• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

    2015-10-18 09:44:38王紅揚(yáng)唐云明
    食品科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:乙酸鈉硝基苯磷酸酶

    李 星,王 潔,王紅揚(yáng),唐云明*

    (西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶市甘薯工程研究中心,三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715)

    甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究

    李 星,王 潔,王紅揚(yáng),唐云明*

    (西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,重慶市甘薯工程研究中心,三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715)

    以新鮮甘薯老葉為材料,經(jīng)過勻漿、硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Superdex-200凝膠層析等步驟后,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定獲得了電泳純的酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP),純化后ACP比活力為251.49 U/mg,純化了169.07 倍,回收率為3.50%。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明:ACP為單亞基酶,全酶分子質(zhì)量為42.3 kD,單亞基分子質(zhì)量為41.2 kD;最適反應(yīng)溫度65 ℃,最適pH 5.2;在40 ℃以下和pH 4.0~6.0范圍內(nèi)酶活性較穩(wěn)定;以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物時(shí),測(cè)得其米氏常數(shù)Km值為0.258 mmol/L;Ca2+和Mg2+對(duì)ACP酶活性有明顯激活作用,K+和Li+對(duì)ACP酶活性無(wú)影響,甲醇、乙二胺四乙酸和草酸對(duì)ACP酶活性的抑制作用較大;Hg2+和Ag+對(duì)ACP酶活性的抑制作用非常明顯。

    甘薯葉;酸性磷酸酶;分離純化;性質(zhì)

    酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP,EC 3.1.3.2)是一種在酸性環(huán)境中催化磷酸單酯水解釋放出無(wú)機(jī)磷酸的水解酶[1],在動(dòng)植物和微生物中都廣泛存在[2-3]。該酶可作為食品添加劑,在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中有重要作用[4-5]。植物體內(nèi)存在3 種磷酸酶:酸性、中性和堿性磷酸酶,而ACP是植物體內(nèi)重要的一種酶,對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響[4]。在植物體內(nèi),ACP是一種誘導(dǎo)酶,在缺磷的條件下能顯著提高其活性[5]。但因種屬差異,目前關(guān)于ACP具體的生理生化機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。甘薯屬于旋花科甘薯屬甘薯種草本植物,若生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)為多年生植物,若生長(zhǎng)在溫帶地區(qū)則為一年生植物。甘薯作為一種糧食作物在我國(guó)廣泛種植,并且作為多種產(chǎn)品的原材料被大量加工使用[6]。本實(shí)驗(yàn)以甘薯老葉作為研究材料,分離純化酸性磷酸酶,并對(duì)其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,為從植物中分離純化酸性磷酸酶以及甘薯的綜合開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    甘薯葉采自重慶市甘薯工程研究中心研究基地。

    對(duì)硝基苯磷酸二鈉 美國(guó)A m r e s c o公司;DEAE-Sepharose層析柱、Superdex-200凝膠柱、凝膠層析分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE公司;考馬斯亮藍(lán)G-250 美國(guó)Bio-Rad公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 瑞士Fluka公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2儀器與設(shè)備

    Seven Easy pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;AKTA Prime plus純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司;Milli-Q Plus純水儀美國(guó)Millipore公司;MC4L冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Uni-Equip公司;垂直電泳槽和電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.3方法

    1.3.1甘薯葉ACP粗酶液的提取

    新鮮甘薯葉,選擇老葉部分(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明老葉酶活力較幼葉更高)洗凈擦干,準(zhǔn)確稱取100 g,剪碎,以1:4(m/V)的提取比例加入預(yù)冷的50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0);放入組織搗碎機(jī)中攪碎,4 ℃提取2 h,用4 層紗布過濾2 次后在4 ℃條件下12 000 r/min離心60 min,收集上清液,即為粗酶液,測(cè)定粗酶液的酶活力和蛋白質(zhì)含量。

    1.3.2硫酸銨分級(jí)沉淀

    硫酸銨粉末經(jīng)烘箱干燥后,緩慢加入粗酶液中,使粗酶液中硫酸銨含量為10%(體積分?jǐn)?shù)),4 ℃靜置2 h后,4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min,棄去沉淀,收集上清液;然后繼續(xù)向粗酶液中加入硫酸銨至40%,4 ℃冰箱靜置2.5 h,4 ℃條件下12 000 r/min離心40 min,棄去上清液,收集沉淀;50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)溶解沉淀,測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量后裝入透析袋中,于5 mmol/L乙酸-乙酸鈉透析液(pH 5.0)中4 ℃透析24 h。

