• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于邏輯門的鄰位核酸熒光傳感器同時(shí)檢測(cè)凝血酶和肌紅蛋白

    2025-03-15 00:00:00鐘子惠霍冰洋夏凌賀錦燦李攻科
    分析化學(xué) 2025年2期
    關(guān)鍵詞:肌紅蛋白凝血酶

    摘要 基于分裂適配體的靶標(biāo)識(shí)別能力和分子邏輯門的智能分析能力,將兩種分裂適配體整合到“AND”邏輯門中,構(gòu)建了一種新型鄰位核酸熒光傳感器,用于凝血酶(Tob)和肌紅蛋白(Myo)的同時(shí)檢測(cè)。當(dāng)僅存在一種目標(biāo)物時(shí),信號(hào)的響應(yīng)為單一熒光輸出信號(hào),可作為早期低風(fēng)險(xiǎn)判斷的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn);當(dāng)兩種目標(biāo)物同時(shí)存在時(shí),分裂適配體與目標(biāo)物結(jié)合,形成三元復(fù)合物,分別導(dǎo)致首尾的鄰位核酸效應(yīng),同時(shí)觸發(fā)G-四鏈體增強(qiáng)硫磺素T 熒光信號(hào)和Cyanine 3 的熒光信號(hào)猝滅,可作為早期高風(fēng)險(xiǎn)判斷的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。在優(yōu)化條件下, 本方法檢測(cè)Tob 的線性范圍為3~200 nmol/L, 相關(guān)系數(shù)為0.9931, 檢出限(LOD)為0.97 nmol/L;檢測(cè)Myo 的線性范圍為6~400 nmol/L,相關(guān)系數(shù)為0.9933, LOD 為2.14 nmol/L。將本方法應(yīng)用于臨床血清樣本中Tob 和Myo 的同時(shí)測(cè)定,加標(biāo)回收率分別為85.4%~118.3%和85.8%~119.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6.5%。與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果相比,本方法的相對(duì)誤差的范圍為–8.8%~5.6%。此外, 4 例血清樣品的邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)2 例,低風(fēng)險(xiǎn)2 例。本研究提出的“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感方法具有選擇性高、快速、準(zhǔn)確和可同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn),為急性心肌梗死早期診斷提供了重要參考,也為生物標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)提供了一種通用性檢測(cè)設(shè)計(jì)思路和平臺(tái)。

    關(guān)鍵詞 邏輯門;分裂適配體;同時(shí)檢測(cè);凝血酶;肌紅蛋白

    心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成殘疾和死亡率最高的疾病之一,而急性心肌梗死發(fā)病前無(wú)癥狀是心血管疾病死亡率高的原因[1-2]。因此,快速和準(zhǔn)確診斷急性心肌梗死對(duì)于挽救患者生命、提高患者生命質(zhì)量至關(guān)重要。肌紅蛋白(Myoglobin, Myo)是心肌梗死的生物標(biāo)志物,是心肌損傷后首先釋放的蛋白質(zhì),在急性心肌梗死的早期診斷中發(fā)揮了重要作用[3]。凝血酶(Thrombin, Tob)是一種重要的多功能酶,與血管損傷后形成血栓密切相關(guān)[4]。血栓形成可能導(dǎo)致血管閉塞和血流量減少,影響下游器官的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致心肌梗死[5]。因此, Tob 可作為急性心肌梗死早期的輔助診斷標(biāo)志物。大多數(shù)疾病都具有多個(gè)生物標(biāo)志物,對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)不僅可縮短檢測(cè)時(shí)間,而且可更準(zhǔn)確地診斷疾病。因此,構(gòu)建一種快速、準(zhǔn)確和同時(shí)檢測(cè)Myo 和Tob 的生物傳感器具有非常重要的意義。

