腎病綜合征患兒EB病毒和淋巴細胞亞群變化及其與病情進展的關系

［摘 要］目的 觀察腎病綜合征（NS）患兒EB病毒（EBV）和淋巴細胞亞群變化，并分析兩者與病情進展的關系。方法 選取2020年8月至2022年8月安徽省兒童醫(yī)院收治的NS患兒79例納入NS組，另選取同期于本院體檢的健康兒童79例納入對照組。比較對照組、NS組EBV-脫氧核糖核酸（DNA）載量與淋巴細胞亞群變化；用Pearson相關性分析法分析NS組EBV-DNA載量與淋巴細胞亞群的相關性；根據激素敏感情況將NS患兒分為敏感組、抵抗組，根據是否復發(fā)將患兒分為未復發(fā)組、復發(fā)組、頻繁復發(fā)組，比較各組EBV-DNA載量與淋巴細胞亞群變化。結果 與對照組相比，NS組EBV-DNA、EBV抗體衣殼抗原免疫球蛋白M抗體（VCA-IgM）、衣殼抗原免疫球蛋白G抗體（VCA-IgG）陽性率，以及EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比升高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值降低，差異均有統計學意義（χ2/t值介于4.674～28.535之間，P＜0.05）；Pearson相關性分析法顯示，NS組EBV-DNA載量與CD8⁺T淋巴細胞構成比表現為正相關性（r=0.595，P＜0.05），與CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值表現為負相關性（r值分別為-0.642、-0.557、-0.657，P＜0.05）；與敏感組比較，抵抗組EBV-DNA、抗VCA-IgM、抗VCA-IgG陽性率，以及EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比升高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值降低，差異均有統計學意義（χ2/t值介于2.194～6.254之間，P＜0.05）；未復發(fā)組、復發(fā)組、頻繁復發(fā)組的EBV-DNA、抗VCA-IgM、抗VCA-IgG陽性率，以及EBV-DNA載量、CD8⁺ T淋巴細胞構成比依次升高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值依次降低，差異均有統計學意義（χ2/F值介于7.595～31.882之間，P＜0.05）。結論 EBV感染、淋巴細胞亞群變化與腎病綜合征發(fā)生及病情進展密切相關，且兩者具有顯著相關性。

［關鍵詞］腎病綜合征；兒童；EB病毒；淋巴細胞亞群；復發(fā)

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2025.03.011

［中圖分類號］R179""" ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2025）03-0072-07

Changes in Epstein-Barr virus infection and lymphocyte subsets in children

with nephrotic syndrome and their associations with disease progression

CHEN Yuting，ZHANG Shihai，ZHANG Chenyu，YUAN Chunyan

（Department of Clinical Laboratory，Anhui Provincial Children’s Hospital，Anhui Hefei 230001，China）