    1.3.3DEAE-Sepharose層析

    DEAE-Sepharose層析柱用200 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)平衡后,取經(jīng)過透析的10 mL酶液上樣,用0~1.0 mol/L NaCl、50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)進(jìn)行線性梯度洗脫(10 h NaCl濃度由0變?yōu)? mol/L),收集洗脫液5 mL/管,流速設(shè)定為0.5 mL/min,測(cè)定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量,收集酶活力較高的幾管,透析12 h后冷凍干燥,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4Superdex-200柱層析

    Superdex-200層析柱經(jīng)50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)平衡后,取濃縮后的酶液3 mL上樣,用50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)進(jìn)行洗脫,每管收集3 mL,流速設(shè)定為0.3 mL/min,測(cè)定各管酶活力以及蛋白質(zhì)含量,收集酶活力較高的1至2 管,用超純水透析12 h后冷凍干燥,得到的酶純品于-20 ℃保存?zhèn)溆?,酶純品粉末?0 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)溶解,使酶液酶活力約為50 U/mL,用于做酶性質(zhì)研究。

    1.3.5ACP活力的測(cè)定

    [7]方法并改進(jìn):向試管中加入2.9 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)(含5 mmol/L的β-巰基乙醇 )和底物(1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉),于37 ℃水浴鍋保溫5 min后,再加入100 μL酶液,反應(yīng)10 min后加入2.5 mL的0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。以100 μL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉(pH 5.0)緩沖液代替酶液作為對(duì)照調(diào)零,在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度對(duì)應(yīng)對(duì)硝基苯酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)物生成量。酶活力單位(U)定義為:在37 ℃條件下,以對(duì)硝基苯磷酸二鈉為底物,每分鐘每升溶液中底物水解后生成產(chǎn)物的微摩爾數(shù)。

    1.3.6蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

    采用紫外分光光度法和考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定[8-9]。

    1.3.7ACP純度鑒定以及分子質(zhì)量的測(cè)定

    用SDS-PAGE對(duì)凝膠層析過后的樣品進(jìn)行純度鑒定以及單亞基分子質(zhì)量的測(cè)定[10],凝膠過濾法對(duì)全酶分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定[11]。

    1.3.8ACP部分理化性質(zhì)的研究

    1.3.8.1ACP最適溫度和最適pH值測(cè)定

    分別在30~70 ℃和pH 3~8的條件下測(cè)定酶活力,分別以最適條件下測(cè)定的酶活力為100%,其余條件下的酶活力與之相比得到相對(duì)酶活力。

    1.3.8.2不同溫度和pH值條件下ACP的穩(wěn)定性

    分別在30~70 ℃和pH 3~8條件下,處理1~5 h,每隔1 h測(cè)定酶活力。分別以未處理時(shí)的溫度和pH值條件下的酶活力為100%,其余溫度和pH值條件下測(cè)得的酶活力分別與之相比為相對(duì)酶活力。

    1.3.8.3米氏常數(shù)Km的測(cè)定

    在根據(jù)1.3.8.1節(jié)所測(cè)得的最適溫度和最適pH值條件下,在不同底物濃度(對(duì)硝基苯磷酸二鈉0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L)條件下,測(cè)定ACP活力,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)求出其Km值。

    1.3.8.4不同有機(jī)溶劑對(duì)ACP活性的影響[12]

    分別將甲醇、乙醇和異丙醇與酶液混合,混合后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%,37 ℃條件下處理30 min,再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min,最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同有機(jī)溶劑影響下的酶活力,以不加有機(jī)溶劑時(shí)的酶活力為100%。

    1.3.8.5不同化合物對(duì)ACP活性的影響[12]

    分別將尿素、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra acetic acid,EDTA)、抗壞血酸和草酸與酶液混合,混合后化合物的濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L,37 ℃條件下處理30 min,再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min,最后加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同化合物對(duì)酶活力的影響,以不加化合物時(shí)的酶活力為100%。

    1.3.8.6不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性的影響[12]

    分別將各種不同金屬離子與酶液混合,混合后反應(yīng)液中金屬離子的濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L,37 ℃條件下處理30 min,再加入1 mL 5 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉反應(yīng)10 min,最后再加入2.5 mL 0.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。測(cè)定不同金屬離子對(duì)酶活力的影響,以不加金屬離子時(shí)的酶活力為100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1甘薯葉ACP的分離純化結(jié)果

    圖1 甘薯葉ACP的DEAE-Sepharose離子交換柱層析色譜圖Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ACP from sweet potato leaves

    圖2 甘薯葉ACP的Superdex-200凝膠柱層析色譜圖Fig.2 Superdex-200 chromatography of ACP from sweet potato leaves