    目前,文獻(xiàn)中報(bào)道的用于生物標(biāo)志物定量分析的方法主要是免疫分析法。其中,放射免疫分析法靈敏度高、特異性強(qiáng),但存在放射性污染[6];化學(xué)發(fā)光免疫分析法靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短,但成本相對(duì)較高[7];熒光免疫分析法以其良好的選擇性、穩(wěn)定性和靈敏度而備受關(guān)注[8],但是,大部分的熒光免疫分析法只能檢測(cè)單一的生物標(biāo)志物,不能滿足目前的臨床診斷需求,尤其是在心血管疾病早期診斷的準(zhǔn)確性方面尚存在不足。因此,綜合多個(gè)標(biāo)志物的定量分析結(jié)果可以提供更全面的特征信息,有助于早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)識(shí)別心血管疾病,從而提高篩查的有效性和可靠性。

    基于核酸的生物傳感策略通常由識(shí)別、信號(hào)傳輸和信號(hào)轉(zhuǎn)化等多模塊單元組成。適配體是一種單鏈寡核苷酸序列,對(duì)目標(biāo)物具有高選擇性[9]。分裂適配體通常指從一條完整適配體鏈中間的某處截?cái)酁閮蓷l適配體鏈,當(dāng)目標(biāo)物不存在時(shí),兩條鏈單獨(dú)存在;當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí),兩條鏈同時(shí)結(jié)合在目標(biāo)物上,可以呈現(xiàn)與完整適配體類似的構(gòu)象[9-10]。與完整的適配體相比,分裂適配體的長(zhǎng)度更短,二級(jí)結(jié)構(gòu)更少,在傳感中不易產(chǎn)生非特異性信號(hào)[11]。分子邏輯門是通過接收一個(gè)(或多個(gè))化學(xué)過程作為輸入,并產(chǎn)生一個(gè)(或多個(gè))容易檢測(cè)的分析信號(hào)作為輸出來(lái)實(shí)施邏輯運(yùn)算的信號(hào)傳輸策略[12]。分子邏輯門能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分析物,簡(jiǎn)化分析程序,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性,滿足臨床“快速篩查”的需求,在智能生物傳感領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[13-14]。迄今為止,已有電化學(xué)[15-16]、比色[17-18]、熒光[19]和其它類型的分子邏輯門用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分析物的報(bào)道。但是,這些方法通常需要繁瑣的洗滌步驟或復(fù)雜的擴(kuò)增反應(yīng)。鄰位效應(yīng)(Proximity effect)是指目標(biāo)物與兩個(gè)親和配體的結(jié)合使互補(bǔ)的寡核苷酸聚集,從而顯著增加其局部濃度[20-21]。鄰位效應(yīng)已被應(yīng)用于開發(fā)多種生物傳感器,具有快速、選擇性強(qiáng)和免洗滌等優(yōu)點(diǎn)[21]。

    本研究將Tob 和Myo 兩種分裂適配體同時(shí)整合到“AND”邏輯門中,構(gòu)建了一種新型鄰位核酸熒光傳感檢測(cè)技術(shù)。由于Tob 和Myo 分別具有兩個(gè)分裂適配體,將其中一條分裂適配體單元通過poly-A 序列相連,從而將兩種識(shí)別模塊整合到同一個(gè)核酸電路結(jié)構(gòu)中。當(dāng)僅存在一種目標(biāo)物時(shí),信號(hào)的響應(yīng)為單一熒光輸出信號(hào);兩個(gè)目標(biāo)物同時(shí)存在時(shí),分裂適配體與目標(biāo)物結(jié)合,形成三元復(fù)合物,分別導(dǎo)致首尾的鄰位核酸效應(yīng),同時(shí)觸發(fā)G-四鏈體(G4)增強(qiáng)硫磺素T(Thioflavin T, ThT)熒光信號(hào)和Cyanine 3(Cy3)的熒光信號(hào)猝滅?!癆ND”邏輯運(yùn)算能夠同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo,可為急性心肌梗死早期診斷提供重要參考,也為生物標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)提供了一種通用性檢測(cè)平臺(tái)和設(shè)計(jì)思路。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    FA1604 電子天平(上海天平儀器廠);ZWYR-240 恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司);RF-5301PC 熒光分光光度計(jì)(日本島津醫(yī)療器械有限公司);HE-120 Tanon 電泳儀(上海天能生命科學(xué)有限公司);DigiGenius 凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene 公司)。

