• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光定量PCR探針熔解曲線法在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用

    2016-01-24 01:24:36胡春梅郭晶嚴虹施旭東張俠
    中國防癆雜志 2016年1期
    關(guān)鍵詞:乙胺丁醇表型

    胡春梅 郭晶 嚴虹 施旭東 張俠

    ?

    ·論著·

    熒光定量PCR探針熔解曲線法在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用

    胡春梅 郭晶 嚴虹 施旭東 張俠

    目的 應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對一線抗結(jié)核藥物的耐藥基因突變。方法 于2009年1月1日至2012年12月31日留取南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科門診部或住院的所有肺結(jié)核患者痰液標本,每人3~5 ml,均進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”),分離出結(jié)核分枝桿菌菌株67株。應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法,根據(jù)靶序列熔點變化,實時PCR檢測結(jié)核病患者的臨床分離標本對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥情況;通過與傳統(tǒng)藥敏試驗進行對比,對2種結(jié)果不一致的菌株進行基因測序分析,探討其發(fā)生突變的位點差異,并觀察在治療中的變化。結(jié)果 利福平和異煙肼的表型和基因型檢測具有較高的一致性,分別為99%(66/67)和97%(65/67),不一致的菌株都是表型檢測法為耐藥,而基因型檢測為敏感,測序未檢測到突變。乙胺丁醇和鏈霉素的表型和基因型檢測一致性較低,分別為60%(40/67)和75%(50/67)。測序發(fā)現(xiàn),乙胺丁醇的突變發(fā)生在embB306和embB406位點上;鏈霉素突變發(fā)生在rrs基因517位點和907位點,以及rpsL43耐藥密碼子。結(jié)論 應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法,能快速篩查結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況。

    探針熔解曲線法; 結(jié)核,肺; 抗藥性,多種,細菌; 耐藥基因; 突變

    耐多藥結(jié)核病是結(jié)核病治療中的重點和難點,開展結(jié)核分枝桿菌耐藥性的動態(tài)監(jiān)測,是結(jié)核病控制工作的一項重要內(nèi)容,也是制訂抗結(jié)核化療方案的重要依據(jù)。筆者曾對耐多藥肺結(jié)核患者在治療中的不同時間點,動態(tài)監(jiān)測其結(jié)核分枝桿菌的耐藥性,發(fā)現(xiàn)有獲得耐藥性及恢復(fù)敏感性的現(xiàn)象發(fā)生,其中異煙肼和利福平表現(xiàn)為高度耐藥性且穩(wěn)定,乙胺丁醇和左氧氟沙星表現(xiàn)為高獲得性耐藥[1-2]。結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”),是目前檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標準,但由于結(jié)核分枝桿菌生長緩慢,很難達到快速檢測的要求,具有一定局限性[3]?;蛐湍退帣z測,通過檢測結(jié)核分枝桿菌特定基因組區(qū)域的突變來預(yù)測耐藥,因其耗時短,能較快地指導(dǎo)臨床用藥,逐漸成為結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測的趨勢[4]。但有文獻報道,在臨床應(yīng)用中基因型耐藥檢測與表型耐藥檢測存在不一致[5-6]。因此,本研究設(shè)想應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥基因突變,并與傳統(tǒng)藥敏試驗法進行對比,衡量基因型檢測的一致性;對不一致性的菌株進行基因測序,探尋是否有新的突變位點,觀察耐多藥肺結(jié)核患者的耐多藥菌株在抗結(jié)核治療過程中,對一線抗結(jié)核藥物表型和基因型耐藥性的動態(tài)變化,為耐多藥肺結(jié)核治療方案的調(diào)整提供參考。

    材料和方法

    一、菌株來源

    于2009年1月1日至2012年12月31日,留取南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科門診部或住院的所有肺結(jié)核患者的痰液標本3~5 ml,均進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗。

