銅尾礦庫白羊草內(nèi)生真菌的分布及rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育

曹苗文，賈彤*，景炬輝，柴寶峰

(1.山西大學(xué)黃土高原研究所，山西 太原030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原030006)

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銅尾礦庫白羊草內(nèi)生真菌的分布及rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育

曹苗文1，賈彤1*，景炬輝2，柴寶峰1

(1.山西大學(xué)黃土高原研究所，山西 太原030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原030006)

對北方銅業(yè)銅礦峪礦十八河尾礦庫的優(yōu)勢植被白羊草內(nèi)生真菌染菌率進行調(diào)查，采集活體植株進行葉鞘內(nèi)生真菌分離，并對白羊草內(nèi)生真菌的形態(tài)特征及孢子形態(tài)進行描述，同時，選取其中16株進行5.8S-ITS擴增、測序和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，從生長在4個不同恢復(fù)年限子壩的白羊草中分離出形態(tài)不同的內(nèi)生真菌，其中以白色菌落居多，生長速度位于5.515～12.548 mm/d之間。孢子形態(tài)以球型和橢圓型為主，大小介于2.085～7.072 μm之間。分子鑒定結(jié)果顯示16種內(nèi)生真菌屬于3個屬，為赤霉屬(Gibberella)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)，恢復(fù)30年與5年的子壩白羊草內(nèi)生真菌遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，恢復(fù)45年與15年的子壩白羊草內(nèi)生真菌親緣關(guān)系最遠。銅礦庫不同恢復(fù)年限的土壤環(huán)境可能導(dǎo)致白羊草感染內(nèi)生真菌的多樣性，這為進一步豐富銅尾礦庫內(nèi)生真菌資源，揭示生活在銅尾礦的白羊草內(nèi)生真菌的生態(tài)功能提供理論依據(jù)。

銅尾礦庫；重金屬；白羊草；內(nèi)生真菌

十八河尾礦庫位于山西運城垣曲縣，其壩體為人工堆積，將庫區(qū)近壩體尾礦推至壩前，通過碾壓處理將其壓實，上覆黃土，形成壩體[1]。自1969年建壩以來，隨著植被修復(fù)的進行，逐漸形成不同演替階段的植物群落，其中，白羊草(Bothriochloaischaemum)是其優(yōu)勢種之一。白羊草是禾本科孔穎草屬多年生叢生禾草，屬于暖季型草本；短根狀莖，疏叢型，株高在25～80 cm之間；品質(zhì)好，適口性強，耐旱及再生能力強，對土壤酸堿度要求不高，是黃土高原地區(qū)的主要牧草。通常作為優(yōu)勢種生長于斜坡、路邊、田邊和干旱多石等區(qū)域，在山西主要分布在晉城、晉中、運城、臨汾[2-4]。

內(nèi)生真菌(endophyte)在1866年由De Bary首次提出[5]，后定義為生活在植物組織中，但不會讓植物產(chǎn)生可見癥狀的真菌。內(nèi)生真菌種類眾多，分布在各種植物體內(nèi)，從苔蘚，藻類，蕨類到種子植物，從寒帶植物到熱帶植物，從農(nóng)作物到熱帶雨林植物都有發(fā)現(xiàn)[6]。從紅樹林、馬齒莧(Portulacaoleracea)中分離出的鐮刀菌屬(Fusarium)[7-8]，胡楊(Populusdiversifolia)中的青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)[9]，食用菌中分離出的叢赤殼菌(Nectriaceae)[10]，甘草(Glycyrrhizauralensis)中分離出的赤霉菌屬(Gibberella)[11]，從馬齒莧中還分離出附球菌屬(Epicoccum)[8]以及從披堿草(Elymusdahuricus)、羽茅(Achnatherumsibiricum)、羊草(Leymuschinensis)中分離出的Epichloё屬內(nèi)生真菌。比如，天然禾草羊草中存在的Epichloёbromicola，羽茅中的Epichloёsibirica，Epichloёgansuensis[12-17]。但是對天然禾草白羊草中內(nèi)生真菌的研究還未見報道。

