圖6 DP2存在時(shí)反應(yīng)時(shí)間對(duì)DP1降解核酸底物的影響

    2.2.5 GINS 51蛋白對(duì)重組Pol D DNA聚合酶小亞基DP1外切酶活性的影響

    古菌的GINS四聚體會(huì)與Cdc45、MCM(Minichromosome Maintenance)、Pol D、PCNA等蛋白發(fā)生相互作用[12-15],是古菌細(xì)胞存活必需的蛋白復(fù)合物。在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為5 pmol的條件下,分別加入0-80 pmol的Thermococcussp.4557 GINS 51蛋白,降解反應(yīng)2 min后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,在無(wú)DP1的情況下,GINS 51自身不存在外切核酸酶活性,但GINS 51對(duì)DP1的外切核酸酶活性有影響,在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi),隨著GINS 51的增加,DP1對(duì)熒光核酸底物的降解呈減弱趨勢(shì),說明GINS 51對(duì)DP1的外切核酸酶活性有抑制作用。

    在降解反應(yīng)體系中DP1蛋白用量為50 pmol的條件下,添加50 pmol的GINS 51蛋白,經(jīng)不同降解反應(yīng)時(shí)間后,其聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖8所示。圖8與圖3比較可知,相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi),加入GINS 51后DP1降解核酸底物的條帶略有減少,也說明GINS 51對(duì)DP1的外切核酸酶活性有一定抑制作用。

    圖7 GINS 51濃度對(duì)DP1降解核酸底物的影響

    圖8 GINS 51存在時(shí)反應(yīng)時(shí)間對(duì)DP1降解核酸底物的影響

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),純化的重組Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶大亞基DP2蛋白具有DNA復(fù)制延伸活性,小亞基DP1蛋白具有3′→5′外切核酸酶活性,這與此前人們對(duì)Pol D DNA聚合酶的認(rèn)識(shí)一致[16]。在DNA復(fù)制過程中,DNA聚合酶會(huì)對(duì)復(fù)制錯(cuò)誤的片段進(jìn)行降解,以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。有研究表明Pol D DNA聚合酶是由小亞基DP1和大亞基DP2以1∶1形成的二聚體[17],本研究發(fā)現(xiàn)Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性較強(qiáng),在與大亞基DP2以1∶1的比例結(jié)合時(shí),大亞基DP2復(fù)制延伸的DNA被明顯降解,表明單獨(dú)按1∶1形成的小亞基DP1和大亞基DP2二聚體無(wú)法完成DNA的復(fù)制延伸;由于GINS 51對(duì)小亞基DP1的外切核酸酶活性有抑制作用,因此推測(cè)Pol D DNA聚合酶完成DNA的復(fù)制延伸功能時(shí)可能有GINS 51參與調(diào)控小亞基DP1的外切核酸酶活性。Lu等[18]對(duì)Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶與GINS、GAN等蛋白進(jìn)行了分子篩互作分析,并提出了名為Pol D-GINS-GAN的古菌DNA復(fù)制復(fù)合體模型;該研究表明,單獨(dú)的Pol D DNA聚合酶大亞基DP2與GINS、GAN等蛋白不發(fā)生互作,而單獨(dú)的Pol D DNA聚合酶小亞基DP1可以與GINS 51發(fā)生互作,并且單獨(dú)的GINS 51與GAN發(fā)生互作,因此大亞基DP2需要借助小亞基DP1才能與復(fù)制叉上的復(fù)制復(fù)合體連接。結(jié)合本研究結(jié)果,可以進(jìn)一步推測(cè)Pol D DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中的功能與機(jī)理:GINS 51與小亞基DP1結(jié)合在一起,通過DP1再與大亞基DP2連接;大亞基DP2與DNA底物結(jié)合并行使復(fù)制延伸功能;GINS 51通過抑制小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性來(lái)保證大亞基DP2可以順利進(jìn)行新鏈的復(fù)制延伸;同時(shí),當(dāng)大亞基DP2正在合成的新鏈出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí),小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性被激活,迅速切除錯(cuò)配片段,從而保證DNA復(fù)制順利進(jìn)行。DNA復(fù)制錯(cuò)配發(fā)生時(shí)GINS 51對(duì)小亞基DP1的3′→5′外切核酸酶活性的抑制作用如何解除,復(fù)制過程中GAN、PCNA、SSB等其他復(fù)制因子、調(diào)控因子如何結(jié)合并參與調(diào)控,仍然有待進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    利用熒光標(biāo)記核酸引物進(jìn)行的DNA復(fù)制延伸實(shí)驗(yàn)和熒光標(biāo)記核酸底物進(jìn)行的DNA降解實(shí)驗(yàn)表明,純化的重組Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶大亞基DP2蛋白具有DNA復(fù)制延伸活性;純化的重組Thermococcussp.4557 Pol D DNA聚合酶小亞基DP1蛋白具有3′→5′外切核酸酶活性。DP2蛋白的延伸活性受到DP1蛋白的影響,若DP1與DP2濃度比例小于0.3∶1時(shí),DP2能完成熒光核酸引物的延伸;DP1提高到與DP2含量相當(dāng)(1∶1)時(shí),出現(xiàn)明顯的延伸產(chǎn)物和熒光引物降解現(xiàn)象;DP1與DP2的濃度比進(jìn)一步提高到3∶1時(shí),可將延伸產(chǎn)物和熒光引物完全降解。Thermococcussp.4557的DP2蛋白和復(fù)制相關(guān)蛋白GINS 51對(duì)DP1蛋白的外切核酸酶活性有不同的作用,DP2蛋白對(duì)DP1蛋白的外切核酸酶活性有促進(jìn)作用,而GINS 51對(duì)DP1蛋白的外切核酸酶活性有抑制作用。