［Abstract］ Objective To investigate changes in Epstein-Barr virus （EBV） infection and lymphocyte subsets in children with nephrotic syndrome （NS），and to analyze associations of EBV load and lymphocyte subsets with disease progression. Methods A total of 79 children with NS who admitted to Anhui Provincial Children’s Hospital from August 2020 to August 2022 were enrolled in NS group，and 79 age-matched healthy children who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as controls.The changes in EBV-deoxyribonucleic acid （DNA） load and lymphocyte subsets （CD3+，CD4+，CD4+T cells，and CD4+/CD4+ ratio） were compared between the two groups.Pearson correlation analysis was used to analyze association between EBV-DNA load and lymphocyte subsets in the NS group.The patients were further stratified according to steroid sensitivity （steroid-sensitive group and steroid-resistant group） and relapse status （non-relapse group，relapse group and frequent relapse group） for subgroup comparisons. Results Compared with the control group，the positive rates of EBV-DNA，EBV antibody capsid antigen immunoglobulin M antibody （VCA-IgM） and EBV capsid antigen immunoglobulin G antibody （VCA-IgG），EBV-DNA load and CD8⁺T lymphocyte constituent ratio in the NS group elevated，while CD3⁺，CD4⁺T lymphocyte constituent ratio and CD4⁺/CD8⁺ ratio descended，and the differences were statistically significant （χ2/t value ranged from 4.674 to 28.535，all Plt;0.05）.Pearson correlation analysis showed that in the NS group EBV-DNA load was positively correlated with CD4+T lymphocyte constituent ratio （r=0.595，Plt;0.05），while negatively correlated with CD3+，CD4+T lymphocyte constituent ratios and CD4+/CD4+ ratio （r＝-0.642，-0.557 and -0.657 respectively，all Plt;0.05）.Compared with the steroid sensitive group，the positive rates of EBV-DNA，anti-VCA-IgM and anti-VCA-IgG，EBV-DNA load and CD4+T lymphocyte constituent ratio increased in the steroid resistant group，while the CD3⁺，CD4⁺T lymphocyte constituent ratios and CD4+/CD4+ ratio decreased，and the differences was statistically significant （χ2/t value ranged from 2.194 to 6.254，all Plt;0.05）.The positive rates of EBV-DNA，anti-VCA-IgM and anti-VCA-IgG，EBV-DNA load and CD4+T lymphocyte constituent ratio increased successively in the non-relapse group，the relapse group and the frequent relapse group，while the CD3⁺，CD4⁺T lymphocyte constituent ratios and CD4⁺/CD8⁺ ratio decreased successively，and the differences were statistically significant （χ2/F value ranged from 7.595 to 31.882，all Plt;0.05）. Conclusion EBV infection and lymphocyte subsets dysregulation are closely associated with pathogenesis and progression of NS，and there is a significant correlation between the two.

［Key words］ nephrotic syndrome;children;EB virus;lymphocyte subset;relapse

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是一組臨床常見的癥候群，影響全球超過10%的人口，也是兒童期最常見的腎臟疾病，其發(fā)病率在兒童中為2/10萬～7/10萬，以2～6歲兒童多見^［1］。目前NS的治療主要依賴于激素和免疫抑制劑，但有部分患兒對激素不敏感或反復復發(fā)，導致預后不良^［2］。因此，探討NS的發(fā)病機制和治療靶點具有重要的臨床意義。EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一種能引起多種免疫相關疾病的病原體，包括傳染性單核細胞增多癥、淋巴增生性疾病、自身免疫性疾病等，其通過感染B淋巴細胞和上皮細胞，在宿主體內建立潛伏感染，在宿主免疫功能低下或受到刺激時被激活^［3］。近年來，有研究發(fā)現NS患兒EBV感染率高于正常兒童，且EBV治療藥物利妥昔單抗對于NS患兒臨床癥狀緩解的長期療效較好，提示EBV可能與NS發(fā)生及發(fā)展有關^［4］。淋巴細胞亞群是指具有不同表面標志物和功能的淋巴細胞分類，主要包括T淋巴細胞、B細胞和NK細胞等，其數量和比例可反映機體的免疫狀態(tài)和功能，已被證實與多種腎臟疾病有關^［5-7］。但目前鮮有關于NS患兒EB病毒、淋巴細胞亞群變化與病情進展的關系研究，以及兩者相關性的研究。因此，本研究選取79例NS患兒作為研究對象進行分析，以期為NS的診療提供參考，現報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象