    ThT 和3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);Tob 和Myo(人源,美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);人凝血酶和肌紅蛋白酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒(96 孔,武漢華美生物工程有限公司);NaCl、CaCl2 和MgCl2(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。HEPES 緩沖溶液(pH 7.0)含20 mmol/L HEPES、1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2 和120 mmol/L NaCl。寡核苷酸(HPLC 純化,上海生工生物科技有限公司)序列(5′→3′)如下:

    P1:BHQ2-ACACCCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTTTTTTTTTTGGGTTGGG/isp9/GGTTGGTG

    P2:TGGTTGG/isp9/GGGTAGGG

    P3:TGCTGCGTTGTTCCGAGTGT-Cy3

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 瓊脂糖凝膠電泳

    分別按邏輯輸入(0, 0)、(1, 0)、(0, 1)和(1, 1)的試劑順序添加寡核苷酸和待測(cè)物溶液,孵育60 min。分別將10 μL 上述溶液與2 μL 6×DNA 上樣緩沖溶液(pH 7.6,含溴酚藍(lán)、乙二胺四乙酸和甘油)混合,室溫孵育10 min,注入2%瓊脂糖凝膠(含Super red 染料),在1×Tris-Acetate-EDTA(TAE, pH 8.0)緩沖溶液中于100 V 恒壓下電泳70 min,采用DigiGenius 凝膠成像系統(tǒng)掃描電泳后的凝膠。

    1.2.2 定量檢測(cè)

    鄰位核酸探針P1、P2 和P3 分別用HEPES 緩沖溶液稀釋成1.5、1.0 和1.0 μmol/L 的工作液。將P1溶液于95 ℃水浴孵育5 min,自然冷卻至室溫。將20 μL P1、20 μL P2、20 μL P3 和10 μL Tob 標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或10 μL Myo 標(biāo)準(zhǔn)溶液、20 μL 40 μmol/L 的ThT 溶液依次加入到0.6 mL 離心管中,加入HEPES 緩沖溶液至溶液總體積為200 μL;渦旋混勻,在37 ℃恒溫?fù)u床中避光孵育60 min。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定溶液的熒光發(fā)射光譜,設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm,狹縫為10 nm。測(cè)量此溶液體系分別在483 和563 nm處的熒光強(qiáng)度(FTob 和FMyo),以相同體積的超純水代替Tob 和Myo 作為空白對(duì)照,并測(cè)定熒光強(qiáng)度(F0)。

    1.2.3 實(shí)際樣品分析

    血液樣本由廣東藥科大學(xué)附屬醫(yī)院提供,相關(guān)研究經(jīng)廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),志愿者知情同意。靜脈取血于無(wú)抗凝劑的采血管中,室溫靜置4 h,待血液完全凝結(jié)后, 1600 g (3700 r/min)離心10 min,將上層血清小心轉(zhuǎn)移至新離心管中, 8000 g (8400 r/min)離心20 min,再將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中,于–20 ℃保存。測(cè)定時(shí),將血清樣品用PBS 緩沖溶液稀釋至合適濃度,按照1.2.2 節(jié)中的方法進(jìn)行定量檢測(cè)。

    作為對(duì)比,血清樣品分別用Tob 和Myo 的商業(yè)ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書進(jìn)行。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 “AND”邏輯門的檢測(cè)原理