    猜你喜歡
    核酸酶外切凝膠電泳
    粘質(zhì)沙雷氏菌全能核酸酶的研究進(jìn)展
    關(guān)于橢圓外切平行四邊形的一個(gè)幾何不變量
    含季銨鹽的芳酰腙配體的銅 (Ⅱ)配合物的合成和表征:體外DNA鍵合和核酸酶活性
    多種Cas12a蛋白變體能識(shí)別不同的PAM序列(2020.4.27 Plant Biotechnology Journal)
    探究拋物線內(nèi)接、外切三角形的性質(zhì)
    橢圓內(nèi)接外切六邊形的幾何特性研討
    圓外切三角形與圓的關(guān)系
    用megaTAL 核酸酶對(duì)原代人T 細(xì)胞CCR5 基因座進(jìn)行有效修飾可建立HIV-1 抵抗力
    擠壓添加耐高溫α—淀粉酶高粱輔料麥汁的蛋白質(zhì)組分分析
    基于DNA計(jì)算的最大權(quán)團(tuán)問題設(shè)計(jì)
    一级爰片在线观看| 超碰97精品在线观看| 午夜激情福利司机影院| 久久精品夜色国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲av不卡在线观看| 观看免费一级毛片| 中文字幕久久专区| 久久久欧美国产精品| 一个人看视频在线观看www免费| 波野结衣二区三区在线| 国产有黄有色有爽视频| 国产永久视频网站| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美国产精品一级二级三级 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品福利在线免费观看| 99久久精品热视频| 五月玫瑰六月丁香| 有码 亚洲区| 欧美性感艳星| 久久 成人 亚洲| 日韩免费高清中文字幕av| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品国产av蜜桃| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 十八禁网站网址无遮挡 | 色哟哟·www| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 五月开心婷婷网| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久99热这里只频精品6学生| 性色av一级| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 搡老乐熟女国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 一本色道久久久久久精品综合| 成人无遮挡网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 岛国毛片在线播放| 亚洲av男天堂| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 日本免费在线观看一区| 麻豆国产97在线/欧美| 精品人妻熟女av久视频| 免费人成在线观看视频色| 国产探花极品一区二区| 亚洲,欧美,日韩| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 人妻少妇偷人精品九色| 中文字幕制服av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 色5月婷婷丁香| 精品熟女少妇av免费看| 国产黄色免费在线视频| 五月玫瑰六月丁香| 日韩成人av中文字幕在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品一二三区在线看| av在线老鸭窝| 岛国毛片在线播放| av天堂中文字幕网| 日本黄大片高清| 日日撸夜夜添| 在线观看免费高清a一片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 下体分泌物呈黄色| 一级黄片播放器| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲第一av免费看| 麻豆成人av视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产精品欧美亚洲77777| 免费观看无遮挡的男女| 国产成人aa在线观看| 老熟女久久久| 亚洲性久久影院| 男女免费视频国产| 欧美bdsm另类| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 熟女av电影| 久久久久国产网址| 成人免费观看视频高清| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 赤兔流量卡办理| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲,欧美,日韩| 交换朋友夫妻互换小说| 99热国产这里只有精品6| 精品久久久久久久久av| av在线播放精品| 国产 精品1| 亚洲精品一区蜜桃| h视频一区二区三区| 精品酒店卫生间| 亚洲精品自拍成人| 亚洲自偷自拍三级| 丰满少妇做爰视频| 亚洲成人一二三区av| 日韩国内少妇激情av| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩电影二区| freevideosex欧美| 好男人视频免费观看在线| 国产 一区 欧美 日韩| 日本免费在线观看一区| 偷拍熟女少妇极品色| 中文字幕制服av| 九九在线视频观看精品| 91久久精品国产一区二区三区| 美女高潮的动态| www.av在线官网国产| 99热网站在线观看| 久久久色成人| 在现免费观看毛片| 国产在线男女| 亚洲欧洲国产日韩| 五月天丁香电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 日日啪夜夜撸| 欧美成人一区二区免费高清观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 人妻一区二区av| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲四区av| 午夜视频国产福利| 久久国产乱子免费精品| 亚洲精品日本国产第一区| 18+在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一区在线观看完整版| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品国产av在线观看| av国产免费在线观看| 插阴视频在线观看视频| 亚洲性久久影院| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产片特级美女逼逼视频| 中文资源天堂在线| 日韩中文字幕视频在线看片 | 亚洲欧美精品自产自拍| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 永久网站在线| 观看美女的网站| 直男gayav资源| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲av成人精品一区久久| 国产极品天堂在线| 高清欧美精品videossex| 蜜桃在线观看..