選取2020年8月至2022年8月安徽省兒童醫(yī)院收治的79例NS患兒為研究對象（NS組），其中男51例，女28例；年齡2～13歲，平均（6.11±2.05）歲。納入標準：①符合《兒童激素敏感、復發(fā)/依賴腎病綜合征診治循證指南（2016）》中NS診斷標準^［8］，即尿蛋白定性多在+++或24h尿蛋白定量檢查≥50mg/kg；血漿白蛋白≤25g/L；血漿總膽固醇gt;5.7mmol/L；眼瞼出現水腫，以后逐漸遍及全身，呈凹陷性，嚴重者可有腹腔積液或胸腔積液。其中大量蛋白尿、低蛋白血癥為診斷的必備條件；②年齡2～14歲；③首次發(fā)病或復發(fā)后未接受過治療。排除標準：①合并其他腎臟疾??；②有糖尿病、高血壓、心臟病等其他慢性病史；③有其他病毒感染或其他感染性疾病史，如乙型肝炎、艾滋病、結核等；④合并先天性免疫缺陷、自身免疫性疾病等免疫缺陷；⑤有使用免疫抑制劑或其他影響免疫功能的藥物史，如環(huán)孢素、甲氨蝶呤、潑尼松等；⑥合并嚴重心肺功能不全或其他器官功能不全；⑦存在其他影響淋巴細胞亞群檢測的因素；⑧有精神障礙或無法配合檢查和治療。另選取同期于本院體檢的健康兒童79例為對照組，其中男49例，女30例；年齡2～13歲，平均（6.08±1.96）歲。對照組均無腎臟病家族史或腎病病史，近1個月未使用免疫制劑。兩組家屬均簽署書面知情協議書，院倫理委員會批準本研究進行（審批號：EYLL-2023-016）。

1.2研究方法

1.2.1血液EBV DNA水平檢測

每位受試者在空腹狀態(tài)下，采集5mL肘靜脈全血，置于含抗凝劑的試管中，分成兩部分，一部分置于4℃冷藏保存，另一部分離心10min，分離出血清、血漿和血細胞，將血清、血漿分裝于1.5mL離心管中，凍存于-80℃?zhèn)溆茫粚⒀毎昧姿猁}緩沖液洗滌兩次，調整細胞濃度為每毫升1×10⁶個，用于流式細胞術檢測淋巴細胞亞群。

使用實時熒光定量PCR法檢測EBV-DNA載量，按照DNA提取試劑盒的說明書對全血進行DNA提取，得到純化的DNA樣品，用純水稀釋至一定濃度；將DNA樣品按照PCR試劑盒的說明書進行擴增，使用特異性引物對EBV基因進行擴增，得到擴增產物，并根據試劑盒提供的標準曲線計算結果，獲取EBV-DNA載量，根據參考范圍判斷陽性或陰性。EBV-DNA載量≥2.5 logIU/mL表示EBV活動性感染，EBV-DNA載量＜2.5 logIU/mL表示潛伏感染，EBV-DNA載量為0表示無EBV感染。

1.2.2血清EBV抗體水平檢測

采用酶聯免疫吸附法檢測血清中EBV抗體衣殼抗原免疫球蛋白M抗體（viral capsid antigen immunoglobulin M，VCA-IgM）、衣殼抗原免疫球蛋白G抗體（viral capsid antigen immunoglobulin G，VCA-IgG）水平。按照試劑盒的說明書操作，將血清樣本和對照品加入到預先包被有相應抗原的微孔板中，孵育1h，洗滌后加入生物素標記的二抗，孵育30min；洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，孵育30min；洗滌后加入底物3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺，反應15min，加入終止液停止反應，用酶標儀在450nm波長下讀取吸光度值。根據對照品的吸光度值計算出陽性和陰性切點值，根據樣本的吸光度值判斷其陽性或陰性。VCA-IgM陽性表示急性EBV感染，VCA-IgM陰性而VCA-IgG陽性表示既往EBV感染，VCA-IgM和VCA-IgG均陰性表示無EBV感染。

1.2.3淋巴細胞亞群檢測

取患兒靜脈血，加入抗CD3、CD4、CD8單克隆抗體，遮光孵育30min，離心棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌，1%多聚甲醛定容，300目細胞濾網過濾，4℃遮光保存，以陰性對照管設門，以多參數流式細胞術測定CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T淋巴細胞水平，計算CD4^＋/CD8^＋比值。

1.3療效及復發(fā)判斷標準

1.3.1激素敏感性

足量潑尼松按照體表面積每m²每天使用劑量60mg或2mg·kg^-1·d^-1治療≤4周，尿蛋白轉陰，為激素敏感，納入敏感組；足量潑尼松＞4周尿蛋白仍為陽性，為激素抵抗，納入抵抗組^［9］。