    硫酸銨分級(jí)沉淀透析后的酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析后的結(jié)果見圖1,酶活力最高管為第46管。收集酶活力較高的組分,經(jīng)透析冷凍干燥濃縮后,Superdex-200凝膠柱層析結(jié)果見圖2,酶活力最高管為第36管,收集酶活力最高的組分,冷凍干燥后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。整個(gè)分離純化過程的結(jié)果如表1所示。

    表1 甘薯葉酸性磷酸酶的分離純化結(jié)果Table1 Purification of ACP from sweet potato leaves

    2.2甘薯葉ACP的純度鑒定和分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

    圖3 甘薯葉ACP的SDS-PAGGEE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified ACP from sweet potato leaves

    如圖3所示,甘薯葉ACP純化后,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)顯示為單一條帶,說(shuō)明該酶樣品已達(dá)到電泳純,通過遷移率計(jì)算出單亞基分子質(zhì)量約為41.2 kD;而凝膠過濾層析法測(cè)定的全酶分子質(zhì)量約為42.3 kD(圖4),由此推斷甘薯葉ACP是為單亞基酶,這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的多數(shù)ACP為單亞基酶的結(jié)論一致[12-15]。

    圖4 Superdex-200層析法測(cè)得甘薯葉ACP的全酶分子質(zhì)量Fig.4 Estimation of the molecular weight of ACP from sweet potato leaves by Superdex-200 chromatography

    2.3甘薯葉ACP部分性質(zhì)研究

    2.3.1甘薯葉ACP反應(yīng)最適溫度和最適pH值

    在不同溫度和pH值條件下測(cè)定ACP活力,結(jié)果表明:該酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃(圖5),最適反應(yīng)pH值為5.2(圖6)。

    圖5 溫度對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of ACP from sweet potato leaves

    圖6 pH值對(duì)甘薯葉酸性ACP活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of ACP from sweet potato leaves

    2.3.2甘薯葉ACP的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性

    圖7 甘薯葉ACP的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of ACP from sweet potato leaves

    圖8 甘薯葉ACP的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH Stability of ACP from sweet potato leaves

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ACP在40 ℃以下較穩(wěn)定,60~70 ℃溫度范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性較低,在70 ℃保溫1 h以后,酶活力幾乎完全喪失(圖7)。在pH 4~6條件下,穩(wěn)定性較好,酶活力變化趨勢(shì)比較緩慢,pH 5條件下放置5 h后,相對(duì)酶活力還高達(dá)90%以上; pH值<4或者≥7時(shí),酶蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,酶活力下降很快,5 h后相對(duì)酶活力只剩下不到10%(圖8)。

    2.3.3甘薯葉ACP的米氏常數(shù)Km

    在最適溫度和pH值條件下,將不同濃度底物(對(duì)硝基苯磷酸二鈉0.1、0.2、0.4、0.5 mmol/L)加入酶反應(yīng)體系中,測(cè)定不同濃度底物下的ACP酶活力,利用雙倒數(shù)作圖法得Km為0.258 mmol/L(圖9)。

    圖9 雙倒數(shù)法測(cè)得甘薯葉ACP的米氏常數(shù)KmFig.9 KmDetermination of ACP from sweet potato leaves by Lineweaver-Burk plot

    2.3.4不同有機(jī)溶劑對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

    圖10 不同有機(jī)溶劑對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.10 Effects of various organic solvents on the activity of ACP from sweet potato leaves

    如圖10所示,ACP在甲醇、乙醇作用下,酶活力均受到強(qiáng)烈抑制,隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大,抑制作用增強(qiáng),當(dāng)有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí),甲醇幾乎抑制了該酶40%的酶活力,而異丙醇體積分?jǐn)?shù)在低于20%時(shí),對(duì)酶有少許的激活作用,體積分?jǐn)?shù)高于20%后,則表現(xiàn)出對(duì)酶有抑制作用。

    2.3.5不同化合物對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

    如圖11所示,隨著濃度的增大,多數(shù)化合物對(duì)甘薯葉ACP的酶活力表現(xiàn)出了抑制作用,其中,草酸對(duì)該酶的抑制作用非常明顯,當(dāng)草酸濃度達(dá)到40 mmol/L時(shí),ACP基本上檢測(cè)不到酶活力,尿素對(duì)該酶影響作用不明顯,而EDTA在高濃度下也對(duì)酶活性表現(xiàn)出抑制作用,抗壞血酸在低于40 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出對(duì)酶活力少許的激活作用,而在高于40 mmol/L后又體現(xiàn)出對(duì)ACP活力有抑制作用。

    圖11 不同化合物對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ACP from sweet potato leaves

