無(wú)機(jī)磷溶解菌RW8的篩選、鑒定及對(duì)白三葉促生效果研究

蔡璐，王小利，陳瑩，王子苑，李小冬*

(1.貴州省草業(yè)研究所, 貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省生物技術(shù)研究所, 貴州 貴陽(yáng) 550006)

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無(wú)機(jī)磷溶解菌RW8的篩選、鑒定及對(duì)白三葉促生效果研究

蔡璐1,2，王小利1，陳瑩1，王子苑1，李小冬1*

(1.貴州省草業(yè)研究所, 貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省生物技術(shù)研究所, 貴州 貴陽(yáng) 550006)

從白三葉根際分離篩選9株溶磷微生物，并對(duì)挑選菌株進(jìn)行形態(tài)、細(xì)胞以及種屬鑒定，并分析其對(duì)白三葉的促生效果。通過(guò)分析溶磷圈與溶磷菌落直徑的大小與比值獲得溶磷量與持續(xù)溶磷能力較強(qiáng)的RW8菌株。通過(guò)形態(tài)與掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)RW8是具有鞭毛的短桿菌，其菌落形態(tài)表面光滑，不透明；將RW8 16S rDNA序列比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)其與陰溝腸桿菌屬(Enterobactersp.)的同源性高達(dá)99.5%，Biolog鑒定其與陰溝腸桿菌(Enterobactercloacaess dissolvens)的相似性為0.610。RW8溶磷量達(dá)424.85 μg/mL，溶磷能力可能與RW8的產(chǎn)酸性能(12.30 μg/mL)密切相關(guān)。RW8對(duì)白三葉根系與幼苗的生物產(chǎn)量的分配有顯著影響，接種RW8后能抑制白三葉根系伸長(zhǎng)，根系鮮重與干重有下降趨勢(shì)，但差異不顯著；而幼苗的生物產(chǎn)量(干重與鮮重)均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，并且該現(xiàn)象與植物生長(zhǎng)激素IAA無(wú)關(guān)，其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

溶磷菌；白三葉；陰溝腸桿菌；有機(jī)酸

磷元素與氮元素作為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的2種大量元素，廣泛參與能量轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分裂、光合作用、氧化還原反應(yīng)等重要生理生化過(guò)程[1]。在自然界中，只有0.1%的磷元素能被植物吸收[2]，并且外源施加磷肥有75%被土壤中游離的金屬離子螯合形成難溶性無(wú)機(jī)鹽[3]。西南喀斯特地區(qū)的土壤多為石灰質(zhì)黃壤與紅壤，土壤中高濃度的鈣離子與鐵離子等易與游離的磷酸根離子結(jié)合形成難溶的無(wú)機(jī)磷化合物，造成該區(qū)域富含難溶性無(wú)機(jī)磷，而造成植物可以直接利用的游離磷含量十分匱乏[4-5]。

溶磷微生物是一群能夠溶解土壤中難溶性磷，增加植物可利用磷含量的細(xì)菌、真菌以及放線菌的總稱[6]，它們通過(guò)溶解磷為植物提供營(yíng)養(yǎng)元素，植物則穩(wěn)定的向溶磷微生物提供碳水化合物[7]。以往研究通過(guò)分離培養(yǎng)等方法已經(jīng)從多種不同的生長(zhǎng)環(huán)境中分離純化了許多新的溶磷菌株，這些溶磷微生物與其宿主分屬多個(gè)不同的種屬[8-10]。其中，一些微生物可能具有宿主特異性，如鉤狀木霉(Trichodermahamatum)不僅能特異性促進(jìn)黑吉豆(Vignamungo)的生產(chǎn)性能，還能增加其葉綠素、碳水化合物以及粗蛋白含量[11]。

