麻杏石甘湯對哮喘大鼠氣道上皮細胞粘蛋白表達的影響研究

虞琳+潘建偉

摘要：目的 研究麻杏石甘湯對哮喘大鼠氣道上皮細胞粘蛋白表達的影響，探討其在哮喘粘液高分泌中的作用。方法 將44只SPF級雄性SD大鼠隨機分為四組，對照組（A組），哮喘組（B組），哮喘+布地奈德組（C組），哮喘+麻杏石甘湯組（D組）。留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）檢測其中IL-12、IL-13的濃度；切取肺組織標本行HE染色觀察氣道炎癥，AB-PAS法檢測各組大鼠氣道粘蛋白的表達，檢測吸光度值后運用SPSS17.0進行統(tǒng)計。結(jié)果 ①麻杏石甘湯能降低哮喘組BALF中IL-13濃度，上調(diào)IL-12含量；②麻杏石甘湯能減輕哮喘大鼠氣道及血管肌層增生情況，減少周圍炎性細胞浸；③哮喘組存在氣道粘液高分泌，麻杏石甘湯能下調(diào)氣道粘蛋白的表達，但作用較布地奈德組弱。結(jié)論 麻杏石甘湯可減少粘蛋白表達，減輕哮喘大鼠炎癥反應、氣道粘液高分泌，為其在哮喘的現(xiàn)代臨床應用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：麻杏石甘湯；哮喘；布地奈德；粘蛋白

中圖分類號：R285 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）23-0086-04

Effect of Maxingshigang Decoction on Expression of Mucin in Airway Epithelial Cells of Asthmatic Rats

YU Lin，PAN Jian-wei

（Department of Pediatrics，the Fourth Affiliated Hospital of Medical College of Zhejiang University，Yiwu 322000，Zhejiang，China）

Abstract：Objective To study the effect of Maxingshigan decoction on expression of airway epithelial cell mucin in asthmatic rats and explore its role in mucus hypersecretion in asthma.Methods 44 male SD SPF rats were randomly divided into 4 groups，the control group（A group），asthma group（B group），Asthma+budesonide group（C group），asthma+apricot stone group（D group）.Take the bronchoalveolar lavage fluid（BALF）to detect the IL-12，IL-13 concentration；cut the lung tissue HE staining observation of airway inflammation，examined the expression of rat airway mucin AB-PAS method， detecting the absorbance after using SPSS17.0 statistics.Results ① Maxingshigan decoction could decrease the concentration of IL-13 in BALF of asthmatic group and up-regulate the content of IL-12.② Maxingshigan decoction can reduce the airway and vascular myometrial hyperplasia of asthmatic rats，reduce the surrounding inflammatory cell leaching.③ Asthmatic group had a high secretion of airway mucus，and Maxingshigan decoction could down-regulate the expression of airway mucin，but the effect was weaker than that of budesonide group.Conclusion Maxingshigan decoction can reduce the expression of mucin，reduce the inflammatory reaction and airway mucus secretion in asthmatic rats，and provide the basis for its clinical application in asthma.

Key words：Maxingshigan decoction；Asthma；Budesonide；Mucin

支氣管哮喘（簡稱哮喘，bronchial asthma）是兒童時期最常見的慢性疾病之一[1]，發(fā)病率逐年攀升，其發(fā)病與氣道慢性炎癥、氣道高反應（airway hyperresponsiveness，AHR）、氣道重塑、粘液高分泌等密切相關(guān)。過度的氣道粘液分泌提示哮喘控制不佳，是許多哮喘患兒的共同臨床特點，已經(jīng)成為影響哮喘病情和預后的獨立危險因素，但在哮喘發(fā)病中的作用往往被忽視[2]。減少粘液分泌、促進粘液排出是哮喘防治亟待解決的重要課題。麻杏石甘湯出自經(jīng)典國方《傷寒論》，由麻黃、杏仁、炙甘草、石膏四味藥組成，是治療熱哮的良方?，F(xiàn)代藥理學研究表明其具有解熱平喘、鎮(zhèn)咳祛痰、抗炎、抗過敏的功效[3]。但其在哮喘防治中的具體機制仍未闡明，對哮喘氣道粘液分泌的影響更是鮮有報道。因此，本研究擬通過建立哮喘大鼠模型，采用AB-PAS染色法等研究氣道粘蛋白表達，探討麻杏石甘湯在哮喘粘液高分泌中的作用。endprint