| 男女下面进入的视频免费午夜| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品视频人人做人人爽| 国产高清不卡午夜福利| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产亚洲91精品色在线| 99久久综合免费| 国产中年淑女户外野战色| 日本欧美视频一区| 国产男女超爽视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 久久影院123| 国产 精品1| 日韩电影二区| 黄色日韩在线| av免费在线看不卡| 插阴视频在线观看视频| 在线精品无人区一区二区三 | 欧美日本视频| 精品午夜福利在线看| 秋霞在线观看毛片| 亚洲av日韩在线播放| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 高清在线视频一区二区三区| 国产 一区精品| 春色校园在线视频观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 97超视频在线观看视频| 如何舔出高潮| 91久久精品电影网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩电影二区| 亚洲av.av天堂| 少妇熟女欧美另类| 久久女婷五月综合色啪小说| 99九九线精品视频在线观看视频| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美bdsm另类| 久久精品久久久久久久性| 国产有黄有色有爽视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 草草在线视频免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品久久久久久久电影| 久久97久久精品| 日韩电影二区| 97超视频在线观看视频| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av日韩在线播放| 国产av国产精品国产| 免费人成在线观看视频色| 最新中文字幕久久久久| 秋霞在线观看毛片| 欧美精品一区二区大全| 91精品国产国语对白视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| videossex国产| 麻豆成人av视频| 久久久国产一区二区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品福利在线免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 99精国产麻豆久久婷婷| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产在线男女| av免费在线看不卡| 亚洲图色成人| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 免费观看的影片在线观看| 国产在线男女| 边亲边吃奶的免费视频| 午夜免费观看性视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品色激情综合| 99久久综合免费| 亚洲丝袜综合中文字幕| 五月伊人婷婷丁香| 91精品伊人久久大香线蕉| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品,欧美精品| 久久午夜福利片| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产 一区精品| 亚洲精品国产av成人精品| 中文字幕久久专区| 只有这里有精品99| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产91av在线免费观看| 欧美三级亚洲精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 97超碰精品成人国产| 97超视频在线观看视频| av在线app专区| 少妇人妻一区二区三区视频| 秋霞在线观看毛片| 久久久欧美国产精品| 亚洲av.av天堂| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日本黄色日本黄色录像| 色视频在线一区二区三区| 99久久精品一区二区三区| av免费在线看不卡| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 人妻系列 视频| 高清黄色对白视频在线免费看 | 免费观看的影片在线观看| 色综合色国产| 久久青草综合色| 另类亚洲欧美激情| 免费av中文字幕在线| 精品亚洲成国产av| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久久久久久久丰满| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产有黄有色有爽视频| 精品久久久精品久久久| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人a∨麻豆精品| 99re6热这里在线精品视频| 成人特级av手机在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲国产精品专区欧美| 国产乱人偷精品视频| 观看av在线不卡| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美精品一区二区大全| 简卡轻食公司| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费观看的影片在线观看| av天堂中文字幕网| 97热精品久久久久久| 久久久久国产网址| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 高清av免费在线| 丝袜喷水一区| 各种免费的搞黄视频| 亚洲图色成人| 亚洲综合色惰| 在线观看人妻少妇| 黑人高潮一二区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美 日韩 精品 国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国模一区二区三区四区视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品人妻偷拍中文字幕| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品aⅴ在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产在线一区二区三区精| 交换朋友夫妻互换小说| 国国产精品蜜臀av免费| 中文字幕制服av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜免费鲁丝| 在线观看人妻少妇| 在线观看免费日韩欧美大片 | 精品熟女少妇av免费看| 99九九线精品视频在线观看视频| 内地一区二区视频在线| 22中文网久久字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩在线观看h| 免费观看的影片在线观看| 免费av不卡在线播放| 欧美zozozo另类| 国产欧美亚洲国产| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人精品福利久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产在视频线精品| 日本黄大片高清| 99久国产av精品国产电影| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久网色| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲av综合色区一区| 国产精品无大码| 美女视频免费永久观看网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品亚洲成a人片在线观看 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久av网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 日韩欧美精品免费久久| 亚洲成人av在线免费| 精品久久久精品久久久| 我的老师免费观看完整版| av女优亚洲男人天堂| 边亲边吃奶的免费视频| 韩国av在线不卡| 久久99蜜桃精品久久| 欧美3d第一页| 成人国产麻豆网| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲人成网站在线观看播放| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久成人免费电影| 精品亚洲成a人片在线观看 | 伊人久久精品亚洲午夜| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 一本一本综合久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 三级国产精品片| 久久99蜜桃精品久久| 极品教师在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲国产精品999| 