本研究所在樣地存在嚴重的鎘、鉛、銅污染問題，但是白羊草依然能夠在此處正常生長，成為優(yōu)勢種，其原因鮮有報道。有研究指出，在高羊茅(Festucaarundinacea)中接種內(nèi)生真菌能夠促進植物在鎘脅迫環(huán)境中生長[18]。深色有隔內(nèi)生真菌通過提高植物光合作用，改變植物根際微生物，促進植物礦質(zhì)元素的吸收和有機養(yǎng)分的吸收來提高植物耐重金屬的能力[19]。那么，白羊草是否因感染內(nèi)生真菌使其能夠很好地適應(yīng)重金屬污染環(huán)境呢？因此，在銅尾礦庫開展白羊草內(nèi)生真菌多樣性的研究具有重要意義。本實驗通過形態(tài)學(xué)描述和分子鑒定的方法，結(jié)合銅尾礦庫土壤理化性質(zhì)，對重金屬污染環(huán)境中的白羊草是否感染內(nèi)生真菌及內(nèi)生真菌特征進行初步研究。旨在探究重金屬污染背景下的植物中內(nèi)生真菌的多樣性，為后續(xù)研究白羊草內(nèi)生真菌在銅尾礦庫恢復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況及土壤理化性質(zhì)測定

選取山西省運城市垣曲縣北方銅業(yè)銅礦峪礦十八河尾礦庫為研究地點，該地年均氣溫13.5 ℃，年均降水量631 mm。從1972年4月使用至今現(xiàn)已筑12級子壩[1]。各個子壩的植被恢復(fù)年限不同，從高到低恢復(fù)年限逐漸增加。各子壩常見植被有：白茅(Imperatacylindrica)、白羊草、白蓮蒿(Artemisiasacrorum)、冷蒿(Artemisiafrigida)、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)等。于2015年7月進行采樣，自上而下共設(shè)置了4個不同恢復(fù)年限(45、30、15、5年)的樣地，采集白羊草和土壤?；氐綄嶒炇液髮Ω鳂拥氐耐寥肋M行了理化性質(zhì)測定。pH值(土∶液=1∶2.5)用酸度計(HI3221 pH/ORP/ISE meter, HANNA, Italy)測定[20]。粒度用粒度儀(Mastersizer 3000, Malvern, UK)測定?？偟?TN)，總碳(TC)，總硫(TS)的測定，首先用球磨儀將其磨成粉末狀，然后用元素分析儀(Vario MACRO, Elementar, Germany)測定。重金屬含量的測定首先用強氧化物對土壤進行消解,再將消解產(chǎn)物用等離子體發(fā)射光譜儀(iCAP 6000, Thermo Fisher, UK)測定[21]。

1.2 白羊草染菌情況調(diào)查

在每個樣地采集不少于30株白羊草地上部分，對葉鞘內(nèi)表皮進行撕片染色，染色劑用苯胺藍(10 g苯酚，10 g乳酸，20 g甘油，0.025 g苯胺藍，100 mL蒸餾水)[12]，染色大約5 min，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下觀察，并計算染菌率(染菌率=染菌植株數(shù)/檢菌植株總數(shù))。

1.3 內(nèi)生真菌分離及孢子觀察

將白羊草葉鞘剪成約1 cm的小段，首先進行植物表面滅菌。放入70%的酒精中5 s，再用5%的次氯酸鈉浸泡7 min，在浸泡過程中不斷搖晃，倒掉次氯酸鈉加入無菌水，用無菌水清洗至少3次，每次30 s。將表面滅菌后的莖段橫放或插入配制好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA，不含抗生素)中(以上過程均在超凈臺操作)，置于25 ℃培養(yǎng)。待真菌從培養(yǎng)基上長出來后，選擇形態(tài)不一的菌落分別進行純化，純化4代后，菌落形態(tài)保持世代不變后進行孢子形態(tài)觀察。將苯胺藍染色液稀釋10倍，滴在載玻片上，挑取菌絲置于染色液上，染色5 min，蓋上蓋玻片用數(shù)碼成像顯微系統(tǒng)(Moticam Pro 205A,Motic,Germany)觀察。染菌情況調(diào)查和內(nèi)生真菌分離在采集回來后及時進行了實驗。

1.4 內(nèi)生真菌的分子鑒定

內(nèi)生真菌DNA提取[12]。提出來的DNA用多功能酶標儀(Infinite M200Pro NanoQuant, TECAN, Austria)測定其濃度和純度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結(jié)果。PCR反應(yīng)：將提出來的DNA稀釋至10 ng/μL，選用ITS5～ITS4作為引物(ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[5]。反應(yīng)體系50 μL，含有：Template 10 μL，ITS4、ITS5 0.75 μL(10 μmol/L)(上海生工)，10×EasyTaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，EasyTaqDNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 29 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，40 s；52 ℃，50 s；72 ℃，60 s；72 ℃，10 min，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定PCR結(jié)果，選擇最佳的PCR產(chǎn)物送至華大基因有限公司測序。