    野生型菌株為國家結(jié)核病參比實驗室提供的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株。

    二、 方法

    1.痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定及藥敏試驗:按WHO和全國結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證要求[8-11],進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定,證實為結(jié)核分枝桿菌。用絕對濃度法[9]進行4種一線抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測。各藥物均設(shè)高低2個濃度,試驗濃度分別為:Sm(10,100) μg/ml,INH(1,10) μg/ml,EMB (5,50) μg/ml,RFP(25,250) μg/ml。以對照管生長,含藥高、低濃度管均不生長為敏感;含藥低濃度管生長、高濃度管不生長為中度耐藥;含藥高、低濃度管均生長為高度耐藥。本研究所指的耐藥包括中度耐藥和高度耐藥。其中用H37Rv標準株進行常規(guī)質(zhì)量控制,同時運用比例法與絕對濃度法進行對比試驗,以此對絕對濃度法進行質(zhì)量控制。

    2.耐多藥結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因突變的檢測:對67株待檢測的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株進行復(fù)活、接種、滅活,采用煮沸法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA(經(jīng)紫外定量,要求結(jié)核分枝桿菌含量不低于103拷貝/μl)進行加樣。同時設(shè)立陰性(無菌雙蒸水)和陽性對照品(H37Rv菌株)DNA各5 μl,用CFX96實時熒光PCR擴增儀(美國,伯樂公司)進行擴增。應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法(耐藥突變檢測試劑盒,廈門致善生物科技有限公司)檢測結(jié)核分枝桿菌菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的突變,進行耐藥篩選,用于獲得結(jié)核分枝桿菌對4種藥的耐藥信息。其中,利福平檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB基因507~533共27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp,利福平耐藥決定區(qū))的突變。異煙肼檢測ahpC啟動子區(qū)(-44~-30以及 -15~3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17~-8位點)及katG315密碼子的突變,具體可檢測的耐藥突變位點包括ahpC啟動子 -44A、-42C、-39T、-34C、-32A、-30T、-15T、-12T、-10A、-10G、-10T、-9A、-6A、-4G,ahpC4T,inhA94GCG,inhA啟動子 -17T、-16G、-15T、-11T、-8A、-8C,katG315AGG、katG315CGC、katG315CTC、katG315ACC、katG315AAC、katG315ATC、katG315ACA。乙胺丁醇檢測embB306、embB497、embB368、embB378、embB380和embB406位密碼子是否突變。鏈霉素檢測結(jié)核分枝桿菌rpsL基因43位密碼子和88位密碼子,以及rrs基因513~517位點和905~908位點的突變。

    采用梯度稀釋的野生型標準株H37Rv DNA考察探針熔解曲線分析法的分析敏感度,然后用標準盤驗證其檢測特異度。對熔解曲線法與傳統(tǒng)藥敏試驗檢測結(jié)果不一致的樣本進行測序。

    三、統(tǒng)計學分析

    本試驗用Chromas 2軟件分析測序結(jié)果,用Clustalx軟件比對是否突變,將整理后的突變數(shù)據(jù)和耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株藥敏試驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析,同一菌株的突變數(shù)據(jù)和耐藥數(shù)據(jù)相互對應(yīng)。

    結(jié) 果

    一、菌株的提取

    參照中國防癆協(xié)會[7]《耐藥結(jié)核病化學治療指南》,制定抗結(jié)核治療方案為6 Am(Cm)、Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z/18Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z,治療共24個月,每3個月進行1次痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。統(tǒng)計治療期間痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性2次以上(包括治療前)的耐多藥肺結(jié)核患者,共14例。其中男7例,女7例,年齡(35.0±9.0)歲,共獲得結(jié)核分枝桿菌菌株67株,-70 ℃冷凍保存在南京市胸科醫(yī)院中心實驗室菌株庫,進行治療前后4種常用抗結(jié)核藥物表型和基因型耐藥檢測的對比分析。

    二、耐藥表型及基因型檢測的一致性

    結(jié)核分枝桿菌菌株對4種抗結(jié)核藥物耐藥的表型及基因型檢測的一致性分別為:利福平99%(66/67)、異煙肼97%(65/67)、乙胺丁醇60%(40/67)、鏈霉素75%(50/67)。