精品少妇久久久久久888优播| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 美女内射精品一级片tv| 免费观看在线日韩| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费人妻精品一区二区三区视频| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲av.av天堂| 精品一区二区三卡| 搡老乐熟女国产| 十八禁网站网址无遮挡 | 高清在线视频一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产欧美日韩精品一区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 男女啪啪激烈高潮av片| 妹子高潮喷水视频| 久久99热这里只有精品18| 观看免费一级毛片| 丰满乱子伦码专区| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 五月伊人婷婷丁香| 免费黄频网站在线观看国产| 一级毛片电影观看| 久久久久国产网址| 国产精品久久久久成人av| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av综合色区一区| 亚洲av成人精品一二三区| tube8黄色片| 国产精品三级大全| 伊人久久精品亚洲午夜| 性色avwww在线观看| 国产高潮美女av| 国产视频内射| 26uuu在线亚洲综合色| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产亚洲91精品色在线| 人妻一区二区av| av卡一久久| 天堂中文最新版在线下载| av网站免费在线观看视频| 色视频www国产| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲久久久国产精品| 国产高清有码在线观看视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲国产欧美在线一区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 99re6热这里在线精品视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日本黄大片高清| 麻豆乱淫一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 夫妻午夜视频| 岛国毛片在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 色5月婷婷丁香| 六月丁香七月| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产色婷婷99| 嫩草影院新地址| 插逼视频在线观看| 99热全是精品| 亚洲国产精品专区欧美| 国产在线男女| av卡一久久| 中文天堂在线官网| 国产精品蜜桃在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 少妇的逼水好多| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲欧美精品自产自拍| 性色av一级| 99久久中文字幕三级久久日本| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 午夜福利视频精品| 午夜福利高清视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 赤兔流量卡办理| 国产精品精品国产色婷婷| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 十分钟在线观看高清视频www | 国产 精品1| 1000部很黄的大片| 插阴视频在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 一级毛片 在线播放| 精品亚洲成国产av| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产色爽女视频免费观看| 一级毛片 在线播放| 国产高清三级在线| 精品午夜福利在线看| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产精品欧美亚洲77777| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久97久久精品| 亚洲色图av天堂| 美女内射精品一级片tv| 在线天堂最新版资源| 日韩亚洲欧美综合| 国产永久视频网站| 99热这里只有是精品在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区二区在线观看日韩| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩av免费高清视频| 亚洲无线观看免费| 久久97久久精品| 99国产精品免费福利视频| 六月丁香七月| 永久网站在线| 国产 精品1| 亚洲精品,欧美精品| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久精品久久久久真实原创| 最近最新中文字幕大全电影3| 少妇的逼好多水| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲国产欧美人成| 欧美高清成人免费视频www| 我要看日韩黄色一级片| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品一区在线观看国产| 国产成人一区二区在线| 国产综合精华液| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 国产av码专区亚洲av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产极品天堂在线| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲天堂av无毛| 亚洲人成网站在线播| 国产成人免费观看mmmm| 国产成人a区在线观看| 色哟哟·www| kizo精华| 久久99热这里只频精品6学生| 少妇高潮的动态图| 精品久久久精品久久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美精品一区二区免费开放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩制服骚丝袜av| 在线观看一区二区三区激情| 男女边吃奶边做爰视频| 伦精品一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 日本免费在线观看一区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费少妇av软件| 一级a做视频免费观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲成人手机| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品第二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品无大码| 在线观看免费视频网站a站| 国模一区二区三区四区视频| 国产 一区精品| 国产av一区二区精品久久 | 女性生殖器流出的白浆| 日韩一区二区三区影片| 国产男人的电影天堂91| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美3d第一页| 男女边吃奶边做爰视频| 国产有黄有色有爽视频| 午夜精品国产一区二区电影| 舔av片在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲av在线观看美女高潮| 午夜免费鲁丝| 日韩av在线免费看完整版不卡| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩电影二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 3wmmmm亚洲av在线观看|