目前豆科作物根際已經(jīng)成功分離鑒定了一批溶磷微生物，并應(yīng)用于生產(chǎn)。Pankaj等[12]發(fā)現(xiàn)假單胞菌與根瘤菌協(xié)同作用能促進(jìn)大豆(Glycinemax)植株磷、鐵含量提高。用復(fù)合微生物接種劑處理豌豆(Pisumsatium)等能顯著增加豌豆根長(zhǎng)、根系干重及產(chǎn)量[13]；類似的研究結(jié)果在箭筈豌豆(Viciasativa)、苜蓿(Medicagosativa)等作物中都有報(bào)道[14-15]；白三葉(Trifoliumrepens)是在貴州分布較為廣泛的豆科牧草[16]，能通過(guò)自身的根瘤菌的固氮作用增加草地氮元素的含量，但是對(duì)磷元素和鉀元素的消耗較大[17]，然而專門針對(duì)白三葉開(kāi)展溶磷菌相關(guān)研究還比較少。因此篩選并開(kāi)發(fā)與白三葉共生溶磷菌對(duì)提高草地肥力、建設(shè)低碳高效人工草地有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源和樣地自然概況

2010年10月于貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山基地以五點(diǎn)法采取栽培白三葉根際土壤樣品(附健康根系)，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行溶磷菌分離。采樣地位于東經(jīng)106°12′-108°18′、北緯25°04′-27°29′，平均海拔997 m，年均氣溫13.6～19.6 ℃，年均降雨量1100～1400 mm，屬典型亞熱帶溫暖濕潤(rùn)的季風(fēng)氣候。土壤類型為黃壤土，其主要營(yíng)養(yǎng)成分如下，全氮：0.218 g/kg，水解氮：156.98 mg/kg，有效磷：15.02 mg/kg，速效鉀：10.20 mg/kg，有機(jī)質(zhì)：1.695 g/kg，pH值為5.97。

1.2 溶磷菌篩選

溶磷菌分離方法參考林啟美等[18]。具體方法如下，利用磷酸鈣為無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基[3 g/L Ca3(PO4)2，10 g/L葡萄糖，0.5 g/L (NH4)2SO4， 0.2 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.03 g/L MgSO4·7H2O，0.03 g/L MnSO4，1000 mL無(wú)菌水，0.003 g/L FeSO4·7H2O，10 g/L 瓊脂，pH值6.8]進(jìn)行初選，采用10倍稀釋法，取10-5與10-6稀釋倍數(shù)的菌液100 μL均勻涂布于培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，統(tǒng)計(jì)在第3 天形成肉眼可見(jiàn)的菌落并編號(hào)，用直尺測(cè)量并記錄第5, 10及15 天的透明溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)。挑選溶磷效果較好的菌株利用肉湯(Luria-Bertani, LB)培養(yǎng)基對(duì)菌株活化與保存。

1.3 RW8菌株溶解磷酸鈣的能力與有機(jī)酸含量測(cè)定

接種1 mL活化的溶磷菌株到50 mL滅菌的含磷酸鈣液體培養(yǎng)基中[3 g/L Ca3(PO4)2，10 g/L葡萄糖，0.5 g/L (NH4)2SO4， 0.2 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.03 g/L MgSO4·7H2O，0.03 g/L MnSO4，1000 mL無(wú)菌水，0.003 g/L FeSO4·7H2O，pH值6.8]，對(duì)照接等量的無(wú)菌水，重復(fù)3次，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d；10000 r/min室溫離心10 min，采用鉬銻抗比色法測(cè)定其溶磷量[19]。同時(shí)另取15 μL上清液，采用液相色譜技術(shù)分析有機(jī)酸含量[日本島津，紫外檢測(cè)器(210 nm)，C18分析柱，流動(dòng)相為0.01 mol/L KH2PO4，流速為1 mL/min], 具體實(shí)驗(yàn)操作見(jiàn)文獻(xiàn)[20]。

