貓泛白細胞減少癥病毒單克隆抗體的制備及其制備膠體金檢測試紙條的應用

王瑩 白晶晶 李玉芳 錢鵬 曹玉姣 陳凌燕 郝麗影 鄧均華 田克恭

摘要 制備貓泛白細胞減少癥病毒（FPV）單克隆抗體，研制膠體金檢測試紙條。用FPV臨床分離株免疫Balb/c小鼠，取血凝抑制（HI）效價最高的小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合，采用HI方法篩選獲得2株可穩(wěn)定分泌FPV單克隆抗體的雜交瘤細胞，并對其用于膠體金檢測試紙條進行評價。2株雜交瘤細胞3C3和4A1株，分泌的單克隆抗體重鏈亞型分別為IgG2b、IgG2a，輕鏈亞型均為kappa;腹水純化后單克隆抗體3C3、4A1的HI效價分別為1∶5 120、1∶10 240。用膠體金標記單克隆抗體4A1，單克隆抗體3C3作為檢測線，羊抗鼠二抗作為對照線制備的膠體金檢測試紙條，檢測FPV病毒液的靈敏度為103.7TCID50/mL;檢測貓源其他病毒如FHV-1、FCV均為陰性;批內(nèi)和批間重復性檢測不同含量的FPV結果一致;檢測513份臨床樣品，與PCR的陽性符合率為76%（71/93），陰性符合率為100%（420/420），總符合率為96%（491/513）。該研究制備的FPV單克隆抗體可用于FPV膠體金檢測試紙條的生產(chǎn)，用于FPV的現(xiàn)場快速檢測。

關鍵詞 貓泛白細胞減少癥病毒;單克隆抗體;膠體金檢測試紙條

中圖分類號 S 855.3 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2021）15-0099-05

Abstract Feline panleukopenia virus （FPV） monoclonal antibodies （MAbs） were developed for the preparation of colloidal gold test strips. Balb/c mice were firstly immunized with FPV clinical strain， and then the spleen cells of the mouse with the highest hemagglutination inhibition （HI） titers were fused with myeloma cells SP2/0. Hybridoma cells 3C3 and 4A1 strains were screened by HI and chosen for the preparation of immunochromatographic test strips. The HI titers of the MAbs from purified ascites 3C3 and 4A1 are 1∶5 120 and 1∶10 240， and the heavy chain subtypes were IgG2b and IgG2a selectively， the light chain subtypes were both kappa. The MAb 4A1 was conjugated with colloid gold， the 3C3 was coated on a porous nitrocellulose membrane as the detection line， and the Goat antirat IgG antibody was coated as the control line， respectively. The detection limit of the strip was 103.7TCID50/mL and no crossreaction occurred between FPV and other feline viruses. Intraassay and interassay repeatability test results were consistent. 513 clinical samples were tested by both the test and PCR. The result showed that the positive coincidence rate of the test was 76% （71/93） with PCR， the negative coincidence rate was 100% （420/420）， and the overall consistency rate was 96% （491/513）. The MAbs 3C3 and 4A1 prepared in this study could be used for the preparation of colloidal gold test strip.

Key words Feline panleukopenia virus;Monoclonal antibody;Colloidal gold immnuochromatographic assay

基金項目 洛陽市河洛英才計劃“新型獸用生物制品研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化”。

作者簡介 王瑩（1986—），女，河南新鄉(xiāng)人，高級工程師，碩士，從事診斷試劑研究;白晶晶（1987—），女，河南鞏義人，助理工程師，從事診斷試劑研究。王瑩和白晶晶為共同第一作者。

*通信作者：鄧均華，獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫苗和診斷試劑研究;田克恭，研究員，博士，從事動物疫病診斷和防控技術研究。

收稿日期 2021-01-01

貓泛白細胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV）又稱貓細小病毒（Feline parvo virus）、貓瘟病毒（Feline distemper）、貓傳染性腸炎病毒（Feline infectious enteritis），屬于細小病毒科細小病毒屬，為單鏈DNA病毒，編碼VP1、VP2這2種結構蛋白，其中VP2蛋白為主要衣殼蛋白，是病毒主要的免疫保護性抗原蛋白[1-2]。FPV感染范圍較廣、傳播速度較快，可感染貓科、鼬科及浣熊科動物等[3-4];可引發(fā)一種急性高度接觸性傳染病即貓泛白細胞減少癥，又稱貓瘟熱、貓傳染性腸炎、貓細小病毒性腸炎、貓共濟失調(diào)癥等。貓泛白細胞減少癥以高熱、嘔吐、脫水、白細胞嚴重減少和出血性腸炎為主要臨床特征，感染率可達70%，死亡率最高達90%[5-8]。