1.3.2復發(fā)判斷標準

連續(xù)3天晨尿蛋白從陰性轉為+++或++++，或24h尿蛋白定量≥50mg/kg，或尿蛋白/肌酐≥2.0，為復發(fā)，納入復發(fā)組；6個月內復發(fā)≥2次，或1年內復發(fā)≥3次，為頻繁復發(fā)，納入頻繁復發(fā)組^［9］。所有受試者均隨訪一年。

1.4統計學方法

采用SPSS 25.0軟件分析數據。計數資料以例數（n）和百分比（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（x-±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析檢驗，兩兩比較用LSD-t檢驗；用Pearson相關性分析法分析NS組EBV-DNA載量與淋巴細胞亞群的相關性。P＜0.05差異有統計學意義。

2結果

2.1對照組、NS組EBV相關指標與淋巴細胞亞群比較

與對照組比較，NS組EBV-DNA、抗VCA-IgM、抗VCA-IgG陽性率，以及EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比升高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值降低，差異均有統計學意義（χ2/t值介于4.674～28.535之間，P＜0.05），見表1。

2.2 NS組EBV-DNA載量與淋巴細胞亞群的相關性

Pearson相關性分析法顯示，NS組EBV-DNA載量與CD8⁺T淋巴細胞構成比表現為正相關性（r=0.595，P＜0.05），與CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值表現為負相關性（r值分別為-0.642、-0.557、-0.657，P＜0.05），見表2及圖1～4。

2.3敏感組、抵抗組EBV相關指標與淋巴細胞亞群比較

與敏感組比較，抵抗組EBV-DNA、抗VCA-IgM、抗VCA-IgG陽性率，以及EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比升高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值降低，差異均有統計學意義（χ2/t值介于2.194～6.254之間，P＜0.05），見表3。

2.4未復發(fā)組、復發(fā)組、頻繁復發(fā)組EBV相關指標與淋巴細胞亞群比較

未復發(fā)組、復發(fā)組、頻繁復發(fā)組的EBV-DNA、抗VCA-IgM、抗VCA-IgG陽性率，以及EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比依次升高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值依次降低，差異均有統計學意義（χ2/F值介于7.595～31.882之間，P＜0.05），見表4。

3討論

3.1 NS的發(fā)病機制

目前，關于NS的發(fā)病機制尚不明確，多認為與腎臟自身炎癥反應、血液動力學改變、腎小球濾過膜的電荷屏障改變、T淋巴細胞免疫紊亂及基因突變等因素有關，腎小球濾過膜損傷后腎小球通透性增加，導致大量白蛋白從尿液中丟失，血漿膠體滲透壓降低，水分自血管內向組織間隙轉移，形成水腫^［9］。兒童由于免疫系統尚未發(fā)育完善，易發(fā)生各種感染，其中EBV是一種較為常見的病原體。EBV感染后在B淋巴細胞中建立潛伏感染，并可影響T淋巴細胞、NK細胞等其他免疫細胞的功能^［10］。探究EBV、淋巴細胞亞群在NS患兒中的變化情況對于理解其病理生理過程、提高診療水平具有重要的臨床意義。