1.4 RW8分泌吲哚乙酸(IAA)能力測(cè)定

接種1 mL活化的溶磷菌株到50 mL滅菌的無(wú)色氨酸King 培養(yǎng)基[21]，空白對(duì)照接種等量的無(wú)菌水，28 ℃，125 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。定性分析：取1 mL菌株懸浮液滴于檢測(cè)板上，陽(yáng)性對(duì)照采用1 mL 50，30與10 μg/mL的植物生長(zhǎng)激素標(biāo)準(zhǔn)品，加入等量S2比色液[22]，15 min內(nèi)室溫下觀察其顏色變化[23]。定量測(cè)定：首先配制100,50,25,12.5與0 μg/mL 5個(gè)濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)品，取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品加等量的S2比色液，混勻，在黑暗中靜置0.5 h后測(cè)定530 nm吸光值，并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，將培養(yǎng)的菌懸液于10000 r/min下離心10 min，取1 mL上清液按照標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定方法測(cè)定530 nm吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中IAA含量。定性與定量分析均設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 RW8菌株鑒定

1.5.1 形態(tài)鑒定 在LB培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，28 ℃培養(yǎng)5 d觀察菌落形態(tài)。接種到50 mL肉湯培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)48 h。采用掃描電鏡(Zeiss EVO18)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5.2 16S rDNA序列分析 接種RW8到15 mL培養(yǎng)基中28 ℃，125 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，用細(xì)菌基因組提取試劑盒(上海生工SK8225)提取DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA序列，引物組合為F27(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)與R1492(TACGGTTACCTTGTTACGACTT)，反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min，25 ℃ 1 min，回收并測(cè)序RW8的16S rDNA序列。將測(cè)序的結(jié)果應(yīng)用NCBI-Blast軟件在線比對(duì)分析。采用BIOLOG微生物全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定篩選菌株的種屬[24]。

1.6 RW8對(duì)白三葉的促生效果分析

將活化的RW8溶磷菌接種到50 mL滅菌的LB培養(yǎng)基中(對(duì)照接種5 mL無(wú)菌水到50 mL滅菌的LB培養(yǎng)基)；28 ℃，125 r/min振蕩培養(yǎng)4～5 d至OD600=0.5，收集備用。供試牧草為白三葉(海法)，由貴州省草業(yè)研究所提供。將白三葉種子用0.1%的升汞表面消毒5 min，再用75%的酒精消毒3～5 min，用無(wú)菌水清洗3～4次，然后將種子播種在Hoagland固體培養(yǎng)基[16][0.945 g/L Ca(NO3)2，0.506 g/L KNO3，0.08 g/L NH4NO3，0.31 g/L Ca3(PO4)2，0.31 g/L AlPO4，0.493 g/L MgSO4，2.5 mL鐵鹽溶液，2 mL微量元素液，pH 6.0，3.5 g/L 瓊脂，蒸餾水1000 mL]上，25 ℃萌發(fā)至幼苗長(zhǎng)到3～4 cm，挑選生長(zhǎng)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，接種5 mL溶磷菌，對(duì)照接種5 mL空白培養(yǎng)基到25 ℃，16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)40 d后測(cè)定相應(yīng)表型性狀，處理組與對(duì)照組各10個(gè)重復(fù)。采用直尺量取莖節(jié)到植株頂端的高度作為株高，量取莖節(jié)到根尖的長(zhǎng)度記為根長(zhǎng)。根系與幼苗生物量測(cè)量，將收獲的組織樣品105 ℃殺青15 min后，65 ℃烘干至恒重后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌RW8的篩選

將稀釋的菌液均勻涂布在篩選培養(yǎng)基，在第3天選取能形成肉眼可見(jiàn)菌落，共獲得9個(gè)菌株，分別命名為RW1～RW9。溶磷圈的大小可以作為溶磷量的指示指標(biāo)，反映不同菌種對(duì)磷酸鈣的溶解能力；菌落直徑大小則反映溶磷菌本身的生長(zhǎng)活力，菌斑與菌落直徑的比值大小反映了不同菌株的相對(duì)溶磷能力。在本研究中，每隔5 d分別記錄并觀察測(cè)量溶磷圈和溶磷菌落的直徑。