    三、耐藥表型及基因型檢測不一致的菌株分析

    用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥,與藥敏試驗法結(jié)果不一致的菌株分別僅為1株、2株,都是表型檢測法為耐藥,而基因型檢測為敏感。對不一致菌株進行了測序,未檢測到突變。對乙胺丁醇耐藥檢測,2種方法不一致的菌株為27株,其中乙胺丁醇表型檢測法為耐藥,而基因型檢測為敏感有14株,對14株測序,相應(yīng)檢測位點峰型為單峰,未檢測到突變。對乙胺丁醇表型檢測敏感但基因型檢測耐藥的有13株,有10株樣本的突變發(fā)生在embB306位點上,其中有7株出現(xiàn)ATG→GTG突變,1株為ATG→CTG突變,1株為ATG→ATT突變,1株為ATG→ATA突變;有3株樣本的突變發(fā)生在embB406位點上,出現(xiàn)GGC→GCC突變。對鏈霉素耐藥檢測,2種方法不一致的菌株有17株菌株。其中6株表型檢測法結(jié)果為耐藥,而基因型檢測法結(jié)果為敏感,測序未檢測到突變;而11株表型檢測法為敏感,而基因型檢測法結(jié)果為耐藥,對其測序發(fā)現(xiàn),有9株發(fā)生rrs基因517位點的C→T突變,1株發(fā)生rrs基因907位點的A→T突變,1株發(fā)生rpsL43耐藥密碼子的AAG→AGG突變。

    四、菌株耐藥的動態(tài)變化

    14例耐多藥結(jié)核病患者的67株菌株對利福平、異煙肼表型耐藥穩(wěn)定,沒有動態(tài)改變,呈持續(xù)耐藥;基因型耐藥檢測顯示也相對穩(wěn)定,僅有1例患者的結(jié)核分枝桿菌菌株發(fā)生動態(tài)變化,該例患者的結(jié)核分枝桿菌菌株在治療前基因型檢測是耐藥,而治療后基因型檢測是1株對利福平、2株對異煙肼敏感但無突變。然而對乙胺丁醇、鏈霉素的表型和基因型耐藥檢測提示均不穩(wěn)定,其耐藥性可能會發(fā)生改變。其中乙胺丁醇表型檢測顯示:1例患者出現(xiàn)復(fù)敏,1例出現(xiàn)繼發(fā)耐藥,1例出現(xiàn)復(fù)敏后再次繼發(fā)耐藥;基因型檢測有1例發(fā)生動態(tài)變化,從耐藥基因有突變到無突變又再次突變。鏈霉素的表型耐藥檢測2例出現(xiàn)繼發(fā)耐藥,1例出現(xiàn)復(fù)敏;基因型檢測發(fā)現(xiàn)有3例發(fā)生動態(tài)變化,其中2例耐藥基因從無突變到突變。

    五、菌株發(fā)生耐藥動態(tài)變化的臨床病例分析

    在治療過程中,14例耐多藥結(jié)核病患者的耐藥基因發(fā)生動態(tài)變化,主要集中在3例患者的38株。臨床共同特點是:復(fù)治多年、肺部病灶廣泛(病灶范圍≥3個肺葉)、伴有1個以上空洞或肺葉毀損。臨床治療方案是:對氨基水楊酸異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星或莫西沙星、阿米卡星靜脈滴注6個月。

    討 論

    隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)造成結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機制與基因突變有關(guān)。不同的基因突變使感染人體的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的藥物耐受性。實時熒光PCR技術(shù)將擴增和檢測兩步驟合一,具有實時擴增實時檢測、高效、快捷、簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點,可以同時對結(jié)核分枝桿菌耐藥多個相關(guān)基因突變同時進行檢測,特別適用于大批量篩查[12-15]。

    因此,筆者應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線法,根據(jù)靶序列熔點變化,實時PCR檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐藥相關(guān)突變位點變化,以分析耐藥情況。對67株耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株進行4種一線抗結(jié)核藥物耐藥基因型檢測,和傳統(tǒng)的表型檢測金標準相比較,結(jié)果表明利福平和異煙肼的表型和基因型檢測具有較高的一致性,分別達99%和97%,而乙胺丁醇和鏈霉素的表型和基因型檢測一致性相對偏低。對2種檢測方法不一致的菌株進行乙胺丁醇和鏈霉素的基因測序,進一步探索其他基因或基因區(qū)引起的突變,發(fā)現(xiàn)對藥敏試驗結(jié)果為耐藥但用熒光定量PCR探針熔解曲線法結(jié)果為敏感的菌株進行基因測序,未檢測到基因突變;對藥敏試驗結(jié)果為敏感但用熒光定量PCR探針熔解曲線法結(jié)果為耐藥的菌株進行基因測序,乙胺丁醇存在embB306、406基因位點突變,鏈霉素存在rrs基因517、907位點和rpsL43耐藥密碼子的點突變,這些突變位點均是既往已經(jīng)報道過的[16-17],沒有發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點。