1材料與方法

1.1藥物及試劑

卵清白蛋白（ovalbumini，OVA）、焦磷酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）購自美國Sigma公司，吸入用布地奈德混懸液來自阿斯利康公司，大鼠IL-12、IL-13、ELISA試劑盒來自美國R&D公司，AB-PAS染色試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司，其余試劑為市售分析純試劑。實驗過程均遵從學校實驗動物正規(guī)流程審批、購買、飼養(yǎng)，本文作者在實驗前已通過本省實驗動物相關(guān)培訓。

1.2 麻杏石甘湯的制備

麻黃6 g，杏仁6 g，甘草5 g，石膏20 g，煎制根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局頒布的《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》。先將石膏煮20 min，后將浸泡30 min的麻黃、杏仁及甘草放入同煎15 min，倒取第一道汁待用。在剩余藥渣中加入雙倍雙蒸水，再次煎煮15 min后取汁，第一、二道汁混合后采用蒸發(fā)法濃縮至相應體積。最后獲得含生藥12.3 g/kg的麻杏石甘湯，儲存于4℃冰箱備用。

1.3實驗動物分組及處理

44只幼年雄性SD大鼠，SPF級（購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心），重120～180 g，采用數(shù)字編號法隨機分為；四組，每組11只：對照組（A組）、哮喘組（B組）、哮喘+布地奈德組（C組），哮喘+麻杏石甘湯組（D組）。通過致敏和激發(fā)兩階段制作哮喘模型。致敏階段：混合卵含白蛋白（OVA）、氫氧化鋁凝膠制成無菌抗原液，分別于第1 d和第8 d注射B組大鼠， A組則用等量的生理鹽水替代。激發(fā)階段：第2次致敏1 w后， 將B-D組哮喘大鼠放入40×30×20 cm3的自制密閉玻璃箱中， 霧化吸入含1%OVA的生理鹽水，定時1次/d，30 min/次，連續(xù)激發(fā)3 d；A組同樣用生理鹽水代替OVA進行。C組大鼠在第2次致敏后的第4 d開始予布地奈德混懸液2 ml+生理鹽水2 ml霧化，2次/d；每次激發(fā)前后4 h再次布地奈德霧化。D組在第2次致敏后第4 d起予之前制備的麻杏石甘湯灌胃，2次/d，激發(fā)階段則在每次激發(fā)前后4 h采用灌胃針灌入麻杏石甘湯。

1.4 標本的制備

末次激發(fā)24 h后，予腹腔注射3 ml/kg 10%水合氯醛鎮(zhèn)靜，固定大鼠，切開腹主動脈取血處死。即刻切開氣管，結(jié)扎、切取左肺置入液氮保溫杯中，后經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片等處理。肺組織切片行HE染色、AB-PAS染色。氣管插管后行右肺灌洗術(shù)，每次灌洗后回收70%以上支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid， BALF）為合格。2000 rpm/min離心15 min， 取上清-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 BALF中IL-12 和IL-13濃度測定

應用sandwich ELISA法檢測BALF中IL-12、IL-13的濃度。具體實驗過程參考試劑說明書進行。

1.6 AB-PAS法檢測氣道粘蛋白表達

石蠟切片脫蠟至水，3%醋酸水溶液室溫1 min， 1%Alcian blue染色液染色15 min，蒸餾水洗后1%過碘酸氧化8 min，Schiff染色12 min，水洗后脫水封片。硫酸化粘液呈黑色，酸性粘液呈蘭色，中性粘液呈紅色。采用圖像分析儀測定軟件測取肺組織粘蛋白平均吸光度值作為粘蛋白定量測定量。

1.7 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析軟件為SPSS17.0，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，并以（x±s）表示。多組樣本均數(shù)比較采用方差分析（One-way ANOVA），方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者采用Tamhane's T2檢驗。