3.2 EBV病毒感染、淋巴細胞亞群變化與NS發(fā)生的關系

CD3⁺T淋巴細胞是一種成熟的T淋巴細胞，其表面表達CD3分子，與T淋巴細胞抗原受體形成復合體，參與T淋巴細胞對抗原的識別和信號轉導^［11］。CD4⁺T淋巴細胞是輔助性T淋巴細胞，可分泌多種細胞因子，調節(jié)機體對抗外來抗原和自身抗原的免疫反應;CD8⁺T淋巴細胞是細胞毒性T淋巴細胞，可殺傷被抗原修飾的靶細胞，參與清除感染或腫瘤細胞，兩者比值可反映T淋巴細胞功能狀態(tài)，其降低可能與機體免疫功能低下或失調有關^［12］。本研究結果顯示，NS患兒EBV-DNA、抗VCA-IgM、抗VCA-IgG陽性率，EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比高于健康受試者，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值低于健康受試者，且NS患兒中EBV-DNA載量與CD8⁺T淋巴細胞構成比表現為正相關，與CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值表現為負相關，提示NS患者EB病毒載量增加，淋巴細胞亞群發(fā)生明顯變化，且兩者具有明顯相關性。EBV可感染口腔黏膜上皮細胞和扁桃體淋巴細胞，進入血液循環(huán)后感染外周血B細胞，建立潛伏感染或裂解感染，B細胞經T淋巴細胞誘導后從潛伏感染轉變?yōu)榱呀飧腥荆瑥亩龠MEBV的釋放，刺激機體產生免疫相關性抗體及細胞因子，從而引發(fā)免疫功能紊亂，影響淋巴細胞亞群的數量和比例^［13］。此外，EBV感染所引發(fā)的腎臟損害與病毒直接損害及免疫反應性損傷有關：①直接損害：腎小管上皮細胞表達的CD21抗原簇作為EB病毒特異性受體，被EB病毒吸附結合后通過胞吞作用進入細胞內，感染腎小管上皮細胞，引發(fā)小管上皮細胞退行性變、腎間質大量炎性細胞浸潤及水腫；②免疫反應性損傷：形成循環(huán)免疫復合物在腎小球系膜區(qū)沉積，形成免疫復合物損傷。NS患兒常伴有淋巴細胞亞群失衡的現象，出現T淋巴細胞和B細胞分化、增殖、活化和分泌功能的異常，這些異?？赡軐е聶C體對抗原的免疫調節(jié)能力降低，從而引起腎小球濾過膜的損傷。EBV感染可能加重NS患兒的免疫功能紊亂。有研究發(fā)現，NS患兒在EBV感染后，其外周血中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴細胞和NK細胞的數量和比例均發(fā)生變化，與正常對照組相比有顯著差異，提示EBV感染可能通過影響淋巴細胞亞群的平衡而參與NS發(fā)生^［14］。

3.3 EBV病毒感染、淋巴細胞亞群變化與NS病情進展的關系

本研究根據激素敏感情況將NS患兒分為敏感組、抵抗組，根據是否復發(fā)將患兒分為未復發(fā)組、復發(fā)組、頻繁復發(fā)組，結果顯示在激素抵抗患兒、復發(fā)患兒中EBV-DNA載量、CD8⁺T淋巴細胞構成比更高，CD3⁺、CD4⁺T淋巴細胞構成比及CD4⁺/CD8⁺比值更低，提示EBV病毒感染、淋巴細胞亞群變化與NS病情進展有密切關聯。EBV感染可能是導致NS患兒復發(fā)或難治性的原因之一。EBV感染和淋巴細胞亞群失衡可相互作用，形成惡性循環(huán)，共同促進NS進展，并增加腎小球基底膜上的免疫復合物沉積，導致腎小球損傷和蛋白尿。此外，淋巴細胞亞群失衡可導致免疫調節(jié)紊亂，降低機體對藥物的敏感性和耐受性。腎小球損傷和蛋白尿可進一步刺激EBV的復制和活化，增加淋巴細胞亞群的失衡，加劇腎小球基底膜上的免疫復合物沉積，加重腎小球損傷和蛋白尿。

綜上所述，EBV感染、淋巴細胞亞群變化與NS發(fā)生及病情進展密切相關，且兩者具有明顯相關性。由此可見，抑制EBV病毒活性或調節(jié)淋巴細胞亞群功能可能成為治療NS的新方法。但今后仍需進一步的研究來驗證和深入了解NS患兒EB病毒和淋巴細胞亞群變化與病情進展的關系，以期在臨床實踐中獲得更好的應用。

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［專業(yè)責任編輯：吳紅艷］

［中文編輯：郭樂倩；英文編輯：楊周岐］