1.5 序列數(shù)據(jù)分析

首先把測序結(jié)果前端和后端的雜峰序列去除，然后在National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫進行BLAST，選擇相似性高的序列與測出來的序列進行比對并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。比對時，先使用MEGA6校準，然后去除比對序列兩端多余的部分，使序列等長。然后運用最大似然法(Maximum-Likelihood法)進行系統(tǒng)發(fā)育分析，制作系統(tǒng)進化樹，同時計算遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)及白羊草染菌率調(diào)查

根據(jù)土壤環(huán)境質(zhì)量三級標準(GB15618-1995)，本地區(qū)的土壤中鎘(1 mg/kg)、鉛(500 mg/kg)嚴重超標，而30年子壩的銅(400 mg/kg)嚴重超標。pH值位于7.5～8.8之間，為堿性土壤。土壤平均粒徑位于0.05～0.25 mm之間，屬于細砂粒。由總氮可以看出，該地土壤養(yǎng)分低，并且4個梯度間土壤理化性質(zhì)明顯不同(表1)。

2.2 內(nèi)生真菌菌落及孢子形態(tài)

從4層子壩白羊草中共分離純化出16種內(nèi)生真菌，菌落顏色大多為白色，圓形，棉狀，少數(shù)呈褐色或淡黑，淡紫。另外，菌落邊緣有的較為整齊，有的比較不規(guī)則,而且其生長速度不一且孢子形態(tài)不同。白羊草內(nèi)生真菌生長速度位于5.515～12.548 mm/d之間，孢子大小位于2.085～7.072 μm之間，孢子形態(tài)有柱型、橢圓、球型(圖1，表2)。根據(jù)菌落形態(tài)及孢子特征初步得出：這16種菌有可能屬于鐮刀菌屬、木霉屬、赤霉屬、青霉屬、叢赤殼屬[22-24]。

表1 土壤理化性質(zhì)及染菌率情況Table 1 Soil properties and contamination rate

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，同行數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data in the Table are as mean±SE, different letters in the same row indicate significant difference atP<0.05 level.

2.3 PCR結(jié)果及其測序結(jié)果的系統(tǒng)進化分析

在對內(nèi)生真菌提取DNA后，對DNA的5.8S-ITS(internal transcribed spacer)進行擴增并測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行了BLAST比對，挑選出與分離菌株相似的序列，用于系統(tǒng)發(fā)育分析。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示PCR產(chǎn)物特異，沒有其他雜核苷酸產(chǎn)生，片段長度約為600 bp，確定為目的條帶(圖2)。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)2～14及16號菌5.8S-ITS序列相似率達99%以上，所以用1,2,15號菌的序列進行BLAST比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)比對結(jié)果得出的與實驗菌相似程度達97%以上的為赤霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬。鐮刀菌屬在無性時期屬于半知菌亞門，瘤座菌目(Tuberculariales)，有性時期為子囊菌亞門(Deuteromycotina)，赤霉屬。青霉屬屬于子囊菌(Ascomycotina)。

圖2 白羊草內(nèi)生真菌基因組PCR結(jié)果Fig.2 PCR products of 5.8S-ITS from endophytes associated with B. ischaemum 1～16代表圖1的16個菌落。1-16 represents 16 colonies in Figure 1.

實驗菌序列與相似序列進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)2號與15號菌進化關(guān)系較近，而1號菌相對較遠 (圖3)。研究發(fā)現(xiàn)真菌中的魯氏毛霉菌(Mucorrouxii)，少根根霉菌(Rhizopusarrhizus)和白腐真菌(Trametesversicolor)對重金屬鎘有生物吸附能力，其中白腐真菌的吸附能力達到了 165.2 mg/g[25]；另外綠色木霉(Trichodermaviride)[26]， 小球殼孢菌(Microsphaeropsissp.)，稻根曲霉(Rhizopusoryzae)，琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)，塔賓曲霉菌(Aspergillustubingensis)，秀麗單頂孢(Monacrosporiumelegans)，棒孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)[27]， 毛霉屬CBRF59(Mucorsp. CBRF59)，少根根霉菌[28]等內(nèi)生真菌也已經(jīng)證明對重金屬有吸附能力。把分離出的實驗菌與已知的吸附重金屬的內(nèi)生真菌進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，I1與綠色木霉有比較近的親緣關(guān)系，其他實驗菌與這些吸附重金屬的菌關(guān)系較遠(圖4)。從表3可以看出，30年子壩與5年子壩的白羊草內(nèi)生真菌遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近。45年子壩與15年子壩遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠。

