微塑料在菲降解過程中對融合菌株F14的影響

周昌鑫，侯彬，郭學(xué)濤，高喬，劉怡暄，盧靜*

（1.中北大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，太原030051；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100）

塑料及其制品廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和日常生活的各個領(lǐng)域，全球塑料產(chǎn)量在2015年就已經(jīng)超過3億t，預(yù)計到2035年塑料年產(chǎn)量將增加一倍[1?2]。其中，聚乙烯（PE）塑料被大規(guī)模生產(chǎn)，主要用于農(nóng)業(yè)覆蓋物、復(fù)合材料和包裝用品[3]等多個方面。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，大量低密度PE薄膜被用于保護作物、抑制雜草、調(diào)節(jié)溫度和保持土壤中的水分等，隨著時間的推移，這些薄膜會變得易碎并被分解為微小顆粒[4]，即微塑料（MPs，直徑小于5 mm）[3，5]。這些微小顆粒會以空氣作為載體，在土壤中富集。MPs所帶來的危害不只來自于它本身（如：增塑劑長期暴露會引起生殖、呼吸、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的損傷）[6?8]，更嚴重的是，MPs可以作為其他污染物的載體，如重金屬、持久性有機污染物（POPs）、疏水性有機化學(xué)品（HOC）[9?11]等。

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）作為一類持久性有機污染物廣泛存在于自然界中，微生物代謝是降解環(huán)境中PAHs等有機污染物的重要手段[12]。融合菌株F14是以菲降解菌Sphingomonas sp.GY2B和芘降解菌Pseudomomas sp.GP3A為親本，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建的一株高效降解PAHs的降解菌。該菌具備比親本更廣的溫度（20～40℃）和pH（6.5～9）適應(yīng)范圍，更高效的PAHs降解性能，而且具有和親本GY2B不同的菲降解途徑，F(xiàn)14具有兩條菲代謝途徑并且在降解過程中較少積累有毒中間代謝產(chǎn)物。F14可以在30 d將土壤中初始濃度為10 mg·L?1和50 mg·L?1的菲降解89.9%和73%，并可以耐受100 mg·L?1的菲[13]。然而，這些數(shù)據(jù)都是在實驗室條件下得到的，如果將融合菌株F14應(yīng)用到實際環(huán)境中，環(huán)境中微塑料的存在是否會影響F14對PAHs的降解，是否會威脅或有助于F14的生存，這都需要進一步的研究。

目前，對環(huán)境中微塑料的研究主要集中在分布[14?15]、吸附降解[16]、生物及群落[17]的影響等方面，涉及對微生物個體影響的研究[2，18]相對較少。因此，本研究以聚乙烯微塑料（PE?MPs）為研究對象，探究受微塑料影響前后F14細胞的表面形態(tài)、胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）化學(xué)成分變化及細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量，考察在降解菲過程中微塑料對F14的影響，為進一步評價融合菌株F14在實際PAHs土壤污染場地修復(fù)中的潛在應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究所使用的菲（98%）、甲醇（色譜純）、正己烷（分析純）、PE?MPs（粒徑為500μm和1 mm）等試劑，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；營養(yǎng)肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。每次試驗前須將PE?MPs置于超凈臺中進行紫外滅菌處理。無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)液（MSM）：分別取5 mL磷酸鹽緩沖液（KH2PO48.5 g·L?1，K2HPO4·H2O 21.75 g·L?1，Na2HPO4·12H2O 33.4 g·L?1，NH4Cl 5.0 g·L?1，3 mL MgSO4水溶液22.5 g·L?1，1 mL CaCl2水溶液36.4 g·L?1，1 mL FeCl3水溶液0.25 g·L?1）和1 mL微量元素[MnSO4·H2O 39.9 mg·L?1，ZnSO4·H2O 42.8 mg·L?1，（NH4）6Mo7O24·4H2O 34.7 mg·L?1]并定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為6.8～7.0，滅菌20 min后備用。

含有菲的無機鹽培養(yǎng)液（100 mg·L?1）：在滅菌的三角瓶中加入適量的菲標準儲備液（5 g·L?1，正己烷為溶劑配制），待正己烷揮發(fā)完畢，加入滅菌后的MSM。

表1 對照組及主要試驗組編號Table 1 Number of control groups and experimental groups

1.2 PE?MPs對F14降解菲的影響

在含有菲的MSM培養(yǎng)基（20 mL）中僅加入菌液，不添加PE?MPs，設(shè)為對照組。在對照組的基礎(chǔ)上分別加入粒徑為500μm、1 mm，濃度為20、40、80、160、320 mg·L?1的PE?MPs，設(shè)為試驗組，如表1所示。每個試驗組均對應(yīng)設(shè)置空白組（僅含有對應(yīng)濃度和粒徑的微塑料，不含菌株）。所有樣品30℃避光振蕩培養(yǎng)。添加不同質(zhì)量濃度的PE?MPs，分別在第3、6、9、12、15、18、21、24、48、168 h取樣測定菲的降解率，每組試驗設(shè)置3個平行樣。