目前，貓泛白細胞減少癥的檢測主要依賴于病毒分離、血凝和血凝抑制試驗、分子生物學診斷等[9-16]，其中，病毒分離耗時費力，對細胞培養(yǎng)要求高，敏感性較低、周期較長;血凝和血凝抑制試驗不僅需要紅細胞且要求紅細胞必須現(xiàn)配現(xiàn)用，操作時間較長，臨床檢測時易受排泄物中雜質(zhì)的干擾;分子生物學診斷所需的試驗條件要求嚴格，需要專門的儀器、專業(yè)的技術人員，代價較高，應用受限。因此，這些方法均沒有推廣開來，難以實現(xiàn)獸醫(yī)臨床現(xiàn)場的應用。隨著寵物貓養(yǎng)殖量增多及試驗動物用貓的增多，對貓的疫病預防和控制需高度重視。因此，急需研制一種快速簡便、特異性強、準確地檢測貓泛白細胞減少癥病毒的產(chǎn)品以用于臨床實時診斷。

筆者利用實驗室分離鑒定的FPV 1009株免疫小鼠制備單克隆抗體，通過篩選獲得雜交瘤細胞3C3、4A1株并對其進行鑒定，然后用單克隆抗體3C3和4A1配對制備貓泛白細胞減少癥病毒膠體金檢測試紙條并對其進行評價，檢驗其臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和毒株。SP2/0細胞由洛陽普泰生物技術有限公司保存。表達FPV VP2蛋白病毒樣顆粒的重組桿狀病毒FPV-VP2株、表達FPV VP1蛋白的重組桿狀病毒FPV-VP1株、FPV 1009株、貓杯狀病毒（Feline calici virus，F(xiàn)CV）FC008株、貓皰疹病毒1型（Feline herpes virus type 1，F(xiàn)HV-1）C-27株，均由國家獸用藥品工程技術研究中心鑒定和保存。

1.1.2 試驗動物。SPF級Balb/c雌性小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基、試劑和耗材。1640培養(yǎng)基購自美國Life Technologies。HAT混合鹽、HT混合鹽、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG1500等均購自Sigma公司。FPV PCR檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。小鼠單抗Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒，購自洛陽佰奧通試驗材料中心。BCA蛋白定量試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。Ni2+親和層析填料，購自美國GE Healthcare公司。羊抗鼠IgG，購自北京萬域美瀾科技有限公司。硝酸纖維素膜（NC膜），購自Millipore公司。樣品墊和PVC底板，購自上海金標生物科技有限公司。其他常規(guī)用試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 單克隆抗體的制備及鑒定。

1.2.1.1 小鼠免疫。將FPV 1009株病毒液作為免疫原，按200 μL/只的量皮下多點免疫4～6周齡雌性Balb/c小鼠，首免時與弗氏完全佐劑等體積乳化，后續(xù)免疫時與弗氏不完全佐劑等體積乳化。免疫間隔時間為14 d。于三免后采集小鼠血清，用血凝抑制試驗（HI）測定血清的HI抗體效價。選擇HI抗體效價最高的小鼠進行細胞融合，于融合前3 d腹腔注射FPV 1009株病毒液200 μL進行超免。其中，血凝抑制試驗按《中國獸藥典》附錄操作，先進行紅細胞凝集試驗即HA試驗，根據(jù)結果制備8單位抗原，再對待檢樣品進行紅細胞凝集抑制試驗即HI效價測定。

1.2.1.2 雜交瘤細胞株的制備。

（1）細胞融合。無菌分離超免小鼠的脾細胞，將其與SP2/0細胞混合后，按常規(guī)方法進行細胞融合。將融合后的細胞滴加至提前鋪有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞板中，于37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。

（2）雜交瘤細胞的篩選及亞克隆。當細胞長至孔底面積1/3～1/2時，取上清用血凝抑制試驗（HI）進行檢測。用有限稀釋法對HI陽性的孔進行亞克隆，經(jīng)過4次篩選和3次克隆，篩選出雜交瘤細胞上清陽性率為100%的雜交瘤細胞，優(yōu)選陽性雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)及細胞凍存。

1.2.1.3 單克隆抗體的制備、純化。選擇生長狀態(tài)良好的Balb/c小鼠，按0.5 mL/只的劑量腹腔注射無菌液體石蠟。將雜交瘤細胞懸浮，再對小鼠腹腔注射。待小鼠腹部明顯膨大、行動困難時采集腹水，以10 000 r/min離心10 min，收集上清即為單克隆抗體。將其用Protein G親和層析法分別純化，獲得純化后的單克隆抗體，并用BCA試劑盒進行含量測定。