    分析2種檢測方法不一致的原因可能如下:(1)耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株對乙胺丁醇和鏈霉素的表型耐藥動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn):存在不穩(wěn)定性,可能會發(fā)生動態(tài)變化[1-2]。(2)表型檢測試驗結(jié)果雖然是當前檢測耐藥的金標準,但仍存在局限性;(3)本試驗的耐藥突變檢測,只篩選核酸序列而不是氨基酸序列。因此,有可能不引起氨基酸改變的突變(沉默突變)也會被判為突變型。(4)如檢測樣品出現(xiàn)不均一耐藥菌株,耐藥菌株的比例偏低,需要結(jié)合熔解曲線峰型具體判斷突變比例,有可能出現(xiàn)假陰性,而判定為敏感無突變。(5)可能是與新的耐藥機制有關(guān),如已知耐藥基因以外的其他基因突變和外排泵機制等,也可能存在異質(zhì)性耐藥或外源性再感染、混合感染以及藥敏試驗結(jié)果誤差等[5-6,18],仍需要擴大基因庫及進一步研究。

    另外,對耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株在治療過程中對4種抗結(jié)核藥物的耐藥性的動態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn),不管用表型還是基因型檢測,利福平和異煙肼的耐藥性都很少發(fā)生改變;但是乙胺丁醇和鏈霉素均顯示相對不穩(wěn)定,說明在治療過程中對乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性可能會發(fā)生改變。因此,在臨床治療過程中,筆者建議要對乙胺丁醇和鏈霉素進行動態(tài)的耐藥檢測,以便及時調(diào)整治療方案。

    總之,本研究用熒光定量PCR探針熔解曲線法,實時檢測結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐一線抗結(jié)核藥相關(guān)突變位點變化,以判斷是否耐藥;并和傳統(tǒng)的藥敏試驗結(jié)果檢測進行對比,發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌株對利福平、異煙肼的基因檢測與藥敏試驗結(jié)果、測序結(jié)果具有較高的一致性。對不一致的菌株再次進行基因測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測為敏感的菌株未檢測到基因突變;而用熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測為耐藥的菌株確實存在基因位點突變,但突變位點均是已經(jīng)報道過的,在待檢的菌株中沒有發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點。耐藥基因檢測的優(yōu)勢在于快速了解耐藥基因位點突變,篩查耐多藥肺結(jié)核,并在治療中進行動態(tài)監(jiān)測,及時了解患者耐藥信息和突變位點的變化,精確尋找到耐藥的原因并指導(dǎo)調(diào)整有效的治療方案,為精準個體化醫(yī)療奠定基礎(chǔ),有利于結(jié)核病的控制和阻斷耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播,具有較大的社會經(jīng)濟效益,值得臨床推廣。然而,本研究只檢測了67份藥敏試驗結(jié)果證實的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株標本,樣本量偏少,且沒有檢測敏感結(jié)核分枝桿菌菌株、明確有無外源性再感染、混合感染或異質(zhì)性耐藥等,還存在一定局限性。

    [1] 張俠,胡春梅,王生偉,等. 耐藥肺結(jié)核194例的耐藥譜變化. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2010,33(2):145-146.

    [2] 胡春梅,張俠,李敏, 等.165例耐多藥肺結(jié)核病人治療前后耐藥譜的變化分析.臨床肺科雜志,2009,14(12):1620-1621.

    [3] World Health Organization.Treatment of tuberculosis:guidelines.Geneva: World Health Organization,2010.

    [4] 朱長太,胡忠義.結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測技術(shù)進展.中華結(jié)核和呼吸雜志,2012,34(10):768-770.

    [5] Maruri F,Sterling TR,Kaiga AW,et al.A systematic review of gyrase mutations associated with fluoroquinolone-ResistantMycobacteriumtuberculosisand a proposed gyrase numbering system .J Antimicrob Chemother,2012,67(4):819-831.

    [6] Hofmann-Thiel S,van Ingen J,Feldmann K,et al.Mechanisms of hetero-resistance to isoniazid and rifampin ofMycobacteriumtuberculosisin Tashkent,Uzbekistan.Eur Respir J,2009,33(2):368-374.