圖3 對rDNA-ITS測序結(jié)果進行系統(tǒng)進化分析(Maximum-Likelihood法)Fig.3 The phylogenetic analysis of rDNA-ITS sequencing results(ML method) I1、I2、I15對應(yīng)圖1的1、2、15；分支上的數(shù)字代表大于或等于50%的bootstrap。下同。I1, I2, I15 corresponds to 1, 2, 15 in Fig.1, the number on the branch is greater than or equal to 50% of the bootstrap. The same below.

樣地Samples45年子壩45yearssub-dam30年子壩30yearssub-dam15年子壩15yearssub-dam30年子壩30yearssub-dam0.140215年子壩15yearssub-dam0.18000.03975年子壩5yearssub-dam0.14020.00190.0383

圖4 白羊草內(nèi)生真菌與已知吸附重金屬的內(nèi)生真菌系統(tǒng)進化樹分析(Maximum-Likelihood法)Fig.4 B. ischaemum endophytes and heavy metal adsorption endophytes phylogenetic analysis(ML method)

3 討論

3.1 內(nèi)生真菌在白羊草中的分布

本研究所調(diào)查的4個內(nèi)生真菌種群分布在同一地區(qū)，空間距離較近。調(diào)查結(jié)果顯示白羊草在該地區(qū)的染菌率不高。內(nèi)生真菌的類型與感染率隨不同種群變化而變化[29]。從土壤理化性質(zhì)可以看出5年和30年子壩的C/N與pH基本沒有差異，這可能是造成這兩個樣地白羊草內(nèi)生真菌完全相同的原因，因為土壤C/N和pH會影響土壤真菌的生長[30]，而土壤微生物群落會影響植物內(nèi)生真菌的結(jié)構(gòu)[31]。15年和45年子壩土壤C/N差異不明顯，pH有極顯著差異，這會導(dǎo)致這兩個樣地白羊草內(nèi)生真菌產(chǎn)生差異[30]。另一個導(dǎo)致內(nèi)生真菌差異的原因是由于白羊草所處的植物群落不同，不同的植被群落代表多樣的凋落物類型，而凋落物是內(nèi)生真菌宿主的主要營養(yǎng)來源[32-33]，營養(yǎng)的多樣性造成內(nèi)生真菌繁殖體的多樣性[34]。在恢復(fù)15年的樣地中，植被以矮小的草本和零星低矮的灌木為主，如冷蒿，曲枝委陵菜(Potentillayokusaiana)，杠柳(Periplocasepium)等，且植被覆蓋度低，種類少。而45年子壩的植被以較高的荊條(Vitexnegundovar.heterophylla)，狼尾草為主，植被蓋度基本為100%，植物多樣性高。2012年在對云南會澤的鉛鋅礦廢渣研究中也從其上生長的植物中分離出鐮刀菌屬和青霉屬的內(nèi)生真菌[35]。在四川漢源鉛鋅礦區(qū)植物中也得出相似的結(jié)果[36]。這與該銅尾礦庫白羊草內(nèi)生真菌的分離結(jié)果有相同之處。

3.2 內(nèi)生真菌培養(yǎng)特征及孢子多態(tài)性

根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，內(nèi)生真菌菌落大多呈圓形、白色，有少數(shù)為紅色或褐色，還有些許發(fā)黑的情況。菌落表面似氈狀覆蓋，質(zhì)地疏松，生長速度不一。白羊草內(nèi)生真菌生長速度位于5.515～12.548 mm/d之間，比分離自內(nèi)蒙古中東部羽茅0.22～2.86 mm/d[13]和紅菇(Russulavinosa)1.89～2.63 mm/d[10]中的內(nèi)生真菌生長速度快，孢子大小位于2.085～7.072 μm之間，與羽茅(4.8～9.8 μm)、光稃早熟禾(Poapsilolepis)(2.7～5.0 μm)的內(nèi)生真菌孢子大小相近[13]，而比麥冬(Ophiopogonjaponicus)內(nèi)生真菌的孢子(7.2～11.0 μm)小[37]。從不同恢復(fù)年限的子壩中分離出形態(tài)各異的內(nèi)生真菌，首先，可能由于恢復(fù)年限不同導(dǎo)致白羊草的生境差異，從而不僅影響白羊草的生長，也間接影響了白羊草內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)；其次，可能是由于白羊草所含營養(yǎng)物質(zhì)不同，不同真菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求有一定差異，從而影響內(nèi)生真菌的侵染和生長[38]；再者，宿主植物基因型不同，所含內(nèi)生真菌的種類也不同，說明有些內(nèi)生真菌存在宿主特異性[39]。

