豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌三重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

陶　政，曾文斌，劉悅欣，左明開，幸文定，白帥州，張學(xué)良，王　萍

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.南昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330008）

豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌三重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

陶政1，曾文斌1，劉悅欣1，左明開1，幸文定1，白帥州1，張學(xué)良2，王萍1

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.南昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330008）

為建立一種簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）檢測方法，根據(jù)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛（K88）和毒素（STa和LT）基因分別設(shè)計(jì)合成了1對引物，對K88、STa和LT基因擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測K88、STa和LT的三重PCR方法。該方法對K88、STa和LT基因的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為499 bp，190 bp和373 bp；此外，該方法具有良好的靈敏性和特異性。本實(shí)驗(yàn)建立的三重PCR方法為致幼畜腹瀉ETEC的檢測提供了快速準(zhǔn)確方法。用所建立的三重PCR方法對實(shí)驗(yàn)室從臨床腹瀉樣品中分離的120株大腸桿菌進(jìn)行檢測，結(jié)果9株為K88/LT/STa陽性，14株為K88/LT陽性，21株K88/STa陽性，13株LT/STa陽性，8株K88陽性，2株LT陽性，12株STa陽性。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；三重PCR；K88菌毛；STa毒素；LT毒素

能夠引起仔豬產(chǎn)生腹瀉的最常見的病原型大腸桿菌有產(chǎn)腸毒素（enterotoxigenic，ETEC）、腸出血性（enterohaemorrhagic，EHEC）、腸致病性（enteropathogenic，EPEC）、腸侵襲性（enteroinvasive EIEC）和產(chǎn)志賀菌毒素（shiga toxin producing STEC）大腸埃希菌。其中，ETEC是最常見一種致病性大腸埃希菌，能夠引起仔豬急性水樣腹瀉和迅速脫水死亡，死亡率和發(fā)病率均很高，這給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌性腹瀉主要發(fā)生于集約化的養(yǎng)豬場和種豬場，常引起0～6日齡新生仔豬和3～6周齡斷奶仔豬的腹瀉。ETEC主要包括腸毒素和粘附素兩種毒力因子。粘附素也稱為菌毛，主要有K88、K99、987P、F17、F18和F41［1］，其中K88是引起我國仔豬腹瀉的主要ETEC菌毛。相比于種類繁多的菌毛，腸毒素只有熱敏腸毒素（LT）和耐熱腸毒素（ST）兩個(gè)主要類型，二者均由質(zhì)粒編碼［2］，其中ST包含STa與STb兩種［3］。ETEC菌株可單獨(dú)產(chǎn)生ST或LT，或兩種毒素同時(shí)產(chǎn)生［4］。

目前檢測大腸桿菌毒素的方法主要有動(dòng)物試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、瓊指擴(kuò)散試驗(yàn)，這些方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且具有一定的局限性［5-6］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)具有特異、敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)［7］。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種大腸桿菌毒素基因特異引物，建立檢測ETEC的K88、STa和LT基因三重PCR檢測方法，為ETEC的檢測及鑒定提供了有效的方法。

1　材料與方法

1.1菌株C83902（K88+、LT+和STa+），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；沙門菌、豬丹毒桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌和鴨疫里默菌和臨床分離的120株E.coli分離株，均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)細(xì)菌研究室保存。

1.2主要試劑及培養(yǎng)基Taq DNA Polymerase、dNTPs、Trans2K DNA Marker，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank登錄中的序列（登錄號(hào)：M25302、M58746和AB011677），針對ETEC的3種毒力基因（K88、STa和LT）設(shè)計(jì)了3對特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1　ETEC毒力基因多重PCR引物

1.4DNA模板的制備按文獻(xiàn)［5］的方法，采用煮沸方法提取細(xì)菌DNA。

1.5PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR擴(kuò)增體系為25 μL，所用模板DNA 2.5 μL。試驗(yàn)以含K88、STa和LT基因的C83902菌株作為模板，分別對影響PCR擴(kuò)增的dNTPs濃度、引物濃度、退火溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化。在確定了dNTPs和退火溫度后，優(yōu)化引物濃度。