    [7] 中國防癆協(xié)會. 耐藥結(jié)核病化學治療指南(2015). 中國防癆雜志, 2015, 37(5):421-469.

    [8] 施旭東,劉正華,吳曉淵,等. 分枝桿菌菌種快速熒光初步鑒定方法的研究.中國防癆雜志, 2004, 26(5):295-297.

    [9] 趙雁林,王黎霞,成詩明,等. 結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:29-35.

    [10] 中國防癆協(xié)會. 結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程. 中國防癆雜志,1996,18(1): 28-31.

    [11] World Health Organization. Global Working Group on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance. Guideline for surveillance of drug resistance in tuberculosis.Geneva: World Health Organization,1997.

    [12] García de Viedma D, del Sol Díaz Infantes M, Lasala F, et al.New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations inMycobacteriurmtuberculosis.J Clin Microbiol,2002,40(3):988-995.

    [13] Bainomugisa A, Wampande E, Muchwa C, et al. Use of real time polymerase chain reaction for detection ofM.tuberculosis,M.aviumandM.kansasiifrom clinical specimens. BMC Infect Dis,2015, 15:181.

    [14] Wang HY, Kim H, Kim S, et al. Performance of a real-time PCR assay for the rapid identification of Mycobacterium species. J Microbiol,2015, 53(1):38-46.

    [15] Hu S, Li G, Li H, et al.Rapid detection of isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates by use of real-time-PCR-based melting curve analysis.J Clin Microbiol,2014, 52(5):1644-1652.

    [16] Hillemann D, Ru¨sch-Gerdes S, Richter E. Feasibility of the genotype MTBDRsl assay for fluoroquinolone, amikacin-capreomycin, and ethambutol resistance testing ofMycobacteriumtuberculosisstrains and clinical specimens. J Clinic Microbiol,2009,47(6):1767-1772.

    [17] Cuevas-Córdobaa B, Cuellar-Sánchezc A, Pasissi-Crivellic A, et al.rrsandrpsLmutations in streptomycin-resistant isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Mexico. J Microbiol Immuno and Infect, 2013,46(1):30-34.

    [18] da Silva PE,Von Groll A,Martin A,et al.Efflux as a mechanism for drug resistance inMycobacteriumtuberculosis.FEMS Immunol Med Microbiol,2011,63(1):1-9.

    (本文編輯:王然 李敬文)

    Fluorescence quantitative PCR probe melting curve method in detection of drug resistance genes in

    MycobacteriumtuberculosisHUChun-mei,GUOJing,YANHong,SHIXu-dong,ZHANGXia.

    DepartmentofTuberculosis,NanjingChestHospital,Jiangsu,Nanjing210029,China

    s:ZHANGXia,Email:zhangxia365@sina.com

    Objective By fluorescence quantitative PCR probe melting curve method, to detect the resistance mutations of multidrug-resistant tuberculosis clinical isolates to first-line anti-tuberculosis drug, and to provide re-ference for multidrug-resistant tuberculosis treatment. Methods Collecting sputum of all TB patients visiting Nanjing chest hospital between January 1, 2009 and December 31, 2012, 3-5 ml per person, did culture and identification ofMycobacteriumtuberculosisand drug sensitivity test. Sixty seven strains ofMycobacteriumtuberculosiswere isolated. According to the target sequence changes in melting point, to test Rifampicin, Isoniazid, Ethambutol, and Streptomycin resistance by fluorescence quantitative PCR probe melting curve method. By comparison with the conventional susceptibility testing, to analyze the inconsistency of strain genome sequencing of 2 kinds of methods and explore the site differences in mutation, and observe the changes in treatment. Results The phenotypic and genotypic characteristics of the strains resisting to Rifampicin and Isoniazid had a high consistency, which was 99% (66/67) and 97% (65/67), respectively. Testing different strains were phenotypic resistance but genotypic sensitive, which was not detected by sequencing mutation. However, the consistency between the phenotype and genotype of anti-ethambutol and streptomycin strains was 60% (40/67) and 75% (50/67), respectively. Sequencing found Ethambutol mutation occurred in theembB306 andembB406 sites. Streptomycin gene mutations occurred inrrs517,rrs907 andrpsL43. Conclusion The application of the fluorescence quantitative PCR probe melting curve can rapidly screenMycobacteriumtuberculosisdrug resistance to first-line anti-tuberculosis drugs.