3.3 白羊草中內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

雖然分離出的內(nèi)生真菌形態(tài)和序列均不同，但是分析各子壩白羊草中的內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)，它們的聚類分析基本都可以聚在一起，親緣關(guān)系較近。子壩間的遺傳距離最大的是45年子壩和15年子壩的白羊草內(nèi)生真菌,為0.18。這可能是因為子壩上植被恢復(fù)年限間隔較長，但其空間距離較小，因而對內(nèi)生真菌的基因交流影響較小[13]。但子壩之間白羊草內(nèi)生真菌的遺傳距離不完全為0，說明恢復(fù)年限帶來的環(huán)境變化對子壩之間內(nèi)生真菌的遺傳距離還是有一定影響。分離得到的內(nèi)生真菌表型有16種，但是5.8S-ITS序列只有3種。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是，同一屬不同種的真菌，基因組5.8S-ITS區(qū)雖然差異不大，但仍表現(xiàn)出不同的菌落形態(tài)及孢子特征。

3.4 尾礦庫白羊草內(nèi)生真菌與已知吸附重金屬內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

把白羊草內(nèi)生真菌與已知吸附重金屬的內(nèi)生真菌做系統(tǒng)進化樹分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，I1與綠色木霉有相近的親緣關(guān)系，綠色木霉對鎘有良好的吸附作用[27]，與它親緣關(guān)系相近的I1能夠生活在鎘超標土壤的植物體內(nèi)，是否對鎘也有吸附作用還需進一步研究。而其他菌雖然與這些已知的吸附重金屬的內(nèi)生真菌親緣關(guān)系相對較遠，但是在這種尾礦庫環(huán)境下依然能夠在白羊草內(nèi)正常生存，其能夠耐受這種環(huán)境的原因及其是否也具有吸附重金屬的能力還有待進一步研究。

4 結(jié)論

利用PDA培養(yǎng)基分離的方法，從4個不同恢復(fù)年限的子壩白羊草中共分離出16種不同形態(tài)內(nèi)生真菌。各菌落形態(tài)各異，生長速度位于5.515～12.548 mm/d之間，孢子形態(tài)以球型和橢圓型為主，孢子大小介于2.085～7.072 μm。

分子鑒定結(jié)果顯示16種內(nèi)生真菌的5.8S-ITS序列有3種類型，分別屬于鐮刀菌屬、赤霉屬、青霉屬。通過計算遺傳距離得出，子壩之間白羊草內(nèi)生真菌的基因交流影響較小，同時，不同恢復(fù)年限對子壩之間內(nèi)生真菌的遺傳距離也存在一定的影響。

將白羊草內(nèi)生真菌與已知的吸附重金屬的內(nèi)生真菌做系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，I1與吸附鎘的綠色木霉親緣關(guān)系較近。

References：

[1] Tan Y X. Study on the Potential Harm and Prevention Measure in Shibahe Tailing[D]. Xi’an: Chang’an University, 2012. 譚永祥. 十八河尾礦庫潛在危害及防治措施研究[D]. 西安: 長安大學(xué), 2012.

[2] Xu Q F, Dong K H. The dominant species of shrub grassland-Bothriochloaischaemum. Grassland and Turf, 2004, (3): 20-24. 許慶方, 董寬虎. 溫性灌草叢類建群種——白羊草. 草原與草坪, 2004, (3): 20-24.

[3] Guo J M. Comprehensive Evaluation of Different Population ofBothriochloaischaemumDrought Resistance in Shanxi[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2015. 郭晉梅. 山西不同居群白羊草抗旱性綜合評價[D]. 太谷: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[4] Mi J. The Reproductive Character and Regrowth Performance of Old World Bluestem (Bothriochloaischaemum) Population in Shanxi Rangelands[D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2005. 米佳. 山西白羊草種群繁殖特性及再生性能研究[D]. 太谷: 山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[5] Zhang X, Li Y, Wei Y K,etal. Distribution and rDNA-ITS sequence analysis ofEpichloё endophyte symbiosis withAchnatherumsibiricumin mid- and eastern Inner Mongolia Steppe. Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(7): 2904-2910. 張欣, 李熠, 魏宇昆, 等. 內(nèi)蒙古中東部草原羽茅Epichloё屬內(nèi)生真菌的分布及rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育. 生態(tài)學(xué)報, 2007, 27(7): 2904-2910.