1.2.1.4 單克隆抗體的鑒定。

①亞類鑒定。按照亞類鑒定試劑盒說明書進行單克隆抗體亞類鑒定。

②HI效價測定。按照血凝抑制試驗（HI）測定單克隆抗體的HI抗體效價。

③特異性鑒定。用FPV 1009株、FCV FC008株、FHV-1 C-27株制備IFA抗原板，分別按常規(guī)方法進行IFA檢測，同時分別設置加陽性血清、PB緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）作為陽性對照、陰性對照，用于測定單克隆抗體的特異性。

④單克隆抗體識別蛋白的鑒定。將重組桿狀病毒FPV-VP2株、重組桿狀病毒FPV-VP1株轉染Sf9細胞培養(yǎng)，待細胞明顯病變后用80%冷丙酮固定，作為IFA抗原板，將單克隆抗體作為一抗，同時設置陽性對照、陰性對照，按照常規(guī)方法進行間接免疫熒光IFA檢測。結果判定：正常對照細胞孔無特異性熒光、陽性對照孔中細胞出現(xiàn)黃綠色熒光時試驗成立，樣品孔若觀察到黃綠色熒光判為陽性，否則為陰性。

1.2.2 膠體金檢測試紙條的制備及評價。

1.2.2.1 膠體金檢測試紙條的制備。用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，將0.01%氯金酸溶液加熱煮沸后加入1.8 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，制備成膠體金，冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至100 mL。用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8.0，勻速攪拌后將單克隆抗體4A1按18 μg/mL加于膠體金溶液中進行標記，攪拌后逐滴加入適量的10%BSA，勻速攪拌30 min。于2～8 ℃靜置2 h后，4 ℃、2 000 r/min離心30 min，沉淀用1/10體積的含1%BSA的PBS緩沖液溶解，即為金標單克隆抗體4A1，將其噴涂后制備成金標墊;將單克隆抗體3C3（包被濃度為1.5 mg/mL）和羊抗鼠IgG（包被濃度為2 mg/mL）噴涂在硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質(zhì)控線。將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊黏貼于底板上，即為FPV膠體金檢測試紙條。

1.2.2.2 膠體金檢測試紙條的評價。

①特異性檢驗。用試紙條分別檢測FPV、FCV FC008株、FHV-1 C-27株以及樣品處理液。

②靈敏度檢驗。用試紙條分別檢測FPV（105.5 TCID50/mL）病毒液及其稀釋液。

③ 重復性檢驗。用不同批的試紙條以及同一批的多個試紙條分別檢測FPV病毒液的靈敏度以及FCV、FHV-1、樣品處理液。

④與PCR方法的比較。用試紙條對收集到的多家寵物醫(yī)院的貓拭子或糞便樣品513份進行檢測，并用FPV PCR方法（按照商品化試劑盒操作說明書完成）進行復核檢測。

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體的制備及鑒定

三免后取小鼠血清HI效價最高（為1∶5 120）的小鼠進行超免，之后取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合、篩選，通過細胞生長狀態(tài)、細胞上清效價優(yōu)選出2株陽性雜交瘤細胞并進行擴大培養(yǎng)及細胞凍存，將其命名為雜交瘤細胞3C3、4A1。經(jīng)HI效價測定，雜交瘤細胞3C3、4A1細胞上清的HI效價分別為1∶32、1∶64。用小鼠腹水法分別制備腹水并純化，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測，電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色，單克隆抗體3C3、4A1均在約55和25 kD分別出現(xiàn)明顯的蛋白條帶;染色后的凝膠經(jīng)凝膠成像儀掃描，經(jīng)軟件分析純度分別為87%、92%。用BCA蛋白定量試劑盒測得單克隆抗體3C3、4A1的蛋白含量分別為4.0、3.8 mg/mL。用亞類鑒定試劑盒測定單克隆抗體3C3、4A1的重鏈亞型分別為IgG2b、IgG2a，輕鏈亞型均為kappa。用血凝抑制試驗測得純化后單克隆抗體3C3、4A1的HI效價分別為1∶5 120、1∶10 240。用IFA方法測定單克隆抗體的特異性，結果見圖1。由圖1可知，單克隆抗體3C3、4A1僅與FPV反應為陽性，與FHV-1、FCV反應均為陰性。表明單克隆抗體3C3、4A1僅與貓泛白細胞減少癥病毒發(fā)生反應，與貓源其他病毒反應均為陰性。