    2.3.6不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性的影響

    圖12 不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活力的影響Fig.12 Effect of various metal ions on the activity of ACP from sweet potato leaves

    如圖12所示,不同金屬離子對(duì)甘薯葉ACP活性有不同的影響。隨著離子濃度的增加,Ca2+、Ba2+和Mg2+對(duì)酶活力稍有激活作用,Pb2+、Zn2+、Hg2+、Ag+則對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制作用,其中Hg2+、Ag+對(duì)該酶抑制作用最明顯,當(dāng)Hg2+濃度達(dá)到0.2 mmol/L時(shí),ACP活力完全喪失。

    3 討 論

    酶的分離純化是酶學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提,本實(shí)驗(yàn)從甘薯的老葉中得到了電泳純的ACP。但是與其他材料中分離純化的ACP相比較,回收率偏低,可能原因有:ACP在甘薯中的同工酶較多[12],純化過程中可能丟失了部分同工酶;另外,在上柱過程中溫度不同和洗脫液條件對(duì)酶穩(wěn)定性的影響使酶活力降低,從而也可能致使回收率降低;在透析過程以及上離子柱之前的離心過程中可能損失了部分酶活力,這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    甘薯葉ACP全酶分子質(zhì)量約為42.3 kD,一般低于其他材料的ACP分子質(zhì)量,如韭菜(59.58 kD)[12]、斑玉蕈(65 kD)[13]、長(zhǎng)毛對(duì)蝦(73 kD)[14],遠(yuǎn)低于意蜂工蜂(135 kD)[15]和海參(147.9 kD)[16],但比綠豆(34.6 kD)[17]高,說(shuō)明了不同種類材料的ACP分子質(zhì)量之間存在著較大的差異,推測(cè)可能是由于生物體為了適應(yīng)環(huán)境形成的。

    甘薯葉ACP的最適溫度為65 ℃,與其他材料的ACP最適溫度相比較高,與韭菜(65 ℃)[12]相同,高于綠豆(40 ℃)[17]、背角無(wú)齒蚌(50 ℃)[18]、草魚(45 ℃)[7]、刺參(45 ℃)[19]。該酶在40 ℃以下活力較穩(wěn)定,這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的情況相符。最適pH值為5.2,與綠豆(pH 5.2)[17]相同,與背角無(wú)齒蚌(pH 4.8)[18]和麥芽(pH 5.4)[20]相近,略高于草魚(pH 4.4)[7],遠(yuǎn)高于真菌類樹狀多節(jié)孢(pH 3.0)[21]和海洋藻類三角褐指藻、塔胞藻、海鏈藻(pH 3.0)[22],甘薯葉ACP在pH 4.0~6.0條件下較為穩(wěn)定,并且在pH 5.0時(shí)放置5 h后酶活力幾乎不發(fā)生變化,說(shuō)明甘薯葉ACP在其最適pH值附近穩(wěn)定性較好。

    甘薯葉ACP的Km約為0.258 mmol/L,與來(lái)自草魚的ACP(Km值為0.232 mmol/L)[7]較為相近,比綠豆酸性磷酸酶(Km值為4.28 mmol/L)[17]低很多,和其他植物材料相比都要低很多,說(shuō)明甘薯葉ACP對(duì)底物對(duì)硝基苯磷酸二鈉的親和力較大。

    Pb2+、Zn2+、Hg2+、Ag+對(duì)甘薯葉ACP活力都有較強(qiáng)的抑制作用,尤其是Hg2+、Ag+,在較低濃度下即能對(duì)甘薯葉ACP的酶活力產(chǎn)生抑制作用,這與Pb2+及Ag+對(duì)斑玉蕈[13]和刺參[19]中ACP的強(qiáng)烈抑制作用相似,Zn2+與重金屬離子均為該酶的抑制劑,這些離子直接作用于ACP活性中心的巰基從而導(dǎo)致酶活性喪失。Ca2+和Mg2+對(duì)甘薯葉ACP酶活力有明顯的激活作用,推測(cè)可能是金屬離子與酶的活性中心結(jié)合促進(jìn)了酶的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合,從而促進(jìn)酶的催化反應(yīng),這與多數(shù)文獻(xiàn)一致[19-22],只在洋蔥[23]中發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)ACP活力反而有抑制作用,說(shuō)明了同一種金屬離子對(duì)不同材料來(lái)源的ACP活性有不同的影響作用。

    參考文獻(xiàn):

    [1] MACDONALD K. The hydrolysis of phenyl phosphate by mouseliver acid phosphatase[J]. Biochemical Journal, 1961, 80(1): 154-161.