    與完整適配體相比,分裂適配體的結(jié)合能力幾乎不受影響[22],其序列較短,適用于設(shè)計(jì)同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志物的新型邏輯門策略。Tob 分裂適配體的解離常數(shù)(Kd)約為100 nmol/L[23], Myo 分裂適配體的Kd≈5 nmol/L[24],表明兩種分裂適配體與目標(biāo)物有較強(qiáng)的親和力。由圖1A 可見, P1 探針由Tob 分裂適配體(紅色)、分裂G4 序列(紫色)以及猝滅劑(BHQ2)標(biāo)記Myo 分裂適配體(藍(lán)色)構(gòu)成。P2 探針由Tob 分裂適配體序列(紅色)和分裂G4 序列(紫色)組成。P3 探針由Cy3 熒光探針(發(fā)射波長(zhǎng):563 nm)標(biāo)記Myo 分裂適配體序列(藍(lán)色)組成。ThT 可與完整的G4 結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合而產(chǎn)生熒光,其最大發(fā)射波長(zhǎng)為483 nm, ThT 和Cy3 兩種熒光報(bào)告分子的最大發(fā)射波長(zhǎng)間隔為80 nm,發(fā)射峰區(qū)分明顯,可用于兩種目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)。

    “AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感器的檢測(cè)原理、邏輯電路和真值表分別如圖1A、圖1B 和圖1C所示。如圖1B 所示,此“AND”邏輯門以Tob 和Myo 濃度為輸入,熒光信號(hào)變化為輸出,以真值“0”(低風(fēng)險(xiǎn))和“1”(高風(fēng)險(xiǎn))表示邏輯判斷。當(dāng)Tob 和Myo 都不存在時(shí),即輸入為(0, 0)時(shí), P1 探針的Tob 分裂適配體和P2 探針的Tob 分裂適配體不結(jié)合, P1 和P2 探針無(wú)法有效結(jié)合形成G4 結(jié)構(gòu),此時(shí)ThT 的熒光值較低。同時(shí), P1 探針與P3 探針同樣距離較遠(yuǎn), Cy3 由于無(wú)法發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET),熒光值較高,此時(shí)輸出為0(低風(fēng)險(xiǎn))。當(dāng)僅存在Tob 時(shí),輸入為(1, 0), P1 探針和P2 探針的Tob 分裂適配體與Tob 緊密結(jié)合,形成三元復(fù)合物,導(dǎo)致末端分裂的G4 序列鄰位效應(yīng),形成G4 結(jié)構(gòu),后者與ThT 結(jié)合,在483 nm 處熒光值增加,此時(shí)輸出也為0(低風(fēng)險(xiǎn))。當(dāng)僅存在Myo 時(shí),輸入為(0, 1), P1 探針和P3 探針的Myo 分裂適配體序列與Myo 形成三元復(fù)合物, Cy3和BHQ2 發(fā)生FRET 使得Cy3 在563 nm 處的熒光值降低,此時(shí)輸出也為0(低風(fēng)險(xiǎn))。當(dāng)Tob 和Myo 同時(shí)存在時(shí),輸入為(1, 1), P1 和P2 探針中的Tob 分裂適配體與Tob 結(jié)合形成G4 結(jié)構(gòu), ThT 在483 nm 處的熒光信號(hào)增強(qiáng);同時(shí), P1 和P3 探針中的Myo 分裂適配體與Myo 結(jié)合,導(dǎo)致Cy3 熒光信號(hào)被猝滅,在563 nm 處的熒光信號(hào)降低,此時(shí)輸出為1(高風(fēng)險(xiǎn)),提示急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)較高。