2結(jié)果

2.1哮喘模型的生物學判斷

OVA霧化激發(fā)時，哮喘組大鼠可見毛色失去光澤、躁動不安、呼吸急促、四肢抖動，嚴重者四肢癱軟，俯伏不動，呼吸節(jié)律欠規(guī)則。麻杏石甘湯及布地奈德組大鼠激發(fā)后表現(xiàn)較哮喘組有改善。

2.2大鼠BALF中IL-12、IL-13

與對照組相比，哮喘組BALF中IL-13濃度顯著升高，IL-12濃度下降。布地奈德、麻杏石甘湯均能降低哮喘組BALF中IL-13濃度，上調(diào)IL-12含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且布地奈德作用強于麻杏石甘湯，見圖1。

圖1 各組哮喘大鼠BALF中IL-12、IL-13的濃度

2.3 大鼠肺組織病理改變

正常組大鼠氣道、血管形態(tài)規(guī)整，未見明顯炎性細胞浸潤。哮喘組氣道、血管肌層明顯增生，部分氣道上皮脫落，管腔內(nèi)可見粘液栓，氣道周圍嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤明顯。C、D組大鼠肺組織炎性細胞浸潤、血管平滑肌增生、粘液栓形成均較B組減輕，見圖2。

2.4 麻杏石甘湯調(diào)控氣道粘蛋白的表達

運用AB-PAS染色法發(fā)現(xiàn)，粘蛋白主要表達于氣道上皮細胞，尤以大氣道為著。B組粘蛋白表達（吸光度值：87.94±28.13）較A組（21.57±10.25）明顯增多（P<0.01），麻杏石甘湯（57.71±22.45）干預后能明顯減少哮喘大鼠氣道上皮粘蛋白的表達（P<0.5），但較布地奈德組（46.83±17.41）表達仍有增多，見圖3。

3討論

Th（T helper cell，輔助性T淋巴細胞）1/Th2失衡被公認為是哮喘發(fā)病的重要免疫學機制[4]。Th1和Th2分泌的細胞因子在促進自身亞型的分化同時，對另一細胞亞型起著抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，Th2細胞因子IL-4、IL-13等的優(yōu)勢表達，可進一步誘導趨化因子介導肺部炎癥，誘導分泌IgE（immunglobulin E，免疫球蛋白E），促進粘液高分泌，加重AHR，還可直接刺激成纖維細胞參與氣道重塑，在哮喘發(fā)病中起著獨特而重要的作用[5]。本實驗中，哮喘組大鼠BALF中Th2細胞因子IL-13濃度明顯升高，Th1細胞因子IL-12濃度下調(diào)，證實與正常大鼠相比，哮喘大鼠存在Th1/Th2比例失衡，與文獻報道一致[4， 6]。進一步對哮喘大鼠肺組織切片行HE染色可見氣道平滑肌及血管肌層明顯增生，部分氣道上皮細胞損傷、脫落，周圍大量炎性細胞（嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞）浸潤，提示哮喘狀態(tài)時氣道炎癥明顯，本研究中哮喘模型復制成功。endprint