    [2] DEXTER R. Acid phosphatases of Escherichia coli[J]. Archives Biochemistry and Biophysics, 1960, 89: 97-104.

    [3] YOKOTA Y, NAKANO E. Two acid phosphatases in sea urchin eggs and embryos[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1984, 79(1): 17-22.

    [4] 李傳保, 龔守富. 植物體內(nèi)酸性磷酸酶研究進(jìn)展[J]. 信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等??茖W(xué)校學(xué)報(bào), 2005,15(3): 88-89.

    [5] 黃宇, 張海偉, 徐芳森. 植物酸性磷酸酶的研究進(jìn)展[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(1): 148-154.

    [6] 胡立明, 高蔭榆, 陳才水, 等. 甘薯葉研究進(jìn)展[J]. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 23(1): 79-84.

    [7] 楊立紅, 肖波, 王曉潔, 等. 草魚酸性磷酸酯酶的性質(zhì)及金屬離子對(duì)其活性 的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(5): 969-976.

    [8] 李建武, 余瑞元. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1994: 171-176.

    [9] LAYNE E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins[J]. Methods in Enzymology, 1957, 3: 447-454.

    [10] 朱廣廉, 楊中漢. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量[J].植物生理學(xué)通訊, 1992(2): 43-47.

    [11] 楊安鋼. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2001: 248-252.

    [12] 孫芳, 任美鳳, 胡瑞斌, 等. 韭菜酸性磷酸酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(17): 187-191.

    [13] 楊立紅, 高興喜, 繆靜, 等. 斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J].菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(5): 744-752.

    [14] 陳素麗, 陳清西, 胡天惠, 等. 長(zhǎng)毛對(duì)蝦酸性磷酸酶功能基團(tuán)的研究[J].臺(tái)灣海峽, 1997, 16(1): 81-84.

    [15] 江琰, 劉克武, 雷遠(yuǎn)成. 意蜂工蜂酸性磷酸酶的純化及其酶學(xué)特性[J].昆蟲學(xué)報(bào), 2004, 47(3): 310-315.

    [16] ZHU Beiwei, YU Jianwei, ZHANG Zongshen, et al. Purification and partial characterization of an acid phosphatase from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus[J]. Process Biochemistry, 2009,44(8): 875-879.

    [17] 高亞朋, 蘇茉, 梁建榮, 等. 綠豆酸性磷酸酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2011, 26(5): 92-96.

    [18] 魏煒, 張洪淵, 石安靜. 背角無(wú)齒蚌酸性磷酸酶的分離、純化及部分性質(zhì)研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1999, 36(3): 570-572.

    [19] 楊立紅, 孫振興, 王曉潔, 等. 刺參酸性磷酸酯酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 441-442.

    [20] 楊彩蘭, 陳巍, 茍春寶, 等. 一種麥芽酸性磷酸酶的分離純化及部分性質(zhì)研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2011, 48(1): 207-212.

    [21] 張國(guó)慶, 王有志, 王守現(xiàn), 等. 樹狀多節(jié)孢酸性磷酸酶的分離純化與性質(zhì)研究[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2011, 30(5): 753-759.

    [22] 王洪斌, 繆雨溪, 李信書, 等. 4種海洋微藻酸性磷酸酶的分離純化及其性質(zhì)的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2013, 32(3): 153-156.

    [23] GUO Jie, PESACRETA T C. Purification and characterization of an acid phosphatase from the bulb of Allium cepa L. var. Sweet Spanish[J]. Journal of Plant Physiology, 1997, 151(5): 520-527.

    Isolation, Purification and Characterization of Acid Phosphatase from Sweet Potato Leaves

    LI Xing, WANG Jie, WANG Hongyang, TANG Yunming*
    (Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

    Electrophoresis-pure acid phosphatase (ACP) was obtained from sweet potato old leaves via a series of consecutive procedures, including homogenization, extraction, ammonium sulfate fractional precipitation, DEAE-sepharose chromatography and Superdex-200 gel filtration and then identified with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this process, the purification fold was 169.07 and the recovery of ACP activity was 3.50%. The specific activity of the purified enzyme was 251.49 U/mg. The result showed that the enzyme was a single subunit protease with a relative molecular weight of 42.3 kD, and the subunit molecular weight was 41.2 kD. The optimum temperature and pH of the ACP enzyme were 65 ℃ and 5.2, respectively. This ACP was stable below 40 ℃ and in the pH range from 4.0 to 6.0. Its Michaelis-Menten Kinetics (Km) towards p-nitrophenyl phosphate was 0.258 mmol/L. The enzyme activity could be obviously inhibited by methanol, EDTA and oxalic acid and also strongly inhibited by Hg2+and Ag+.