    2.2 “AND”邏輯門的可行性研究

    研究了“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo 的可行性。熒光發(fā)射光譜圖如圖2A所示,圖2B 是483 和563 nm 處對(duì)應(yīng)的熒光峰值。當(dāng)Tob 和Myo 均不存在時(shí),輸入為(0, 0), 483 nm 處的熒光峰值較低, 563 nm 處熒光峰值較高;僅存在Tob 時(shí),輸入為(1, 0), 483 nm 處的熒光峰值增加,563 nm 處熒光峰值不變;僅存在Myo 時(shí),輸入為(0, 1), 483 nm 處熒光峰值不變, 563 nm 處熒光峰值降低;只有當(dāng)Tob 和Myo 同時(shí)存在時(shí),輸入為(1, 1), 483 nm 處熒光峰值增加, 563 nm 處熒光峰值降低,說明采用此“AND”邏輯門同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo 可行。此外,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證了此“AND”邏輯門策略同時(shí)檢測(cè)的可行性。如圖2C 所示,對(duì)于泳道a,當(dāng)Tob 和Myo 均不存在時(shí),出現(xiàn)3 個(gè)游離的DNA 條帶;對(duì)于泳道b,僅存在Tob 時(shí),出現(xiàn)了P1 和P2 與Tob 的結(jié)合條帶(藍(lán)框);對(duì)于泳道c,僅存在Myo 時(shí),出現(xiàn)了P1 和P3 與Myo 的結(jié)合條帶(黃框);對(duì)于泳道d,當(dāng)Tob 和Myo 同時(shí)存在時(shí),出現(xiàn)了P1、P2、P3、Tob 和Myo 的結(jié)合條帶(綠框)。上述結(jié)果進(jìn)一步說明采用此邏輯門策略同時(shí)檢測(cè)Tob和Myo 可行。

    2.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

    為了獲得最佳的分析性能,優(yōu)化了用于Tob 和Myo 檢測(cè)的適配體濃度和孵育時(shí)間等條件。首先,考察了不同濃度的P1(0.1、0.5、1.0、1.5 和2.0 μmol/L)對(duì)Tob 熒光強(qiáng)度差值(FTob–F0)的影響。如圖3A 所示,隨著P1 濃度增大,分裂適配體與Tob 的結(jié)合增加,形成的G4 增多, G4 與ThT 結(jié)合,熒光信號(hào)增強(qiáng);P1 濃度達(dá)到1.5 μmol/L 時(shí), FTob–F0 最大;隨著P1 濃度繼續(xù)增加, FTob–F0 略降,這可能是空白值增加所致??疾炝朔跤龝r(shí)間(10、20、40、60 和90 min)對(duì)FTob–F0 的影響。如圖3B 所示,隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng),分裂適配體與Tob 的結(jié)合增加, FTob–F0 增大,孵育時(shí)間為60 min 時(shí), FTob–F0 達(dá)到最大,此后基本保持穩(wěn)定。

    考察了P1 與P3 的濃度比(1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1 和3∶1)對(duì)Myo 熒光強(qiáng)度差值(F0–FMyo)的影響。如圖3C 所示,隨著P1 與P3 的濃度比增大,分裂適配體與Myo 的結(jié)合增多,導(dǎo)致Cy3 和BHQ2 發(fā)生的FRET 效應(yīng)增強(qiáng),熒光信號(hào)降低, F0–FMyo 增大;當(dāng)P1 與P3 的濃度比增至1.5∶1, F0–FMyo 變化不大,達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。因此,選擇1.5∶1 作為最佳適配體濃度比??疾炝薖1 和P3 與Myo 反應(yīng)的孵育時(shí)間(10、20、40、60 和90 min)對(duì)F0–FMyo 的影響。如圖3D 所示,隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng), F0–FMyo 增大,在60 min 時(shí)達(dá)到穩(wěn)定,說明反應(yīng)已基本完全。最終確定P1、P2 和P3 探針的最優(yōu)濃度分別為1.5、1.0 和1.0 μmol/L,最優(yōu)孵育時(shí)間為60 min。

    2.4 方法的分析性能

    2.4.1 分析參數(shù)