    Probe melting curve method; Tuberculosis, pulmonary; Drug resistance, multiple, bacterial; Genetic mutations; Genotype analysis

    10.3969/j.issn.1000-6621.2016.01.009

    南京市醫(yī)學科技發(fā)展重點項目(ZKX12035)

    210029 江蘇省南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科(胡春梅、郭晶、張俠),檢驗科(嚴虹、施旭東)

    張俠,Email:zhangxia365@sina.com

    2015-06-15)

    猜你喜歡
    乙胺丁醇表型
    泛硫乙胺的合成
    云南化工(2021年2期)2021-05-06 01:06:20
    建蘭、寒蘭花表型分析
    GABABR2基因遺傳變異與肥胖及代謝相關(guān)表型的關(guān)系
    結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇分子機制的研究進展
    慢性乙型肝炎患者HBV基因表型與血清學測定的臨床意義
    72例老年急性白血病免疫表型分析
    低溫濃醪發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇新工藝研究
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:24
    纖維素發(fā)酵制丁醇獲專利
    乙胺碘呋酮治療血液透析患者心律失常療效觀察
    日本開發(fā)生物丁醇節(jié)能的膜分離新技術(shù)
    最黄视频免费看| 精品视频人人做人人爽| 人妻系列 视频| 日韩欧美精品免费久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 美女福利国产在线 | tube8黄色片| 欧美高清成人免费视频www| 美女中出高潮动态图| 国产 一区 欧美 日韩| 涩涩av久久男人的天堂| 久久精品国产a三级三级三级| 精品亚洲成国产av| 久久久久久人妻| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 99热这里只有精品一区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日日啪夜夜撸| 色婷婷av一区二区三区视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩强制内射视频| 亚洲国产最新在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 欧美性感艳星| 久久久色成人| h视频一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 男人狂女人下面高潮的视频| 人妻一区二区av| 国产黄色免费在线视频| 久久ye,这里只有精品| 色视频在线一区二区三区| 观看美女的网站| 国精品久久久久久国模美| 国产视频首页在线观看| 国产成人精品婷婷| 成人特级av手机在线观看| 成人无遮挡网站| av不卡在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 一级黄片播放器| 亚洲人成网站在线播| 黄色欧美视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日本黄大片高清| 成人国产av品久久久| 在线观看av片永久免费下载| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品日本国产第一区| 香蕉精品网在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 中文字幕av成人在线电影| 有码 亚洲区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品亚洲一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产伦在线观看视频一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品一区www在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久国产精品大桥未久av | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品久久久久久av不卡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| av线在线观看网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 男男h啪啪无遮挡| 秋霞在线观看毛片| 国产高清有码在线观看视频| 久久人人爽人人片av| 联通29元200g的流量卡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品福利在线免费观看| 国产精品成人在线| 精品国产三级普通话版| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久99热这里只有精品18| 大片电影免费在线观看免费| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久99热6这里只有精品| 欧美97在线视频| 九九在线视频观看精品| 国产真实伦视频高清在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99热全是精品| 亚洲经典国产精华液单| 日日撸夜夜添| 久久久久网色| 国产毛片在线视频| 我的女老师完整版在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇丰满av| 好男人视频免费观看在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品熟女少妇av免费看| 青春草亚洲视频在线观看| 国产乱来视频区| 亚洲在久久综合| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产老妇伦熟女老妇高清| av视频免费观看在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 黄色怎么调成土黄色| 午夜精品国产一区二区电影| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品久久久久久久久av| 如何舔出高潮| 色网站视频免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲色图av天堂| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品日本国产第一区| 国产成人午夜福利电影在线观看| av在线观看视频网站免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | av网站免费在线观看视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看日本二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品欧美亚洲77777| 国产亚洲一区二区精品| 九九在线视频观看精品| 舔av片在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美最新免费一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品一区二区免费观看| 青春草国产在线视频| 大香蕉久久网| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 水蜜桃什么品种好| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 婷婷色综合www| 日韩一区二区视频免费看| 国产极品天堂在线| 精品久久久精品久久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 只有这里有精品99| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 91久久精品国产一区二区三区| 久热久热在线精品观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 在线观看三级黄色| 香蕉精品网在线| 高清午夜精品一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 1000部很黄的大片| av卡一久久| 国产免费又黄又爽又色| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲成人手机| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 