1.6三重PCR的敏感性試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)菌株C83902于37℃振蕩（140 r/min）15 h，取培養(yǎng)菌液倍比稀釋為101CFU/mL到105CFU/mL，各濃度稀釋液分別作為PCR模板，進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，測定反應(yīng)的靈敏性。

1.7三重PCR擴(kuò)增的特異性分別對標(biāo)準(zhǔn)菌株C83902、豬丹毒桿菌、沙門菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、鏈球菌株和鴨疫里默菌株進(jìn)行檢測，以確定三重PCR方法的特異性。

1.8對E.coli分離菌株的檢測采用建立的多重PCR方法對實(shí)驗(yàn)室從仔豬臨床腹瀉樣品中分離的120株E.coli分離菌進(jìn)行PCR檢測鑒定，并對結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1三重PCR擴(kuò)增條件的檢測和優(yōu)化結(jié)果三重PCR方法對K88、STa和LT 3種基因的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為499 bp，190 bp和373 bp；通過對影響PCR擴(kuò)增的dNTP濃度、引物濃度以及退火溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化。該多重PCR擴(kuò)增體系最終確定為：dNTPs（0.4 mmol/L）3 μL，10×PCR Buffer 7 μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.8 μL，雙蒸水10 μL，模板DNA 2.5 μL，K88、LT和STa的上下游引物（20 μmol/L）分別為0.25 μL、0.25 μL和0.35 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s、53℃退火30 s、72℃延伸60 s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min（圖1）。

圖1　不同溫度下ETEC的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2三重PCR擴(kuò)增的靈敏性對標(biāo)準(zhǔn)菌株模板10倍倍比稀釋，利用優(yōu)化好的多重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR靈敏性檢測，結(jié)果顯示，C83902標(biāo)準(zhǔn)菌株三重PCR反應(yīng)的最低靈敏度為103CFU/mL（圖2）。

2.3三重PCR擴(kuò)增的特異性利用優(yōu)化好的多重PCR擴(kuò)增條件，將對照菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)菌株C83902擴(kuò)增出了K88、STa和LT三個(gè)基因片段，而其他菌株則沒有出現(xiàn)任何條帶（圖3）。

2.4對E.coli分離菌株的多重PCR檢測采用多重PCR方法對實(shí)驗(yàn)室分離的120株E.coli進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出ETEC陽性79份，即ETEC的檢出率為65.8%，其中K88/LT為17.7%（14/79），K88/STa為26.6%（21/79），LT/STa為16.5%（13/79），K88+LT+STa為11.4%（9/79），L T為48.1%（38/79），STa為69.6%（55/79），K88+為65.8%（52/79）。表明產(chǎn)腸毒素大腸桿菌江西分離株的主要毒力基因型是STa和K88的毒力表型。

圖2　多重PCR擴(kuò)增敏感性實(shí)驗(yàn)

圖3　多重PCR擴(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)

3　討論

引起仔豬出現(xiàn)腹瀉性癥狀的病原有很多種，而ETEC感染只是其中的一種病原，所以要仔豬腹瀉是否是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染導(dǎo)致，僅從病理解剖和臨床癥狀只能做出初步診斷，而必須依賴于病原學(xué)的檢測，并對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查研究。

多重PCR技術(shù)能夠在同等的時(shí)間內(nèi)對多條靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，相比常規(guī)的PCR而言，不僅更高效，而且能夠在分子水平上適應(yīng)大批量樣品的快速檢測［8-9］，為仔豬等動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉提供了有效快捷的研究手段。本試驗(yàn)所建立的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌三重PCR檢測方法中，對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的粘附素K88、腸毒素LT和STa，大小分別為499 bp、373 bp和190 bp的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，即可在一次PCR中方便的檢測出這3種毒力基因。通過對三重PCR反應(yīng)的dNTP濃度、反應(yīng)敏感性、特異性和退火溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定dNTP終濃度為0.4 mmol/L，K88、LT和STa引物終濃度均為20 μmol/L，引物的最佳退火溫度為53℃，三重PCR的敏感性檢測最低可達(dá)103CFU/mL，所建立的多重PCR具有高度的特異性。