    在最優(yōu)的反應(yīng)條件下,考察了“AND”邏輯門鄰位核酸熒光傳感方法的分析性能。如圖4A 所示,隨著Tob 濃度增大, 483 nm 處的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。483 nm 處熒光強(qiáng)度與Tob 濃度的關(guān)系如圖4B 所示,在3~200 nmol/L 濃度范圍內(nèi), Tob 濃度與熒光強(qiáng)度的差值呈線性關(guān)系,線性方程為FTob–F0=2.65CTob+3.66,相關(guān)系數(shù)(r)為0.9931,計(jì)算得到檢出限(LOD, S/N=3)為0.97 nmol/L。健康人血液中幾乎不含Tob,在凝血過程中, Tob 的濃度能夠達(dá)到nmol/L 水平[25],因此,此策略能滿足對(duì)Tob 臨床診斷的要求。如圖4A 所示,隨著Myo 濃度增大, 563 nm 處的熒光信號(hào)逐漸降低。熒光強(qiáng)度差值與不同濃度Myo 的關(guān)系如圖4C所示,在6~400 nmol/L 濃度范圍內(nèi), Myo 濃度與熒光差值呈線性關(guān)系,線性方程為F0–FMyo=0.53CMyo+11.49(r=0.9933), LOD 為2.14 nmol/L,明顯低于正常人閾值(36 nmol/L)[26],滿足對(duì)Myo 臨床檢測(cè)的要求。

    2.4.2 選擇性和穩(wěn)定性

    選擇性是評(píng)估分析性能的另一個(gè)關(guān)鍵因素。為了評(píng)價(jià)此傳感器同時(shí)檢測(cè)Tob 和Myo 的選擇性,分別加入100 μmol/L K+、1 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Ca2+、10 μmol/L Fe3+、1 μmol/L血紅蛋白(Hb)、1 mmol/L葡萄糖氧化酶(GO)、1 μmol/L C-反應(yīng)蛋白(CRP)、1 μmol/L溶菌酶(LZM)、1 mmol/L 人血清白蛋白(HSA)、1 mmol/L 免疫球蛋白G(IgG)、50 nmol/L Tob 和100 nmol/L Myo 及其混合物,測(cè)定被測(cè)物加入前后傳感器的熒光峰值變化。如圖5A 所示,共存物質(zhì)K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Hb、GO、CRP、LZM、HSA 和IgG存在時(shí)的熒光強(qiáng)度差值均很低。此外,其混合物的熒光強(qiáng)度差值與Tob 和Myo 的結(jié)果無(wú)顯著差異,說明此傳感方法對(duì)Tob 和Myo 具有良好的選擇性。

    為了進(jìn)一步評(píng)估傳感器的穩(wěn)定性,對(duì)3 個(gè)不同濃度水平(10、50 和100 nmol/L)的Tob 和Myo 進(jìn)行了5 次重復(fù)測(cè)定,結(jié)果如圖5B 所示,此傳感器檢測(cè)Tob 和Myo 的RSDs 分別為4.3%~8.4%和3.2%~7.2%,說明此傳感方法檢測(cè)Tob 和Myo 具有較好的穩(wěn)定性。

    2.5 實(shí)際樣品分析

    為了評(píng)價(jià)建立的方法在實(shí)際樣品中的分析性能,采用此方法同時(shí)檢測(cè)臨床血清中的Tob 和Myo。如表1 所示, 1 號(hào)樣品和2 號(hào)樣品中Tob 濃度為9.68 和10.93 nmol/L,3 號(hào)樣品和4 號(hào)樣品未檢出。1 號(hào)樣品和2 號(hào)樣品中Myo 濃度為50.47 和36.92 nmol/L,超過正常值(36 nmol/L), 3 號(hào)樣品和4 號(hào)樣品未檢出。血清樣品1 和2 中Tob 和Myo 濃度均超過正常閾值,邏輯判斷為1,邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)。樣品3 和4 中Tob 和Myo 濃度均未檢出,邏輯判斷為0,邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死低風(fēng)險(xiǎn)。此外,對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行單一目標(biāo)物的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),測(cè)得Tob 和Myo 的加標(biāo)回收率分別為85.4%~118.3%和85.8%~119.9%, RSD 分別小于5.9%和6.5%。與標(biāo)準(zhǔn)方法ELISA 檢測(cè)Tob 和Myo 的結(jié)果進(jìn)行比較,相對(duì)誤差范圍為–8.8%~5.6%, RSD 小于7.9%,說明本方法的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法ELISA 一致。然而, ELISA方法檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)物的時(shí)間需要180 min,本方法在60 min 內(nèi)即可完成兩個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè),顯著縮短了分析時(shí)間。