好男人视频免费观看在线| 秋霞伦理黄片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品一区二区三区视频在线| 黄色配什么色好看| 国产高清国产精品国产三级 | 国产成人精品婷婷| 国产久久久一区二区三区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看一区二区三区激情| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品一区二区三区视频在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品女同一区二区软件| 日韩视频在线欧美| 亚洲美女视频黄频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲经典国产精华液单| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 久久ye,这里只有精品| 高清毛片免费看| av网站免费在线观看视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 另类亚洲欧美激情| 精品久久久久久久久亚洲| 久久青草综合色| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美精品一区二区大全| 久久午夜福利片| 午夜免费观看性视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 天堂俺去俺来也www色官网| .国产精品久久| 国产精品三级大全| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲精品,欧美精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 97超碰精品成人国产| 亚洲综合色惰| 18禁动态无遮挡网站| 国产高潮美女av| 国精品久久久久久国模美| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日韩伦理黄色片| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产日韩欧美在线精品| 欧美精品一区二区免费开放| 水蜜桃什么品种好| 天堂中文最新版在线下载| 日本av手机在线免费观看| 精品久久久噜噜| 观看av在线不卡| 国产淫片久久久久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产男人的电影天堂91| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩中字成人| 超碰97精品在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 精品一区二区免费观看| 中文字幕制服av| 亚洲精品自拍成人| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美人与善性xxx| 大码成人一级视频| 国产乱人偷精品视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产人妻一区二区三区在| 老司机影院毛片| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av福利一区| 晚上一个人看的免费电影| 国产高潮美女av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 高清视频免费观看一区二区| 一级毛片电影观看| 美女中出高潮动态图| 国产精品av视频在线免费观看| 99热6这里只有精品| 熟女电影av网| videossex国产| 99国产精品免费福利视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 亚洲经典国产精华液单| av在线播放精品| 另类亚洲欧美激情| 国产精品三级大全| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品人妻熟女av久视频| 高清视频免费观看一区二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 老女人水多毛片| 永久网站在线| 久久久久视频综合| 日韩 亚洲 欧美在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲四区av| 秋霞伦理黄片| 午夜福利在线在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美人与善性xxx| 99热国产这里只有精品6| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人亚洲欧美一区二区av| 高清日韩中文字幕在线| 少妇 在线观看| www.av在线官网国产| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美国产精品一级二级三级 | 1000部很黄的大片| 国内精品宾馆在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产高清国产精品国产三级 | 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品人妻久久久久久| 日韩av免费高清视频| 精品亚洲成国产av| 色婷婷av一区二区三区视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产一区二区在线观看日韩| 午夜精品国产一区二区电影| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩中字成人| 国产精品蜜桃在线观看| 最黄视频免费看| 亚洲成人一二三区av| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产高潮美女av| 99久国产av精品国产电影| av天堂中文字幕网| 日韩欧美精品免费久久| 国产熟女欧美一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 九草在线视频观看| 国产高清有码在线观看视频| 国产成人精品福利久久| av卡一久久| 岛国毛片在线播放| 亚洲,一卡二卡三卡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲国产欧美人成| av视频免费观看在线观看| 高清av免费在线| 一个人免费看片子| 日韩中文字幕视频在线看片 | 日韩强制内射视频| 日韩一区二区视频免费看| 高清av免费在线| 精品久久久噜噜| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 日韩成人伦理影院| 18禁在线播放成人免费| 十八禁网站网址无遮挡 | 婷婷色av中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 又大又黄又爽视频免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品伦人一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 欧美高清性xxxxhd video| 看非洲黑人一级黄片| 特大巨黑吊av在线直播| 草草在线视频免费看| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区av电影网| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久久久久久大av| 国产乱人偷精品视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 联通29元200g的流量卡| 成人特级av手机在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 舔av片在线| 亚洲性久久影院| 色视频在线一区二区三区| 国产成人freesex在线| 一区二区三区四区激情视频| 黄色日韩在线| 性色avwww在线观看| 插逼视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 我的老师免费观看完整版| 麻豆成人午夜福利视频| 国产永久视频网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲av在线观看美女高潮| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩大片免费观看网站| 成年女人在线观看亚洲视频| 搡老乐熟女国产| 尾随美女入室| 久久青草综合色| 色综合色国产| 一级毛片我不卡| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 我要看黄色一级片免费的| 精品熟女少妇av免费看| 水蜜桃什么品种好| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类| 黄片wwwwww| 直男gayav资源| 一级毛片 在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 国产成人精品婷婷| 亚洲精品一二三| 日本av手机在线免费观看| 少妇高潮的动态图| 一本久久精品| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美日韩在线观看h| 香蕉精品网在线| 免费观看a级毛片全部| 美女视频免费永久观看网站| 久久久成人免费电影| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 黑人高潮一二区| 秋霞伦理黄片| 视频中文字幕在线观看| 国产精品.