    sweet potato leaves; acid phosphatase; isolation and purification; characterization

    Q946.5

    A

    1002-6630(2015)03-0152-06

    10.7506/spkx1002-6630-201503029

    2014-03-24

    重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC2011AB1027)

    李星(1988—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶工程。E-mail:848322361@qq.com

    唐云明(1960—),男,教授,博士,研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)與酶工程。E-mail:tbright@swu.edu.cn

    猜你喜歡
    乙酸鈉硝基苯磷酸酶
    TB-COP 對(duì)I2和硝基苯酚的吸附性能及機(jī)理研究
    添加脫氫乙酸鈉導(dǎo)致面包有毒?
    分光光度法測(cè)定污水處理用乙酸鈉含量的研究
    乙酸鈉結(jié)構(gòu)研究
    煤炭與化工(2021年1期)2021-02-26 05:26:48
    堿性磷酸酶鈣-鈷法染色的不同包埋方法比較
    馬尾松果糖-1,6-二磷酸酶基因克隆及表達(dá)模式分析
    磷酸酶基因PTEN對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制研究
    硝基苯催化加氫Pt-MoS2/C催化劑的制備及使用壽命的研究
    不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇、乙酸鈉溶液對(duì)雙乙酸鈉結(jié)晶過程影響
    混二氯硝基苯氯化制備1,2,4-/1,2,3-三氯苯
    亚洲乱码一区二区免费版| 校园人妻丝袜中文字幕| 美女黄网站色视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜免费成人在线视频| 91在线观看av| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久精品国产欧美久久久| 特大巨黑吊av在线直播| bbb黄色大片| 久久国内精品自在自线图片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜福利18| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 88av欧美| www.www免费av| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲国产精品成人综合色| 色视频www国产| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩欧美 国产精品| 精品乱码久久久久久99久播| 久9热在线精品视频| 国产色爽女视频免费观看| 免费av不卡在线播放| 精品久久久久久久久亚洲 | 黄色日韩在线| 国产主播在线观看一区二区| 欧美日韩乱码在线| 免费黄网站久久成人精品| 国内精品一区二区在线观看| av中文乱码字幕在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 别揉我奶头 嗯啊视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产大屁股一区二区在线视频| 在线观看66精品国产| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久久久亚洲中文字幕| 熟女电影av网| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜爱爱视频在线播放| 成人精品一区二区免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 十八禁网站免费在线| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线免费观看不下载黄p国产 | 一区二区三区四区激情视频 | 美女 人体艺术 gogo| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 久99久视频精品免费| 国产精品野战在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 深夜精品福利| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产伦精品一区二区三区四那| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产高清视频在线观看网站| 一进一出抽搐动态| 亚洲性久久影院| 免费看a级黄色片| 黄色视频,在线免费观看| 韩国av在线不卡| 18+在线观看网站| 波多野结衣高清无吗| a级毛片a级免费在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲黑人精品在线| 真实男女啪啪啪动态图| 久久精品人妻少妇| 国产高清有码在线观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲专区国产一区二区| 欧美精品国产亚洲| 国产日本99.免费观看| 国产亚洲精品av在线| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 免费黄网站久久成人精品| 麻豆成人av在线观看| 亚洲av.av天堂| 亚洲欧美清纯卡通| 成人精品一区二区免费| 久久精品国产自在天天线| 毛片一级片免费看久久久久 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久久久久精品吃奶| 又爽又黄a免费视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产美女午夜福利| 亚洲国产精品合色在线| 97超视频在线观看视频| 很黄的视频免费| 国产免费男女视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品一区www在线观看 | 日本a在线网址| 色av中文字幕| 不卡一级毛片| a级毛片a级免费在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 看十八女毛片水多多多| 少妇的逼好多水| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线观看舔阴道视频| 成人三级黄色视频| 一区二区三区免费毛片| av福利片在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久国产乱子免费精品| 成人特级av手机在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久午夜福利片| 三级毛片av免费| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品永久免费网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品无大码| 无遮挡黄片免费观看| 99在线人妻在线中文字幕| 国产伦人伦偷精品视频| 在线免费十八禁| 精品久久久久久久久久久久久| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜福利成人在线免费观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 制服丝袜大香蕉在线| 国产久久久一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成年女人永久免费观看视频| 内地一区二区视频在线| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲专区国产一区二区| 国产精品精品国产色婷婷| 99久国产av精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费看a级黄色片| eeuss影院久久| 欧美高清成人免费视频www| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 天堂√8在线中文| 51国产日韩欧美| 久久人妻av系列| 国产伦精品一区二区三区四那| 韩国av一区二区三区四区| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲av免费在线观看| 久久久久国内视频| 久久九九热精品免费| 国产v大片淫在线免费观看| 国产色婷婷99| 黄色日韩在线| 国产乱人视频| 久久久久久久久大av| 亚洲精品国产成人久久av| 99riav亚洲国产免费| 免费看av在线观看网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 欧美区成人在线视频| 国国产精品蜜臀av免费| 一本精品99久久精品77| 亚洲欧美日韩无卡精品| 禁无遮挡网站| 黄色配什么色好看| 亚洲精品色激情综合| 少妇人妻精品综合一区二区 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩欧美 国产精品| av视频在线观看入口| 亚洲av成人精品一区久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美成人a在线观看| 日本一本二区三区精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 成人性生交大片免费视频hd| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本a在线网址| 国产色婷婷99| 99久久精品热视频| 国产亚洲欧美98| av.