    3 結(jié)論

    將Tob 和Myo 兩種分裂適配體同時(shí)整合到“AND”邏輯門中,構(gòu)建了一種新型鄰位核酸熒光傳感方法,用于Tob 和Myo 的同時(shí)檢測(cè)。在優(yōu)化條件下,本方法檢測(cè)Tob 的線性范圍為3~200 nmol/L, LOD 為0.97 nmol/L;檢測(cè)Myo 的線性范圍為6~400 nmol/L, LOD 為2.14 nmol/L。將此傳感器應(yīng)用于臨床血清樣本分析, Tob 和Myo 的回收率分別在85.4%~118.3%和85.8%~119.9%之間, RSD 均小于6.5%。與標(biāo)準(zhǔn)方法ELISA 的測(cè)定結(jié)果相比,相對(duì)誤差范圍為–8.8%~5.6%。4 例血清樣品的邏輯診斷結(jié)果為急性心肌梗死高風(fēng)險(xiǎn)2 例,低風(fēng)險(xiǎn)2 例。此外,此方法能夠在60 min 內(nèi)對(duì)兩種生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè),縮短了分析時(shí)間。此適體傳感器具有選擇性高、穩(wěn)定性好、快速、準(zhǔn)確和可同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),在急性心肌梗死疾病標(biāo)志物的快速檢測(cè)和多重篩查方面具有極大的應(yīng)用潛力。

    References

    [1] REBLLON-SANCHEZ D E, ROBLEDO-COLONIA A, LOPEZ-ERAZO L, CUENCA-VELEZ S, RECIO-GOMEZ M A,BARRERA L. Eur. Heart J. , 2021, 42: 3142.

    [2] O′SULLIVAN J W, RAGHAVAN S, MARQUEZ L C, LUZUM A, DAMRAUER S M, ASHLEY E A, O′DONNELL C J,WILLER C J, NATARAJAN P. Circulation, 2022, 146(8): E93-E118.

    [3] HE S, ZHANG P, SUN J, JI Y, HUANG C, JIA N. Biosens. Bioelectron. , 2022, 201: 113962.

    [4] QURESHI A, LIP G Y H, NORDSLETTEN D A, WILLIAMS S E, ASLANIDI O, DE VECCHI A. Front. Cardiovasc. Med. ,2023, 9: 1074562.

    [5] SUN M, LIU C, LIU J, WEN J, HAO T, CHEN D, SHEN Y. J. Colltrolled Release, 2024, 367: 587-603.

    [6] GREBENCHTCHIKOV N, GEURTS-MOESPOT A J, KROOT J J C, DEN HEIJER M, TJALSMA H, SWINKELS D W,SWEEP F G J. Br. J. Haematol. , 2009, 146(3): 317-325.

    [7] GUO Y L, YUE H, LV C C, MA X H, YANG M, JIN Y, LI B X, LIU W. Anal. Chem. , 2022, 2(95): 1739-1746.

    [8] AFZALINIA A, MIRZAEE M. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2020, 12(14): 16076-16087.

    [9] QI X Y, YAN X C, ZHAO Y L, LI L, WANG S. TrAC, Trends Anal. Chem. , 2020, 133: 116069.

    [10] REN Lin-Jiao, PENG Zheng, MENG Xiao-Long, ZHANG Pei, QIN Zi-Rui, XU Xiao-Ping, XU Peng, JIANG Li-Ying. Chin.J. Anal. Chem. , 2022, 50(3): 405-414.

    任林嬌, 彭政, 孟曉龍, 張培, 秦自瑞, 徐曉萍, 徐鵬, 姜利英. 分析化學(xué), 2022, 50(3): 405-414.

    [11] YUAN B, SUN Y, GUO Q, HUANG J, YANG X, CHEN Y, WEN X, MENG X, LIU J, WANG K. Anal. Chem. , 2017,89(17): 9347-9353.

    [12] LIU S, DING J, QIN W. Anal. Chem. , 2019, 91(4): 3170-3176.