氣道上皮細胞是氣道結(jié)構(gòu)細胞，表面覆蓋以氣道粘液作為物理屏障，粘液分泌的穩(wěn)態(tài)性對氣道的粘膜纖毛和固有免疫起著屏障、濕潤、運輸、免疫的作用。病理狀態(tài)下，過度的粘液分泌可降低粘膜纖毛清除率和限制氣流，導致氣道阻塞、氣流受損、肺功能進行性下降、細菌感染機會增加等。與慢性阻塞性肺疾病（COPD）相比，哮喘患者的氣道粘液更為粘稠，易產(chǎn)生凝膠狀的粘液栓并可能阻塞氣道[7]。過量的粘液產(chǎn)生是哮喘患者，特別是重癥患者發(fā)病與死亡率增加的主要原因，但其機制尚不清楚[8]。粘蛋白是粘液中的主要蛋白成分，是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，由氣道上皮杯狀細胞和黏膜下層的黏液細胞分泌，其編碼基因為粘蛋白基因（MUC）。在人類氣道內(nèi)主要的分泌型粘蛋白為MUC5AC和MUC5B， 其中MUC5AC 水平高低代表了杯狀細胞增生的程度。本實驗運用AB-PAS法染色發(fā)現(xiàn)，各組大鼠粘蛋白均表達于氣道上皮細胞，其中哮喘大鼠氣道上皮粘蛋白表達明顯增多，證實哮喘病理狀態(tài)時存在氣道粘液高分泌，這與國外學者研究一致[9]。但本研究并未能從MUC5AC、MUC5B等基因?qū)用孢M一步深入探究。另外，Suzaki I等[10]報道IL-13處理后杯狀細胞含量能增加10倍，認為IL-13能夠刺激杯狀細胞化生、粘蛋白形成。Tyner JW等[11]也發(fā)現(xiàn)，當用IL-13干預氣-液交界面的小鼠氣道上皮細胞時，能誘導纖毛細胞向杯狀細胞化生。本研究中，哮喘大鼠IL-13和粘蛋白表達亦均有升高，兩者之間是否存在相關(guān)性及具體機制還有待進一步研究。

吸入性糖皮質(zhì)激素（ICS）是哮喘長期控制的首選藥物，可有效控制哮喘癥狀、改善生命質(zhì)量、改善肺功能、減輕氣道炎癥和氣道高反應性、減少哮喘發(fā)作、降低哮喘死亡率[12-13]。布地奈德霧化吸入作為哮喘防治的一線經(jīng)典用藥，可通過細胞內(nèi)受體的基因組機制和細胞膜的非基因組機制起作用[14]，循證醫(yī)學表明布地奈德治療哮喘急性發(fā)作起效迅速，可在40min內(nèi)產(chǎn)生明顯的氣道血管收縮作用，從而抑制氣道壁的水腫及血漿滲漏[15]，因此，本研究中將布地奈德霧化吸入作為陽性藥物對照組。本實驗可見，與哮喘組相比，布地奈德霧化后能明顯下調(diào)大鼠BALF中IL-13的濃度，減輕氣道炎癥反應，減少氣道上皮細胞粘蛋白表達，提示布地奈德可改善哮喘氣道炎癥及粘液高分泌狀態(tài)。

中醫(yī)藥學歷史悠久，大量實驗研究已證實某些中草藥具有抗炎、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)作用，中西醫(yī)聯(lián)合治療在兒童哮喘防治中的作用受到越來越多的關(guān)注，2016版兒童哮喘指南已將中藥列入治療方案[16]。中醫(yī)認為，痰飲留伏是哮喘發(fā)生的內(nèi)在因素，麻杏石甘湯具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效，在臨床中的應用已久。現(xiàn)代藥理學研究證實麻杏石甘湯中麻黃所含的麻黃堿為β2受體激動劑，可活化腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）、舒張支氣管平滑肌痙攣；苦杏仁苷是杏仁中所含的成分，經(jīng)酶水解后產(chǎn)生氫氰酸，可有止咳平喘作用，并能促進動脈壁前列腺I2（PGI2）樣物質(zhì)生成，擴張微血管，改善微循環(huán)；生石膏的成分主要為含水硫酸鈣，可抑制及鎮(zhèn)靜支氣管神經(jīng)肌肉，且鈣質(zhì)能降低支氣管通透性，故有解除支氣管痙攣的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯可減少哮喘大鼠嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎性細胞浸潤，下調(diào)BALF中Th2細胞因子IL-13的濃度，減輕變態(tài)反應。運用AB-PAS染色法發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯灌胃干預哮喘大鼠后，其氣道上皮細胞粘蛋白的分泌亦明顯減少。國內(nèi)也有學者報道[18]麻杏石甘湯可降低小鼠BALF中MUC5AC濃度，提示麻杏石甘湯在改善哮喘粘液高分泌方面具有一定的作用。但是，我們也看到，與陽性藥物對照組布地奈德霧化吸入比較，麻杏石甘湯在減輕肺組織炎癥、減少氣道粘蛋白分泌方面仍有一定差距，提示單獨藥物治療哮喘時仍應以ICS為主，麻杏石甘湯可作為輔助用藥協(xié)同參與哮喘防治。