在线天堂| 欧美一区二区亚洲| 日韩大尺度精品在线看网址| 色综合亚洲欧美另类图片| 可以在线观看的亚洲视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 中文字幕熟女人妻在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日韩欧美免费精品| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 有码 亚洲区| 校园春色视频在线观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲av.av天堂| 久久久国产成人免费| 亚洲在线自拍视频| 搡老岳熟女国产| 久9热在线精品视频| 成人国产综合亚洲| 成年女人永久免费观看视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品av视频在线免费观看| 能在线免费观看的黄片| 成人特级黄色片久久久久久久| 深爱激情五月婷婷| 欧美潮喷喷水| 美女黄网站色视频| 日本三级黄在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 一区二区三区免费毛片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| АⅤ资源中文在线天堂| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 日本色播在线视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久久久久久亚洲中文字幕| 黄色女人牲交| 12—13女人毛片做爰片一| 我要搜黄色片| 亚洲午夜理论影院| 亚洲内射少妇av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费看a级黄色片| 成年人黄色毛片网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本三级黄在线观看| 日本五十路高清| 俺也久久电影网| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品爽爽va在线观看网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲美女黄片视频| 欧美色视频一区免费| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 精品欧美国产一区二区三| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品久久久久久成人av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 1024手机看黄色片| 日本一本二区三区精品| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av.av天堂| 一个人观看的视频www高清免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 成人国产综合亚洲| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美zozozo另类| 亚洲男人的天堂狠狠| 黄色日韩在线| 亚洲av成人av| 国产大屁股一区二区在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 色视频www国产| 久久久久久九九精品二区国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品福利观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产成人a区在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 免费看av在线观看网站| 日本与韩国留学比较| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中文资源天堂在线| 亚洲无线在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产一区二区在线观看日韩| 国产视频内射| 999久久久精品免费观看国产| 最近最新免费中文字幕在线| 少妇高潮的动态图| 国产精品女同一区二区软件 | 国产伦人伦偷精品视频| 欧美+日韩+精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩欧美三级三区| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久成人av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩欧美精品v在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 永久网站在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲五月天丁香| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看美女被高潮喷水网站| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产高清视频在线观看网站| 国产色婷婷99| 哪里可以看免费的av片| 中文字幕久久专区| 亚洲av成人av| 国产欧美日韩精品一区二区| 成年女人永久免费观看视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩强制内射视频| 中文字幕高清在线视频| 成人特级av手机在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美精品国产亚洲| 日日夜夜操网爽| 深夜精品福利| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品色激情综合| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲不卡免费看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品一区二区三区人妻视频| 成人av在线播放网站| 欧美三级亚洲精品| 99久久精品国产国产毛片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 高清毛片免费观看视频网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 最后的刺客免费高清国语| 一个人看的www免费观看视频| 一区二区三区四区激情视频 | 人人妻人人看人人澡| 少妇的逼好多水| 中文字幕久久专区| 国产精品日韩av在线免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 可以在线观看毛片的网站| 精品午夜福利在线看| 九色国产91popny在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 高清在线国产一区| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产在视频线在精品| 亚洲av.av天堂| 国产综合懂色| 国产成年人精品一区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久久大精品| 在线观看舔阴道视频| 91久久精品国产一区二区三区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 十八禁网站免费在线| 亚洲精华国产精华精| 欧美高清成人免费视频www| 床上黄色一级片| 在线看三级毛片| 在线观看av片永久免费下载| 久久国内精品自在自线图片| 免费av不卡在线播放| 偷拍熟女少妇极品色| 午夜久久久久精精品| 一区福利在线观看| 久99久视频精品免费| 