對江西臨床上發(fā)病的120份仔豬腹瀉病料進(jìn)行檢測，通過建立的多重PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到了79份陽性的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，即ETEC的檢出率為65.8%，其主要表型毒力基因型是STa和K88，分別占到了69.6%（55/79）和65.8%（52/79），表明產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的仔豬腹瀉比較嚴(yán)重。建立多重PCR檢測方法可以從基因水平檢測ETEC，

通過對樣品增菌后即用于PCR檢測，不但可以快速鑒定是否存在ETEC感染，而且具有檢出率高的優(yōu)點(diǎn)，更適合于臨床大批樣品的檢測，對仔豬等動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉的快速臨床診斷具有一定的臨床意義，也為ETEC引起的其他類似流行性疾病提供了有效快捷的研究手段。

［1］Blanco M，Lazo L，Blanco J E，et al.Serotypes，virulence genes，and PFGE patterns of enteropathogenic Escherichia coli isolated from Cuban pigs with diarrhea［J］.Int Microbiol，2006，9（1）：53-60.

［2］Johnson T J，Nolan L K.Pathogenomics of the virulence plasmids of Escherichia coli［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2009，73（4）：750-774.

［3］Nataro J P，Kaper J B.Diarrheagenic Escherichia coli［J］.Clin Microbiol Rev，1998，11（1）：142-201.

［4］Taxt A，Aasland R，Sommerfelt H，et al.Heat-stable enterotoxin of enterotoxigenic Escherichia coli as a vaccine target［J］.Infect Immun，2010，78（5）：1824-1831.

［5］華榮虹，張書霞，何孔旺.豬源腸毒素性大腸桿菌菌毛基因多重PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（02）：162-164.

［6］曾群輝，陳明勇，張冰，等.牦牛大腸埃希氏菌的腸毒素試驗(yàn)［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001（04）：47-48.

［7］聞曉波，崔玉東，朱戰(zhàn)波，等.牛產(chǎn)腸毒素大腸桿菌毒力因子多重PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007（03）：322-324.

［8］關(guān)怡，黃天培，潘潔茹.應(yīng)用多元PCR鑒定水體中大腸桿菌的毒素基因［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010（16）：40-43.

［9］曲澤慧，陳佩佩，張愛芹，等.產(chǎn)腸毒素大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012（12）：980-982.

Development and Application of triplex PCR Detection of porcineEnterotoxigenic E.coli

TAO Zheng1，ZENG Wen-bin1，LIU Yue-xin1，ZUO Ming-kai1，XING Wen-ding1，BAI Shuai-zhou1，ZHANG Xue-liang2，WANG Ping1
（1.College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.NanChang Center for Diseases Prevention and Centrol，Nanchang 330008，China）

To establish a simple，sensitive，accurate and rapid method for the detection of Enterotoxigenic E.coli（ETEC）in pigs，a triplex PCR method was developed based on 3 pairs of primers for the fimbriae genes（K88）and 2 toxin genes（STa，LT）amplification.The reference E.coli strains which passed the different virulence genes were detected.The results showed that 499 bp，190 bp and 373 bp DNA fragments of K88，STa and LT genes were amplified by this protocol，respectively.The triplex PCR was proved to be specific and sensitive.Furthermore，a total of 120 E.coli were tested and theresults showed that 9 samples were K88/ LT/STa positive，14 sample was K88/LT positive，21 sample was K88/LT positive，13 sample was K88/STa positive，8 sample was K88 positive，2 sample was LT and 12 sample was STa positive.The triplex PCR assay provides a method to detect ETEC which causes diarrhea in piglets.

Enterotoxigenic Escherichia coli；Triplex PCR；K88 fimbriae；STa toxin；LT toxin

WANG Ping

S852.61

A

0529-6005（2016）04-0102-03

2015-01-29

江西省科技廳基金項(xiàng)目（20142BBF 60004）

陶政（1991-），男，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物免疫學(xué)基礎(chǔ)理論與運(yùn)用，E-mail：1552372174@qq.com

王萍，E-mail：jxjs6263wplm@163.com