在接種后的第5天，溶磷圈的大小分布在0.39～1.03 cm，其中，最大的3個(gè)依次為RW6，RW8與RW5，溶磷菌落的大小分布在0.14～0.33 cm，最大的3個(gè)菌種依次為RW6，RW5與RW8，溶磷圈與菌落比值分布在1.64～3.75，其中最大的3個(gè)依次為RW9，RW4與RW8(表1)。在接種后的第10天，溶磷圈的大小分布在0.59～1.49 cm，其中，最大的3個(gè)依次為RW8，RW9與RW6，溶磷菌落的大小分布在0.24～0.55 cm，最大的3個(gè)菌種依次為RW7，RW8與RW3，溶磷圈與菌落比值分布在1.07～3.04，其中最大的3個(gè)依次為RW8，RW5與RW9(表1)。在接種后的第15天，溶磷圈的大小分布在0.78～1.82 cm，其中，最大的3個(gè)依次為RW8，RW9與RW2，溶磷菌落的大小分布在0.39～0.83 cm，最大的3個(gè)菌種依次為RW1，RW8與RW2，溶磷圈與菌落比值分布在1.29～2.43，其中最大的3個(gè)依次為RW8，RW9與RW6(表1)。綜合溶磷量、溶磷菌活力以及相對(duì)溶磷能力，RW8的應(yīng)用價(jià)值最大，因此，對(duì)其進(jìn)行鑒定以及促生研究。

表1 白三葉根際溶磷菌在磷酸鈣無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上的菌斑與菌落生長(zhǎng)值Table 1 Diameters of plaque and colony of white clover phosphate-solubilizing bacteria (PSB) grown on calcium phosphate medium

注：a， 分離于根系周圍的土壤；b， 分離于根系內(nèi)部；c， 分離于根系表面。

Note:a, Phosphate-solubilizing bacteria was isolated from the soil around the root;b, Phosphate-solubilizing bacteria was isolated from the root extraction;c, Phosphate-solubilizing bacteria was isolated from the root surface.

2.2 溶磷菌RW8鑒定分析

從篩選平皿中將溶磷菌RW8劃線分離單菌落，其表面光滑不透明，邊緣整齊(圖1A，B)。挑取單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后取樣進(jìn)行掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示，RW8為短桿菌，表面光滑，存在周身鞭毛(圖1C)。進(jìn)一步通過(guò)擴(kuò)增16S rDNA獲得長(zhǎng)度為1465 bp的DNA區(qū)段，將測(cè)序的結(jié)果應(yīng)用NCBI-Blast軟件與已測(cè)序的菌種進(jìn)行比對(duì)分析。RW8與路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)和阿斯布里腸桿菌(Enterobacterasburiae)的同源性分別達(dá)99.2%，99.1%；與腸桿菌屬(Enterobactersp.)的同源性達(dá)99.5%(圖2)。采用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀分析鑒定RW8為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacaess dissolvens)，相似性(SIM值)為0.610。

圖1 溶磷菌RW8形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Phenotypic observations of phosphate-solubilizing bacteria RW8

圖2 RW8序列進(jìn)化樹(shù)圖Fig.2 A neighbour join tree of phosphate-solubilizing bacteria strain of RW8Query為RW8比對(duì)模板。The “Query” was the query sequence of RW8.

2.3 溶磷菌RW8溶磷能力與分泌有機(jī)酸能力分析

為了深入分析RW8的溶磷能力，對(duì)其溶磷量進(jìn)行了定量測(cè)定。接種相同體積的RW8活菌與蒸餾水到以磷酸鈣為底物的培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d。接種前，處理組與對(duì)照組培養(yǎng)基中都只有痕量的磷元素，并且它們差異不顯著(P>0.05)，振蕩培養(yǎng)7 d后，對(duì)照組可溶性磷含量與培養(yǎng)前相比沒(méi)有變化，而接種RW8菌種的培養(yǎng)基中可溶性磷含量增高，并顯著高于對(duì)照組(表2，P<0.05)，說(shuō)明RW8具有較強(qiáng)的溶解難溶性無(wú)機(jī)磷能力。