久久久| 性色avwww在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产美女午夜福利| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久久人妻| 国产成人免费观看mmmm| av专区在线播放| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 不卡视频在线观看欧美| 午夜老司机福利剧场| av在线蜜桃| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品无大码| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品午夜福利在线看| 赤兔流量卡办理| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 最近手机中文字幕大全| av网站免费在线观看视频| 青春草国产在线视频| 欧美bdsm另类| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久国产一区二区| 联通29元200g的流量卡| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产精品国产精品| 观看av在线不卡| 51国产日韩欧美| 欧美区成人在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 日日啪夜夜爽| 日本免费在线观看一区| av国产精品久久久久影院| 国产伦在线观看视频一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 黄色配什么色好看| av不卡在线播放| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲第一av免费看| 欧美一区二区亚洲| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品一区www在线观看| 欧美日韩在线观看h| 国产乱人偷精品视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲欧洲国产日韩| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品女同一区二区软件| 大陆偷拍与自拍| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产91av在线免费观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久久久久九九精品二区国产| 超碰97精品在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 男人舔奶头视频| 一级av片app| av免费在线看不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 美女福利国产在线 | 亚洲国产最新在线播放| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美高清性xxxxhd video| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费看光身美女| 午夜福利视频精品| 免费av不卡在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 美女福利国产在线 | 黄色日韩在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 岛国毛片在线播放| av国产久精品久网站免费入址| 欧美日韩综合久久久久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 视频中文字幕在线观看| 欧美日本视频| 国精品久久久久久国模美| 99精国产麻豆久久婷婷| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲欧美精品自产自拍| 人妻少妇偷人精品九色| 在线观看免费日韩欧美大片 | 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲性久久影院| 嫩草影院新地址| 一个人看视频在线观看www免费| 久久97久久精品| 免费看光身美女| 免费观看无遮挡的男女| 女人久久www免费人成看片| 美女福利国产在线 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一级a做视频免费观看| a级一级毛片免费在线观看| av一本久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 丰满迷人的少妇在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 久久97久久精品| 老司机影院毛片| 女性被躁到高潮视频| 男女边摸边吃奶| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 久久久久久久大尺度免费视频| 日本wwww免费看| tube8黄色片| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 成人漫画全彩无遮挡| 国产欧美亚洲国产| 成人无遮挡网站| 全区人妻精品视频| av女优亚洲男人天堂| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久热久热在线精品观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产淫语在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产毛片在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 在线免费十八禁| 一区二区三区精品91| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲,一卡二卡三卡| 色网站视频免费| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久热精品热| 在线免费十八禁| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中国国产av一级| 少妇高潮的动态图| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲精品456在线播放app| 黑人高潮一二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 六月丁香七月| 少妇高潮的动态图| 久久国内精品自在自线图片| 2022亚洲国产成人精品| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| www.色视频.com| h视频一区二区三区| 中文欧美无线码| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 一级a做视频免费观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一级毛片我不卡| 亚洲精品亚洲一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清黄色对白视频在线免费看 | 18禁动态无遮挡网站| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品久久精品一区二区三区| 最近中文字幕2019免费版| 国产片特级美女逼逼视频| av播播在线观看一区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 大片电影免费在线观看免费| 尾随美女入室| 99久久综合免费| av在线蜜桃| 妹子高潮喷水视频| 一区二区av电影网| 精品一区二区三卡| 国产综合精华液| 久久久久久久久久久免费av| 五月天丁香电影| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区|