2.2 單克隆抗體識別蛋白的鑒定

用IFA方法測定單克隆抗體與重組桿狀病毒FPV-VP2株、重組桿狀病毒FPV-VP1株的反應性，結果表明，單克隆抗體3C3、4A1僅與FPV-VP2株均出現(xiàn)特異性熒光（圖2），與FPV-VP1株反應則為陰性（結果未呈現(xiàn)），且單克隆抗體3C3反應較弱。表明單克隆抗體3C3、4A1均識別FPV VP2蛋白。

2.3 膠體金檢測試紙條的制備及鑒定

將單克隆抗體4A1用膠體金標記后噴涂以制備金標墊，將單克隆抗體3C3和羊抗鼠IgG噴涂在硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質(zhì)控線，將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊黏貼于底板上，裁剪后制成FPV膠體金檢測試紙條。

將FPV、FHV-1、FCV以及樣品處理液分別用試紙條進行特異性檢驗，結果見圖3。由圖3可知，試紙條僅能檢測FPV，檢測貓源其他常見病毒均為陰性，表明試紙條特異性良好。

用試紙條檢測FPV（105.5TCID50/mL）病毒液及其稀釋液進行靈敏度檢驗，結果見圖4。由圖4可知，試紙條檢測FPV病毒液的靈敏度為103.7TCID50/mL（對應1∶64稀釋液）。

將不同批的試紙條以及同一批的多個試紙條分別檢測FPV病毒液的靈敏度，以進行重復性檢驗，結果表明，靈敏度一致，且檢測同一樣品的顯色程度一致;檢測FHV-1、FCV及樣品處理液的結果均為陰性，表明試紙條的重復性良好。

2.4 與PCR方法的比較

用試紙條對收集到的多家寵物醫(yī)院的臨床樣品513份進行檢測，并用FPV PCR方法進行復核檢測。結果見表1。由表1可知，試紙條檢出陽性71份、陰性442份;PCR檢出93份陽性（其中22份陽性為試紙條檢測為陰性的樣品）、420份陰性，陽性符合率為76%（71/93）、陰性符合率為100%（420/420），總符合率為96%（491/513）。

3 結論與討論

目前，在世界范圍內(nèi)，貓作為試驗動物在醫(yī)學、生物學等試驗和動物疾病模型研究中的應用越來越廣泛，在某些試驗中，如藥理學、血壓相關試驗、疾病診斷、營養(yǎng)學相關研究、腫瘤學、解剖學等研究中功不可沒[17]。中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所和國家動物疾病防控中心、美國俄亥俄州立大學的病毒學家研究發(fā)現(xiàn)新冠病毒貓體內(nèi)可有效復制且復制率較高，幼貓更為嚴重，因此可考慮將貓作為測試新冠病毒疫苗和藥物評估的模型動物[17-20]。貓作為試驗動物，雖然應用越來越廣泛，但由于檢測試劑缺乏，用作試驗的貓多數(shù)為未經(jīng)嚴格檢測的寵物貓、捕獲的野貓或中華田園貓，國內(nèi)目前尚未見有開展試驗用貓的檢測報告，安全隱患突顯。為了保證試驗時試驗貓的質(zhì)量水平、提高試驗的準確度，為了保障養(yǎng)貓人的人身健康和安全，國家獸用藥品工程技術研究中心診斷試劑團隊一直致力于寵物診斷試劑的開發(fā)。

雖然國內(nèi)外早有HA/HI、ELISA、病毒分離方法，但這些方法不利于進行臨床的實時檢測。該研究將FPV臨床分離株免疫Balb/c小鼠，取小鼠血清HI效價最高的小鼠融合后，取其脾細胞與SP2/0細胞融合，通過篩選和亞克隆獲得雜交瘤細胞3C3、4A1，制備腹水后用Protein G親和層析法純化獲得純化單克隆抗體3C3、4A1，純度均≥87%、蛋白含量均≥3.8 mg/mL，經(jīng)鑒定僅與FPV均發(fā)生特異性反應，與貓源其他病毒反應均為陰性，均識別VP2蛋白，HI效價分別為1∶5 120和1∶10 240。經(jīng)IFA方法鑒定，單克隆抗體4A1與重組桿狀病毒FPV-VP2株的反應較強，而單克隆抗體3C3的反應稍弱，推測單克隆抗體4A1識別的是重組桿狀病毒FPV-VP2株暴露的抗原表位，而單克隆抗體3C3識別的FPV VP2表位在FPV全病毒和重組FPV VP2蛋白中暴露情況或蛋白構象可能存在差異。