溶磷菌的解磷機(jī)制之一是向環(huán)境中分泌有機(jī)酸，促進(jìn)難溶性磷溶解。定量測(cè)定了RW8向環(huán)境中分泌有機(jī)酸的含量。在接種前培養(yǎng)基中處理組與對(duì)照組均無(wú)有機(jī)酸，并且兩者差異不顯著(表2，P>0.05)，培養(yǎng)7 d后，對(duì)照組中有機(jī)酸含量沒(méi)有顯著變化，而處理組有機(jī)酸含量增加到12.30 mmol/L，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分泌有機(jī)酸是RW8溶磷機(jī)理之一。

表2 RW8溶磷菌株在磷酸鈣培養(yǎng)液中的溶磷量及總有機(jī)酸量Table 2 Available phosphorus and total organic acid concentration of the culture medium after inoculated with RW8 phosphate-solubilizing bacteria (PSB)

注：同列中不同的字母表示差異在P<0.05水平顯著。下同。

Note: Different letters in the same column indicated a significant difference atP<0.05 level. The same below.

2.4 菌株RW8對(duì)白三葉的促生效果

RW8能通過(guò)分泌有機(jī)酸促進(jìn)難溶性磷溶解，然而其是否能促進(jìn)植物生長(zhǎng)還不清楚。比較分析在難溶性無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)條件下，RW8菌種對(duì)白三葉幼苗的生長(zhǎng)與生物產(chǎn)量的影響。接種RW8菌株顯著的抑制了白三葉的根系生長(zhǎng)，處理組比對(duì)照組的根長(zhǎng)減少44.5%(P<0.05)，而溶磷菌對(duì)株高的影響不大，處理組與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05，圖3)。對(duì)生物產(chǎn)量分析發(fā)現(xiàn)，接種RW8溶磷菌顯著促進(jìn)了幼苗生物產(chǎn)量，其中處理組幼苗部分鮮重比對(duì)照組增加55.5%(P<0.05)，干重增加75.9%(P<0.05)。與處理組的根長(zhǎng)顯著縮短不同，接種RW8的根系生物量與對(duì)照組相比呈下降趨勢(shì)，但差異沒(méi)有達(dá)到顯著水平(P>0.05，圖3)。

2.5 溶磷菌分泌3-吲哚乙酸能力

在前人的研究中報(bào)道，土壤微生物分泌植物激素是其對(duì)植物促生作用的重要機(jī)制之一，其中最重要的一種激素為生長(zhǎng)激素，因此，重點(diǎn)分析了RW8分泌生長(zhǎng)激素的能力。通過(guò)染色定性分析發(fā)現(xiàn)RW8菌株不具備IAA分泌能力，定量測(cè)定同樣發(fā)現(xiàn)接種RW8處理組只有痕量的IAA能夠被檢測(cè)到，其與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著區(qū)別(表3，P>0.05)，因此RW8對(duì)白三葉的促生作用不是由于分泌生長(zhǎng)素IAA造成。

圖3 RW8對(duì)白三葉生長(zhǎng)和生物產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of phosphate-solubilizing bacteria (PSB) strain RW8 on root length, plant height and biomass production in white clover*表示差異在P<0.05水平顯著。* stands for a significant difference at P<0.05 level.