1.3 菲降解率的測定

在待測樣品中加入適量的甲醇，超聲處理整瓶萃取，用甲醇定容至50 mL。取1.5 mL溶液過0.22μm有機濾膜后移入色譜瓶中，使用島津（20A）高效液相色譜（HPLC）測定菲的剩余量，計算菲的降解率，計算公式如下：

式中：A0表示相應(yīng)空白組對應(yīng)的峰面積；A表示對照組和試驗組樣品對應(yīng)的峰面積。

1.4 掃描電鏡（SEM）分析

利用掃描電鏡（SU8010，日立）觀察PE?MPs存在情況下菌株細胞表面形態(tài)變化。離心收集（10 000 r·min?1，10 min）對照組、3c、3C、5c和5C試驗組細胞樣品，并將PE?MPs顆粒分出，單獨觀察PE?MPs表面生物膜的形成情況。剩余菌體則用于分析游離在培養(yǎng)基中的菌株的細胞形態(tài)變化。樣品使用2.5%戊二醛完全浸沒固定12 h后，用磷酸緩沖液漂洗，再用1%的鋨酸溶液固定樣品2 h，漂洗，接著用梯度濃度的乙醇溶液（30%、50%、70%、80%、90%和95%）對樣品進行脫水處理，最后用乙醇與醋酸異戊酯混合液（V/V=1/1）處理樣品30 min，再用醋酸異戊酯處理樣品1 h，干燥，鍍膜，觀察。不含菌株的PE?MPs顆粒直接干燥，鍍膜，觀察。

1.5 傅里葉變換光譜（FTIR）分析

離心收集（10 000 r·min?1，10 min）試驗組4、試驗組5和對照組細胞樣品，凍干（?80℃），使用紅外光譜儀（Nicolet Is10，Thermo Fisher）進行測試（KBr壓片），分析F14細胞表面的主要成分變化。

1.6 細胞活性氧（ROS）測定

離心收集（10 000 r·min?1，10 min）對照組和試驗組24、48 h和168 h的細胞，采用ROS酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行測試。450 nm波長下用酶標儀測定吸光度（OD值）。通過標準曲線，計算樣品中ROS濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PE?MPs對F14降解菲過程的影響

添加不同粒徑和不同質(zhì)量濃度的PE?MPs后F14對菲的降解效果如圖1所示。從圖中可以看出，在添加了不同濃度的500μm和1 mm微塑料后F14對菲的降解趨勢大體一致。24 h內(nèi)，添加微塑料后F14對菲的降解率明顯增高，且隨著微塑料濃度增大，F(xiàn)14對菲的降解率也逐漸升高；48 h后，試驗組和對照組的菲降解率均基本達到100%；168 h后，對照組和試驗組中菲的降解率均達到100%。這表明PE?MPs在一定程度上促進了F14對菲的降解，可能是由于PE?MPs為F14提供了載體，有利于其發(fā)揮更高的生理活性，同時也增加了F14和菲的接觸機會[19]。此外，PE?MPs表面分子的疏水性使得其與環(huán)境中的水分子之間存在界面，這種界面也可能為F14生物膜的形成提供了空間[20]。

2.2 PE?MPs對F14菌株化學(xué)成分的影響

通過FTIR對添加PE?MPs前后培養(yǎng)體系中的F14菌株化學(xué)成分進行分析鑒定，結(jié)果如圖2所示。3 700～3 050 cm?1區(qū)間出現(xiàn)的峰是由羥基、羧基、酚羥基等O—H鍵和酰胺的N—H振動引起。位于2 930 cm?1處的峰是由C—H振動（脂質(zhì)或蛋白質(zhì)的CH2和CH3官能團）引起[21]。FTIR光譜中蛋白質(zhì)特征峰主要是：位于1 640 cm?1處的酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm?1），為CO伸縮振動；位于1 540 cm?1處的酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm?1），是N—H彎曲振動和C—N拉伸振動的耦合產(chǎn)生[22]；1 450 cm?1處為蛋白質(zhì)中的C—N鍵的吸收峰，且氨基在1 450～1 250 cm?1區(qū)域存在面內(nèi)搖擺振動和面外搖擺振動兩個峰。由圖可以看出，對照組和試驗組紅外吸收的相對強度存在明顯變化。圖2A至圖2D顯示，培養(yǎng)的第24 h和48 h試驗組對應(yīng)的蛋白質(zhì)的特征峰相對強度增強，這說明PE?MPs存在時F14菌株的生長代謝過程更加旺盛[23]。1 080 cm?1處吸收峰歸屬于核酸中PO2基團的特征峰[22]，試驗組培養(yǎng)第24 h和48 h時，該吸收峰的相對強度增加，這說明PE?MPs的存在促進了F14菌株的核酸轉(zhuǎn)錄等過程，促進了F14的生長繁殖[24]。1 150～750 cm?1的峰歸屬于多糖[25]，多糖和蛋白質(zhì)是EPS的關(guān)鍵成分，其源于細菌的分泌和表面黏附，細胞聚集和裂解等多種微生物生理過程[26?27]。第24 h和48 h測試結(jié)果顯示，試驗組多糖的相關(guān)特征峰相對強度明顯增強，表明PE?MPs的存在會影響F14細胞EPS的分泌。