中国美白少妇内射xxxbb| 九色成人免费人妻av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| eeuss影院久久| 精品无人区乱码1区二区| 在线天堂最新版资源| 俄罗斯特黄特色一大片| 日日夜夜操网爽| 国产成年人精品一区二区| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99九九线精品视频在线观看视频| 成年人黄色毛片网站| 少妇高潮的动态图| 久久精品影院6| 免费黄网站久久成人精品| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲人成网站高清观看| 成人三级黄色视频| av女优亚洲男人天堂| 国产乱人伦免费视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 深夜a级毛片| 精品人妻熟女av久视频| 在线观看66精品国产| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费观看在线日韩| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日本与韩国留学比较| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本 av在线| 观看免费一级毛片| 亚洲内射少妇av| 免费av观看视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱 | 日韩精品青青久久久久久| 十八禁网站免费在线| 99久久成人亚洲精品观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产高清视频在线观看网站| 午夜福利成人在线免费观看| 一区二区三区激情视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久久九九精品二区国产| 一区二区三区免费毛片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 十八禁网站免费在线| 久久精品国产亚洲av天美| 成人国产一区最新在线观看| 岛国在线免费视频观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲专区中文字幕在线| 婷婷亚洲欧美| 毛片女人毛片| 日韩亚洲欧美综合| 麻豆成人av在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 美女高潮的动态| 国产真实伦视频高清在线观看 | 直男gayav资源| 日本 av在线| 一级av片app| 村上凉子中文字幕在线| 特大巨黑吊av在线直播| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲第一电影网av| 美女黄网站色视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品久久国产蜜桃| 亚洲成av人片在线播放无| 免费大片18禁| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品久久久久久久电影| 国产淫片久久久久久久久| 国产三级中文精品| 国产69精品久久久久777片| av国产免费在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一进一出好大好爽视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 有码 亚洲区| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品免费久久久久久久清纯| 婷婷精品国产亚洲av| 日韩欧美精品免费久久| 永久网站在线| 一级黄片播放器| 国产三级在线视频| 国产69精品久久久久777片| 一区二区三区高清视频在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 如何舔出高潮| 在线观看一区二区三区| 别揉我奶头 嗯啊视频| 88av欧美| 国产激情偷乱视频一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 长腿黑丝高跟| 人人妻人人看人人澡| 天美传媒精品一区二区| 在线观看66精品国产| 亚洲av免费高清在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久人人精品亚洲av| 如何舔出高潮| 国产精品久久久久久精品电影| 天堂网av新在线| 乱人视频在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本一二三区视频观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲av免费在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩高清综合在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人三级黄色视频| 国产久久久一区二区三区| 深夜精品福利| 在线观看舔阴道视频| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩黄片免| 国产亚洲欧美98| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩精品有码人妻一区| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩乱码在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 天堂√8在线中文| 午夜激情福利司机影院| 波多野结衣巨乳人妻| 国产主播在线观看一区二区| 97热精品久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品亚洲一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 国产成人一区二区在线| 亚州av有码| 老司机福利观看| 白带黄色成豆腐渣| 12—13女人毛片做爰片一| 十八禁网站免费在线| 性欧美人与动物交配| 少妇高潮的动态图| 久久精品91蜜桃| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲精品色激情综合| 男女之事视频高清在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区 | 男女视频在线观看网站免费| 内地一区二区视频在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精华霜和精华液先用哪个| 一个人观看的视频www高清免费观看| 日韩欧美在线二视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产91精品成人一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 九九热线精品视视频播放| 不卡视频在线观看欧美| 一本久久中文字幕| 又粗又爽又猛毛片免费看| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜福利欧美成人| 国产高清三级在线| 我要搜黄色片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| av专区在线播放| а√天堂www在线а√下载| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品无人区乱码1区二区| 久久这里只有精品中国| 赤兔流量卡办理| 午夜福利在线观看吧| 国产精品福利在线免费观看| 国产高清三级在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩欧美 国产精品| 中文字幕免费在线视频6| 成年女人永久免费观看视频| 国语自产精品视频在线第100页| 热99re8久久精品国产| 国产精品,欧美在线| 成人永久免费在线观看视频| 一个人免费在线观看电影| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美zozozo另类| 91在线观看av| 91久久精品国产一区二区三区| 日本熟妇午夜| 亚洲va在线va天堂va国产| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 淫秽高清视频在线观看| av专区在线播放| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品一区二区三区av网在线观看| 一区福利在线观看| 亚洲avbb在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 别揉我奶头 嗯啊视频| 97超视频在线观看视频| 亚洲三级黄色毛片| 精品久久国产蜜桃| 国产伦在线观看视频一区| 男女之事视频高清在线观看|