制成FPV膠體金檢測試紙條，經(jīng)檢測靈敏度為103.7TCID50/mL，特異性強，重復性良好;檢測臨床樣品與PCR的陽性符合率為76%（71/93）、陰性符合率為100%（420/420）、總符合率為96%（491/513）。由于試紙條本身的靈敏度不及PCR方法，無法檢測到相對較低的豐度，而該試紙條檢測PCR陽性的93份陽性中有22份為陰性，且這22份樣品的PCR條帶較弱，故未檢出。

綜上所述，該研究制備了貓泛白細胞減少癥病毒單克隆抗體，進一步研制出FPV膠體金檢測試紙條，檢測快速、簡便、準確，在臨床上具有很好的應用前景，有一定的經(jīng)濟和社會價值，并為把控試驗動物貓的質(zhì)量水平、提高試驗的準確度奠定了基礎。

參考文獻

[1] AN D J，JEONG W，JEONG H Y，et al.Phylogenetic analysis of feline panleukopenia virus（FPLV）strains in Korean cats[J].Res Vet Sci，2011，90（1）：163-167.

[2] 殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：1145-1172.

[3] JIAO C C，ZHANG H L，LIU W，et al.Construction and immunogenicity of viruslike particles of feline parvovirus from the tiger[J].Viruses，2020，12（3）：1-8.

[4] DIAO ?F F，ZHAO Y F，WANG J L，et al.Molecular characterization of feline panleukopenia virus isolated from mink and its pathogenesis in mink[J].Vet Microbiol，2017，205：92-98.

[5] 扈榮良.現(xiàn)代動物病毒學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014：758-773.

[6] 亢文華，趙鳳龍，郝霖雨，等.貓泛白細胞減少癥病毒的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（9）：108-111.

[7] 辛光潔，王威，孫連志.貓泛白細胞減少癥病毒的血凝及血凝抑制試驗檢測[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2010，31（6）：9-10，12.

[8] 溫肖會，邱杰，呂殿紅，等.廣州市部分區(qū)域貓泛白細胞減少癥流行現(xiàn)狀調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2016，44（17）：120-122，237.

[9] 劉碧濤，任常寶，張曉戰(zhàn)，等.貓細小病毒的分離與鑒定[J].動物醫(yī)學進展，2013，34（9）：124-127.

[10] 邱薇，夏咸柱，范泉水，等.動物園貓瘟熱凈化的新手段——聚合酶鏈式反應[J].中國獸醫(yī)雜志，2001，37（5）：14-15.

[11] 劉維全，范泉水，江禹，等.肉食獸細小病毒通用PCR診斷技術的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2001，21（3）：249-251.

[12] 王翀，劉大飛，劉春國，等.同時檢測貓細小病毒、杯狀病毒、皰疹病毒1型多重PCR方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2014，36（1）：31-33.

[13] 亢文華，趙鳳龍，郝霖雨，等.貓泛白細胞減少癥的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（8）：112-116.

[14] WANG Z H，WANG X J，HOU S H.Development of a recombinase polymerase amplification assay with lateral flow dipstick for rapid detection of feline parvovirus[J/OL].J Virol Methods，2019，271[2020-10-24].https：//doi.org/10.1016/j.viromet.2019.113679.

[15] AWAD R A，KHALIL W K B，ATTALLAH A G.Epidemiology and diagnosis of feline panleukopenia virus in Egypt：Clinical and molecular diagnosis in cats[J].Vet World，2018，11（5）：578-584.

[16] RAHEENA K P，PRIYA P M，MANI B K，et al.Comparison of different diagnostic test to detect feline panleukopenia virus among cats in Kerala，India[J].Indian J Animal Res，2017，51（2）：347-349.

[17] 劉明慧，袁寶，陳健，等.貓實驗動物標準化的研究進展及探討[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2015，36（2）：29-30，32.

[18] MALLAPATY S.Coronavirus can infect catsdogs，not so much[J/OL].Nature，2020-04-01[2020-10-24].https：//www.nature.com/articles/d41586-020-00984-8.DOI.10.1038/D41586-020-00984-8.

[19] SHI J Z，WEN Z Y，ZHONG G X，et al.Susceptibility of ferrets，cats，dogs，and different domestic animals to SARScoronavirus2[J/OL].2020-03-30[2020-10-24].https：//www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.30.015347v1.

[20] ZHANG Q，ZHANG H J，HUANG K，et al.SARSCoV2 neutralizing serum antibodies in cats：A serological investigation[J/OL].2020-04-01[2020-10-24].https：//www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.01.021196v1.