3 討論

在初篩過(guò)程中，共鑒定到9個(gè)菌株具有溶磷性，其溶磷能力存在顯著的菌種特異性。在接種早期(5 d)，RW6的溶磷圈與菌落直徑都優(yōu)于RW8(表1)；而在接種中期(第10天)與后期(第15天)，RW8溶磷菌斑以及菌落大小都優(yōu)于RW6(表1)，這種變化可能是由于RW6溶磷機(jī)理不同積累有毒物質(zhì)導(dǎo)致后期生長(zhǎng)的菌體進(jìn)入了衰亡期。或者可能是由于RW6為易發(fā)生突變的菌種，在培養(yǎng)過(guò)程中部分細(xì)菌喪失了溶磷能力。因?yàn)橥豕馊A等[25]研究發(fā)現(xiàn)一些溶磷細(xì)菌在傳代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)喪失解磷能力，而且一旦喪失就不能再恢復(fù)，這可能與細(xì)菌相對(duì)較高的遺傳突變頻率有關(guān)。其具體的形成機(jī)制還有待于后續(xù)研究。因此在篩選細(xì)菌型溶磷菌時(shí)不僅需要考慮溶磷量，還要考慮其持續(xù)解磷能力與遺傳穩(wěn)定性。

表3 溶磷菌株RW8分泌吲哚乙酸(IAA)能力分析Table 3 Indole-3-acetic acid segregation ability of phosphate-solubilizing bacteria (PSB) strain of RW8

具有溶磷能力的微生物種類繁多，已報(bào)道具有溶磷能力的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌等。溶磷真菌溶磷能力強(qiáng)，但種類較少，主要局限于青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)等4個(gè)屬種[11]。溶磷細(xì)菌數(shù)量多，種類豐富，分別在假單胞菌(Pseudomonas)，芽孢桿菌(Bacillus)和陰溝腸桿菌(Enterobacter)等12個(gè)屬種[7,26-28]。本研究系統(tǒng)地從形態(tài)、細(xì)胞(圖1C)以及分子(圖2)等多個(gè)角度綜合鑒定RW8菌株為陰溝腸桿菌。腸桿菌屬的部分菌株具有較高的解磷能力[29]，陰溝腸桿菌對(duì)無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷都具有很好的溶解能力，并已成功被開(kāi)發(fā)為生物菌肥[30]與有機(jī)農(nóng)藥降解菌[31]。李曉舉等[30]發(fā)現(xiàn)施用陰溝腸桿菌能顯著提高烤煙的產(chǎn)量與品質(zhì)，本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)RW8對(duì)白三葉地上部分具有良好的促生作用(圖3)。

溶磷微生物的解磷機(jī)制主要與溶磷菌分泌的溶磷酶活性[32]與酸性物質(zhì)含量密切相關(guān)[33-34]，有機(jī)酸是酸性物質(zhì)的重要一種[35]。目前對(duì)陰溝腸桿菌產(chǎn)酸性研究的報(bào)道較少，在水稻(Oryzasativa)中糞產(chǎn)堿固氮菌A-15能夠利用有機(jī)酸作為碳源，當(dāng)其與陰溝腸桿菌E-26共培養(yǎng)時(shí)固氮效率顯著增加，可能是E-26與A-15的代謝產(chǎn)物存在相互促進(jìn)作用[36]。本研究鑒定的陰溝腸桿菌RW8具有較強(qiáng)的有機(jī)酸分泌能力(表2)，較強(qiáng)的有機(jī)酸分泌能力可能是其溶磷和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的主要機(jī)理之一。

不同的水肥條件可以改變植物植株與根系生物量的分配，前人研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物面臨營(yíng)養(yǎng)脅迫[37]以及干旱脅迫[38]時(shí)會(huì)抑制地上部分生長(zhǎng)，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，可能是由于植物在面臨營(yíng)養(yǎng)或水分脅迫時(shí)刺激根系補(bǔ)償性生長(zhǎng)以吸收更多養(yǎng)分。接種RW8顯著抑制白三葉根系伸長(zhǎng)，但對(duì)根重沒(méi)有顯著影響(圖3)，這種現(xiàn)象可能是由于根粗增加造成。接種RW8的處理組處于富營(yíng)養(yǎng)水平，使植物可以利用更多的能量促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，而對(duì)照組處于缺磷水平需要促進(jìn)根系生長(zhǎng)以從環(huán)境中吸收更多磷元素，研究發(fā)現(xiàn)RW8確實(shí)對(duì)白三葉幼苗生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用(圖3)。然而通過(guò)定性與定量分析都發(fā)現(xiàn)RW8不能分泌植物生長(zhǎng)激素IAA(表3)，這種現(xiàn)象與在禾本科牧草扁穗雀麥(Bromuscatharticus)的研究結(jié)果不完全相同，因此，不同溶磷菌與植物相互作用模式可能存在宿主特異性與調(diào)控方式的多樣性。