[6] Arnold A E. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi: progress, challenges, and frontiers. Fungal Biology Reviews, 2007, 21(2): 51-66.

[7] Cheng Z S, Tang W C, Su Z J,etal. Identification of mangrove endophytic fungus 1403 (Fusariumproliferatum) based on morphological and molecular evidence. Journal of Forestry Research, 2008, 19(3): 219-224.

[8] Zhang Y. Isolation of Endophytic Fungi fromPortulacaoteraceaand Study on their Influence on Hosts Growth[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2015. 張瑜. 馬齒莧內(nèi)生真菌的分離、鑒定及其對宿主生長的影響[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[9] Han Y J, Liang Y, Yuan X Y. Isolation and antifungal activity of endophyte fromPopuluseuphraticaoliver. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2014, 23(6): 189-194. 韓艷潔, 梁艷, 袁秀英. 胡楊內(nèi)生真菌分離及其抑菌活性研究. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 23(6): 189-194.

[10] Zeng X L, Liu D L. Isolation and mycelial growth characteristics ofNectriasp. isolated fromRussulagriseocarnosa. Edible Fungi of China, 2013, 32(4): 32-34. 曾憲錄, 劉德良. 灰肉紅菇內(nèi)生真菌的分離及生長特性研究. 中國食用菌, 2013, 32(4): 32-34.

[11] Tie W F, Hu Y L, Zhu J B,etal. Isolation and identification of endophytical fungus inLicoricecollected from Xinjiang area. Biotechnology Bulletin, 2010, (9): 149-153. 帖衛(wèi)芳, 胡鳶雷, 祝建波,等. 甘草內(nèi)生真菌的分離及鑒定. 生物技術(shù)通報, 2010, (9): 149-153.

[12] Zhu M J. Diversity of Endophytes Associated withLeymuschinensisand Its Effects on Host Physio-ecological Characteristics in the Mid-Eastern Inner Mongolia Steppe[D]. Tianjin: Nankai University, 2013. 朱敏杰. 內(nèi)蒙古中東部草原羊草內(nèi)生真菌多樣性及其對宿主生理生態(tài)特性的影響[D]. 天津: 南開大學(xué), 2013.

[13] Wei Y K, Gao Y B, Li C,etal. Genetic diversity ofNeotyphodiumendophytes isolated fromAchnatherumsibiricumpopulation in mid-and Eastern Inner Mongolia steppe. Journal of Plant Ecology, 2006, 30(4): 640-649. 魏宇昆, 高玉葆, 李川,等. 內(nèi)蒙古中東部草原羽茅內(nèi)生真菌的遺傳多樣性. 植物生態(tài)學(xué)報, 2006, 30(4): 640-649.

[14] Song H. Phylogeny of NineElymusSpecies and Related AsexualEpichloё Endophyte[D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2015. 宋輝. 九種披堿草屬植物及其Epichloё內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進化[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2015.

[15] Zhu M J, Ren A Z, Wen W,etal. Diversity and taxonomy of endophytes fromLeymuschinensisin the Inner Mongolia steppe of China. FEMS Microbiology Letters, 2013, 340(2): 135-145.

[16] Zhang X. Diversity of Endophyte inAchnatherumsibiricumand Their Coevolution with Host Plants in the Middle East of Inner Mongolia[D]. Tianjin: Nankai University, 2009. 張欣. 內(nèi)蒙古中東部草原羽茅種群內(nèi)生真菌的多樣性及與宿主植物協(xié)同進化的研究[D]. 天津: 南開大學(xué), 2009.

[17] Leuchtmann A, Bacon C W, Schardl C L,etal. Nomenclatural realignment ofNeotyphodiumspecies with genusEpichloё. Mycologia, 2014, 106(2): 202-215.

[18] Ren A Z, Li C, Gao Y B. Endophytic fungus improves growth and metal uptake ofLoliumarundinaceumDarbyshire Ex. Schreb. International Journal of Phytoremediation, 2011, 13(3): 233-243.[19] Ban Y H. Mechanisms of Dark Septate Endophyte Isolated from Pb-Zn Mine Improving Plant Lead Tolerance[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2013. 班宜輝. 鉛鋅礦區(qū)深色有隔內(nèi)生真菌提高植物耐Pb機制研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2013.