綜上所述，本實驗證實麻杏石甘湯能減少哮喘大鼠Th2細胞因子IL-13、氣道炎癥及粘蛋白的表達，減輕炎癥反應，減少粘液高分泌，為其現(xiàn)代臨床應用提供了依據(jù)。進一步深入研究具體信號通路及相關(guān)炎癥因子，臨床麻杏石甘湯片劑的研制等，將為哮喘的中西醫(yī)結(jié)合治療開辟新的途徑。

參考文獻：

[1]洪建國，鮑一笑.重視兒童支氣管哮喘的規(guī)范化診治[J].中華兒科雜志，2016，54（3）：161-162.

[2]Takami S，Mizuno T，Oyanagi T，et al.Glucocorticoids inhibit MUC5AC production induced by transforming growth factor-alpha in human respiratory cells[J].Allergol Int，2012，61（3）：451-459.

[3]洪佳璇，楊季國.麻杏石甘湯的臨床應用及研究概況[J].中國急救醫(yī)學，2015（z1）：122-123.

[4]Hwang Y H，Paik M J，Yee S T.Diisononyl phthalate induces asthma via modulation of Th1 Th2 equilibrium[J].Toxicol Lett，2017（272）：49-59.

[5]Gallelli L，Busceti M T，Vatrella A，et al.Update on anticytokine treatment for asthma[J].Biomed Res Int，2013，2013：104315.

[6]Xiong L，F(xiàn)ang Z Y，Tao X N，et al.Effect and mechanism of ligustrazine on Th1 Th2 cytokines in a rat asthma model[J].Am J Chin Med，2007，35（6）：1011-1020.endprint

[7]Tillie-Leblond I，Gosset P，Tonnel A B.Inflammatory events in severe acute asthma[J].Allergy，2005，60（1）：23-29.

[8]Gras D，Chanez P，Vachier I，et al.Bronchial epithelium as a target for innovative treatments in asthma[J].Pharmacol Ther，2013，140（3）：290-305.

[9]Lachowicz-Scroggins M E，Yuan S，Kerr S C，et al.Abnormalities in MUC5AC and MUC5B Protein in Airway Mucus in Asthma[J].Am J Respir Crit Care Med，2016，194（10）：1296-1299.

[10]Suzaki I，Kawano S，Komiya K，et al.Inhibition of IL-13-induced periostin in airway epithelium attenuates cellular protein expression of MUC5AC[J].Respirology，2017，22（1）：93-100.

[11]Tyner J W，Kim E Y，Ide K，et al.Blocking airway mucous cell metaplasia by inhibiting EGFR antiapoptosis and IL-13 transdifferentiation signals[J].J Clin Invest，2006，116（2）：309-321.

[12]Bisgaard H，Le Roux P，Bjamer D，et al.Budesonide formoterol maintenance plus reliever therapy：a new strategy in pediatric asthma[J].Chest，2006，130（6）：1733-1743.

[13]Horak F，Doberer D，Eber E，et al.Diagnosis and management of asthma - Statement on the 2015 GINA Guidelines[J].Wien Klin Wochenschr，2016，128（15-16）：541-554.

[14]Alangari A A.Genomic and non-genomic actions of glucocorticoids in asthma[J].Ann Thorac Med，2010，5（3）：133-139.

[15]Price D B，Gefen E，Gopalan G，et al.Real-life effectiveness and safety of the inhalation suspension budesonide comparator vs the originator product for the treatment of patients with asthma： a historical cohort study using a US health claims database[J].Pragmat Obs Res，2017（8）：69-83.

[16]中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組，編輯委員會中華兒科雜志.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）[J].中華兒科雜志，2016，54（3）：167-181.

[17]桑杲，陳志敏.麻杏石甘湯治療小兒支氣管哮喘的藥理研究及臨床應用進展[J].浙江中醫(yī)雜志，2006，41（6）：366-368.

[18]孫雪文，王曉華，張志濤，等.麻杏石甘湯不同煎煮法對哮喘模型小鼠MUC5AC和HIF-1α的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（11）：1507-1509，1575.endprint