4 結(jié)論

從貴州喀斯特生態(tài)條件下的白三葉根際篩選獲得溶磷能力較強(qiáng)的RW8菌株。通過(guò)形態(tài)、細(xì)胞以及分子生物學(xué)鑒定RW8屬于陰溝腸桿菌溶磷細(xì)菌。RW8能夠分泌有機(jī)酸，但不分泌生長(zhǎng)激素IAA。接種RW8顯著抑制了白三葉根系伸長(zhǎng)，但對(duì)根重影響不顯著；對(duì)植物生物產(chǎn)量的促進(jìn)效果明顯，生產(chǎn)應(yīng)用潛力較大。

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Isolation and identification of an inorganic phosphorus-solubilizing bacterium RW8 and its growth-promoting effect on white clover (Trifoliumrepens)

CAI Lu1,2, WANG Xiao-Li1, CHEN Yin1, WANG Zi-Yuan1, LI Xiao-Dong1*

1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 2.GuizhouInstituteofBiotechnology,Guiyang550006,China

Nine strains of inorganic phosphorus-solubilizing bacteria were isolated from the rhizosphere of white clover (Trifoliumrepens), and each strain was identified to the genus and species level based on its phenotypic and cytological characteristics. The growth-promoting effect of each strain on white clover was also analyzed. Strain RW8, which showed the strongest phosphorus-solubilizing activity, was selected based on analyses of the size and ratio of its plaques and colonies. Scanning electron microscopy observations revealed that RW8 wasBacillusbrevis, a flagellated bacterium. Colonies of RW8 were opaque and had a smooth surface. In NCBI blast searches, the 16S rDNA sequence of RW8 showed 99.5% homology with that ofEnterobactersp. A Biolog analysis suggested that RW8 had high similarity (0.610) withEnterobactercloacae. In a phosphorous-dissolving assay, RW8 produced 424.85 μg/mL dissolved phosphorus, which was possibly related to its strong organic acid production (12.30 μg/mL). RW8 strongly affected the biomass distribution to roots in white clover seedlings. Root elongation and the fresh weight and dry weight of roots were lower in RW8-colonized plants than in control plants, although the differences were not statistically significant. However, the seedling biomass (dry weight and fresh weight) of RW8-colonized white clover was significantly greater than that of control plants (P<0.05), and this phenomenon was not a result of indole acetic acid production by the bacterium. Further research is required to determine the precise mechanism of its growth-promoting effect.

phosphorus-solubilizing bacteria; white clover;Enterobactercloacae; organic acids

10.11686/cyxb2016282

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-07-14；改回日期：2016-10-19

貴州省農(nóng)科院專項(xiàng)基金(黔農(nóng)科院院專項(xiàng)[2013]03)，貴州省科技支撐計(jì)劃(黔科合支撐[2016]2504號(hào))和農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)(黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項(xiàng)字[2014]010號(hào))資助。

蔡璐(1987-)，女，貴州貴陽(yáng)人，助理研究員，學(xué)士。 E-mail: cailu225@sina.cn*通信作者Corresponding author. E-mail: lixiaodongzl@163.com

蔡璐, 王小利, 陳瑩, 王子苑, 李小冬. 無(wú)機(jī)磷溶解菌RW8的篩選、鑒定及對(duì)白三葉促生效果研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(5): 181-188.

CAI Lu, WANG Xiao-Li, CHEN Yin, WANG Zi-Yuan, LI Xiao-Dong. Isolation and identification of an inorganic phosphorus-solubilizing bacterium RW8 and its growth-promoting effect on white clover (Trifoliumrepens). Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 181-188.