[20] Jiang S, Xu Z Q, Zhang C J. Determination and analysis on the pH of soil in Wanyuan City of Sichuan Province. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2009, (25): 12105-12108. 蔣實, 徐爭啟, 張成江. 四川省萬源市土壤pH值測定及土壤酸堿度分析. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, (25): 12105-12108.

[21] Long J H, Tan J, Wu Y J,etal. A comparative study on the detection of heavy metal in soil with different digestion methods. Environmental Monitoring in China, 2013, (1): 123-126. 龍加洪, 譚菊, 吳銀菊, 等. 土壤重金屬含量測定不同消解方法比較研究. 中國環(huán)境監(jiān)測, 2013, (1): 123-126.

[22] Deng H H, Hong W, Wu C Z,etal. Separation, selection and identification on producing lipid strains of endophytic fungi fromPinusmassoniana. Journal of Plant Resources and Environment, 2014, (2): 27-33. 鄧慧華, 洪偉, 吳承禎, 等. 馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂菌株的分離、篩選和鑒定. 植物資源與環(huán)境學(xué)報, 2014, (2): 27-33.

[23] Zhou Y L. Mycology[M]. Beijing: Higher Education Press (HEP), 1986. 周與良. 真菌學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 1986.

[24] Sun Y, Sun Y, Chen F M,etal. 6 species of endophyticFusariumisolation and identification. Jiangsu Agricultural Science, 2010, (5): 437-439. 孫勇, 孫穎, 陳鳳美, 等. 6種植物中內(nèi)生鐮刀菌的分離和鑒定. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, (5): 437-439.

[25] Yakup Arica M, Yasemin K, ?mer G. Entrapment of white-rot fungusTrametesversicolorin Ca-alginate beads: preparation and biosorption kinetic analysis for cadmium removal from an aqueous solution. Bioresource Technology, 2001, 80(2): 121-129.

[26] Xiao X. Application of Heavy Metal Hyperaccumulator Endophytes in Heavy Metal Decontamination[D]. Changsha: Hunan University, 2011. 肖瀟. 基于鎘超累積植物內(nèi)生菌的重金屬污染修復(fù)研究[D]. 長沙: 湖南大學(xué), 2011.

[27] Srivastava S, Agrawal S B, Mondal M K. A review on progress of heavy metal removal using adsorbents of microbial and plant origin. Environmental Science and Pollution Research, 2015, 22(20): 15386-15415.

[28] Deng Z J, Huang H W, Cao L X,etal. Characterization of Cd- and Pb-resistant fungal endophyteMucorsp. CBRF59 isolated from rapes (Brassicachinensis) in a metal-contaminated soil. Journal of Hazardous Materials, 2011, 185: 717-724.

[29] Arnold A E, Herre E A. Canopy cover and leaf age affect colonization by tropical fungal endophytes: Ecological pattern and process in Theobroma cacao (Malvaceae). Mycologia, 2003, 95(3): 388-398.

[30] Siles J A, Margesin R. Abundance and diversity of bacterial, archaeal, and fungal communities along an altitudinal gradient in alpine forest soils: What Are the Driving Factors. Microbial Ecology, 2016, 72(1): 207-220.

[31] Pattison Z, Rumble H, Tanner R A,etal. Positive plant-soil feedbacks of the invasiveImpatiensglanduliferaand their effects on above-ground microbial communities. Weed Research, 2016, 56(3): 198-207.

[32] Herre E A, Mejia L C, Kyllo D A,etal. Ecological implications of anti-pathogen effects of tropical fungal endophytes and mycorrhizae. Ecology, 2007, 88(3): 550-558.

[33] Osono T, Tateno O, Masuya H. Diversity and ubiquity of xylariaceous endophytes in live and dead leaves of temperate forest trees. Mycoscience, 2013, 54(1): 54-61.

[34] Saucedo-Garcia A, Luisa Anaya A, Espinosa-Garcia F J,etal. Diversity and communities of foliar endophytic fungi from different agroecosystems ofCoffeaarabicaL. in two regions of Veracruz, Mexico. Plos One, 2014, 9(6): 1-11.

[35] Li D W, Xu H M, Mei T,etal. Diversity of endophytic fungi from six dominant plant species in a Pb-Zn mine wasteland in China. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(7): 2288-2293. 李東偉, 徐紅梅, 梅濤, 等. 云南會澤鉛鋅礦廢棄礦渣堆常見植物內(nèi)生真菌多樣性. 生態(tài)學(xué)報, 2012, 32(7): 2288-2293.