在培養(yǎng)的第24 h和48 h，試驗組的蛋白質(zhì)、核酸、多糖的相對含量明顯增加，且320 mg·L?1試驗組略高于80 mg·L?1；在第48 h，500μm試驗組相對含量略高于1 mm試驗組。第168 h（圖2E和圖2F）的測試結(jié)果顯示，試驗組與對照組具有相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)、核酸、多糖水平。這可能是由于在第24 h和48 h時，F(xiàn)14在PE?MPs存在的環(huán)境下，應(yīng)激產(chǎn)生了更多的EPS，在第48 h之后，由于培養(yǎng)基中的菲基本都被降解，同時，F(xiàn)14對PE?MPs的環(huán)境基本適應(yīng)，致使試驗組F14菌株的生長代謝過程放緩，保持正常水平，因此，第168 h時，試驗組和對照組的紅外測試結(jié)果基本相似。

2.3 PE?MPs對F14表面形態(tài)的影響

添加PE?MPs前后F14表面形態(tài)的變化及PE?MPs表面變化見圖3。結(jié)果顯示，與對照組相比（圖3A），添加PE?MPs后細胞出現(xiàn)了凹陷現(xiàn)象，這可能是由于添加PE?MPs引起了細胞內(nèi)外滲透壓的變化[28]，進而造成了細胞表面形態(tài)的變化。同時也觀察到細胞出現(xiàn)了絲狀物。與未添加微生物的PE?MPs（圖3G）相比，添加了微生物的PE?MPs表面細胞分泌出更多的絲狀物，結(jié)合FTIR結(jié)果推測其可能為微生物分泌的EPS，這些EPS將菌團聚在一起（圖3I），也將菌和微塑料連接在一起，使菌能夠附著在微塑料上，這可能有利于微生物降解微塑料表面的菲。另外，從圖中可以看到生物膜中絲狀的生物膜基質(zhì)，生物膜能為微生物生長提供一系列的有利條件，如有利于微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并且能夠幫助微生物抵御有毒物質(zhì)和干燥環(huán)境[29?30]

2.4 PE?MPs對F14細胞ROS的影響

細胞中過量ROS的產(chǎn)生會降低細胞的生理活性，甚至導(dǎo)致細胞死亡[31]。因此，大量ROS產(chǎn)生是細胞氧化損傷的重要標志[32]。然而，少量的ROS會激發(fā)細胞的防御體系，減少損傷[33]。在不同濃度和粒徑的PE?MPs存在下，F(xiàn)14在對菲降解過程中細胞內(nèi)ROS的生成量結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，在培養(yǎng)24、48 h和168 h后，試驗組細胞內(nèi)ROS水平均低于對照組。對于粒徑為500μm和1 mm的PE?MPs，隨著其濃度的增加，F(xiàn)14細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量基本呈降低趨勢。隨著培養(yǎng)時間的延長，試驗組細胞ROS的產(chǎn)生量也有所下降。試驗組細胞ROS的產(chǎn)生量主要與PE?MPs的濃度有關(guān)，粒徑對細胞ROS的產(chǎn)生量沒有明顯的影響。PE?MPs的存在使得F14細胞ROS保持在較低水平，從而減弱了細胞自身的氧化損傷，使其能夠保持較高的生理活性，促進其對菲的降解。同時，SEM與FTIR測試表明，EPS分泌量受PE?MPs的影響而增加。EPS是微生物正常生理過程產(chǎn)生的分泌物，可以形成細胞保護層[34?35]。當(dāng)生存環(huán)境發(fā)生變化時，微生物的自我保護和生存機制將發(fā)揮作用，進而引起微生物EPS分泌量的波動[36?37]。因此，PE?MPs的存在可能對F14細胞產(chǎn)生了刺激作用，使其應(yīng)激產(chǎn)生了更多的EPS，這有利于F14黏附于PE?MPs表面而生長。因此，F(xiàn)14菌株對于PE?MPs存在的環(huán)境具有較強的適應(yīng)性。

3 結(jié)論

（1）試驗粒徑和濃度范圍內(nèi)PE?MPs的存在并沒有抑制F14對菲的降解，反而促進了對菲的降解。PE?MPs的存在可能會使F14分泌更多的EPS并形成生物膜，進而有利于F14對菲的降解。

（2）PE?MPs的存在使F14菌株細胞ROS保持較低水平。隨著PE?MPs濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，細胞ROS產(chǎn)生量逐漸降低。說明PE?MPs的存在可能會激發(fā)F14細胞的防御體系，減少F14細胞的氧化損傷，使其可以保持更高的生理活性，進而有利于對菲的降解。