[36] Zheng Y K, Chen C, Ren D,etal. Genetic diversity of the plant endophytic fungi in a Pb-Zn mine area in Hanyuan, Sichuan Province, China. Journal of Sichuan Agricultural University, 2013, 31(3): 308-313. 鄭有坤, 陳誠, 任丹, 等. 四川漢源鉛鋅礦區(qū)植物內(nèi)生真菌的遺傳多樣性初步研究. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 31(3): 308-313.

[37] Chen Y T, Ding L X, Cheng D Q,etal. Isolation and Identification of endofungi fromLiriopespicata. Journal of Laiyang Agricultural College: Natural Science, 2006, 23(1): 13-16. 陳宜濤, 丁立孝, 程東慶, 等. 麥冬內(nèi)生真菌鐮刀菌的分離鑒定. 萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2006, 23(1): 13-16.

[38] Sun J Q, Guo L D, Chi D F,etal. Diversity and ecological distribution of endophytic fungi in medicinal plants. Chinese Journal of Science (series C: Life Sciences), 2008, (5): 475-484. 孫劍秋, 郭良棟, 遲德福, 等. 藥用植物內(nèi)生真菌多樣性及生態(tài)分布. 中國科學(xué)(C輯:生命科學(xué)), 2008, (5): 475-484.

[39] Collado J, Platas G, Pelaez F. Host specificity in fungal endophytic populations ofQuercusilexandQuercusfagineafrom Central Spain. Nova Hedwigia, 2000, 71(3/4): 421-430.

Distribution and rDNA-ITS sequence analysis of endophyte symbionts ofBothriochloaischaemumat a copper tailings site

CAO Miao-Wen1, JIA Tong1*, JING Ju-Hui2, CHAI Bao-Feng1

1.InstituteofLoessPlateau,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China； 2.InstituteofBiotechnology，ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

Tailing ponds are special growth environment for plants. Soils at such sites contain high concentrations of heavy metals, which affect the physiology and ecology of plants. The aim of this study was to evaluate the endophytic fungi resources at a copper mine tailings site, and to explore whether different endophytic fungi can restore diversity by altering the physical and chemical properties of soil. Therefore, we studied endophytic fungi ofBothriochloaischaemumgrowing in the Shibahe tailings pools at the Tongkuangyu Mine, a copper tailings site.B.ischaemumis the dominant species growing at this site, and it grows in several sub-dams with different recovery times. To investigate the endophytic fungi infection rate ofB.ischaemum, we collected live plants and separated the endophyte from the sheath, and observed and described the characteristics and spore morphology of each fungus. We also selected 16 strains and amplified the 5.8S-ITS region for sequencing and phylogenetic analysis. Based on their phenotypes, the endophytes fromB.ischaemumgrowing in four different sub-dams with different recovery times were separated into different groups. Most endophyte colonies were white, and the growth rate ranged from 5.515 and 12.548 mm/d. The endophytes produced spherical or oval/near oval spores, with sizes ranging from 2.085 μm to 7.072 μm. Sequence analyses showed that there were three different sequences among the 16 kinds of colonies, belonging to the generaGibberella,Fusarium, andPenicillium. The smallest genetic distance was between the sub-dam with 30-years recovery and that with 5-years recovery. The largest genetic distance was between the sub-dam with 45-years recovery and that with 15-years recovery. At copper tailings sites, different soil environments at different stages of restoration might lead to a wide diversity of endophytes infectingB.ischaemum. The results of this study provide a theoretical basis for enriching endophyte resources, and reveal some of the ecological functions of endophytes associated withB.ischaemumat a copper tailings site.

copper tailings; heavy metal;Bothriochloaischaemum; endophyte

10.11686/cyxb2016271

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-07-05；改回日期：2016-09-28

國家自然科學(xué)青年科學(xué)基金項目(31600308)，山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上青年基金項目(201601D021101)，山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2016-006)和山西省科技攻關(guān)項目(20150313001-3)資助。

曹苗文(1992-)，女，山西汾陽人，碩士。E-mail:18234057492@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail：jiatong@sxu.edu.cn

曹苗文, 賈彤, 景炬輝, 柴寶峰. 銅尾礦庫白羊草內(nèi)生真菌的分布及rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(5): 163-172.

CAO Miao-Wen, JIA Tong, JING Ju-Hui, CHAI Bao-Feng. Distribution and rDNA-ITS sequence analysis of endophyte symbionts ofBothriochloaischaemumat a copper tailings site. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 163-172.