    [13] SHI L, TANG Q, YANG B, LIU W, LI B, YANG C, JIN Y. Anal. Chem. , 2023, 95(14): 6090-6097.

    [14] LI M, YAO B, JING C, CHEN H, ZHANG Y, ZHOU N. Anal. Chim. Acta, 2022, 1198: 339559.

    [15] FENG L, LYU Z, OFFENH?USSER A, MAYER D. Angew. Chem. Int. Ed. , 2015, 54(26): 7693-7697.

    [16] CHEN J, ZENG L. Biosens. Bioelectron. , 2013, 42: 93-99.

    [17] QIN C, GAO Y, WEN W, ZHANG X, WANG S. Biosens. Bioelectron. , 2016, 79: 522-530.

    [18] CHEN J, FANG Z, LIE P, ZENG L. Anal. Chem. , 2012, 84(15): 6321-6325.

    [19] MO L T, QIN R H, MO M X, LIANG D L, YANG C, LIN W Y. Sens. Actuators, B, 2023, 393: 134264.

    [20] ZHANG H, LI F, DEVER B, WANG C, LI Xing-F, LE X C. Angew. Chem. Int. Ed. , 2013, 52(41): 10698-10705.

    [21] BEZERRA A B, KURIAN A S N, EASLEY C J. Anal. Chem. , 2020, 93(1): 198-214.

    [22] LIU X, SHI L, HUA X, HUANG Y, SU S, FAN Q, WANG L, HUANG W. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6(5): 3406-3412.

    [23] LIN Z, CHEN L, ZHU X, QIU B, CHEN G. Chem. Commun. , 2010, 46(30): 5563-5565.

    [24] LI S, ZHENG Y, ZOU Q, LIAO G, LIU X, ZOU L, YANG X, WANG Q, WANG K. Anal. Chem. , 2020, 92(21): 14576-14581.

    [25] YANG P, GUO X, ZHANG J, CHEN C, GAN Y, XIE W, DU Y, WU Z. Biosens. Bioelectron. , 2022, 208: 114228.

    [26] TAGHDISI S M, DANESH N M, RAMEZANI M, EMRANI A S, ABNOUS K. Biosens. Bioelectron. , 2016, 80: 532-537.

    國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 22134007)和廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 2024A1515011077)資助。

    猜你喜歡
    肌紅蛋白凝血酶
    超聲引導(dǎo)下壓迫聯(lián)合瘤腔注射凝血酶治療醫(yī)源性假性動(dòng)脈瘤的臨床觀察
    缺血修飾白蛋白和肌紅蛋白對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的早期診斷價(jià)值
    床旁即時(shí)檢測(cè)儀用于野外軍訓(xùn)檢測(cè)尿液肌紅蛋白的應(yīng)用研究
    磁珠固定化凝血酶的制備及其在槐米中活性化合物篩選中的應(yīng)用
    磷酸化水平對(duì)肌紅蛋白穩(wěn)定性的影響
    牛排“血水”不是血
    凝血酶在預(yù)防乳腺微創(chuàng)旋切術(shù)后出血中的應(yīng)用價(jià)值
    羊血凝血酶制備條件優(yōu)化
    牛心氧合肌紅蛋白的分離純化及氧化穩(wěn)定性研究
    凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展
    女同久久另类99精品国产91| 欧美一级a爱片免费观看看 | 午夜影院日韩av| www.自偷自拍.com| 国产精品影院久久| 久久久国产欧美日韩av| 男女午夜视频在线观看| www日本黄色视频网| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产黄a三级三级三级人| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 国内精品久久久久久久电影| 高潮久久久久久久久久久不卡| 超碰成人久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线永久观看黄色视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 99热这里只有精品一区 | www.熟女人妻精品国产| 99热6这里只有精品| 国产区一区二久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 黑人操中国人逼视频| 国语自产精品视频在线第100页| av在线播放免费不卡| 亚洲人与动物交配视频| 在线观看一区二区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品久久久久久久久久免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 999精品在线视频| 妹子高潮喷水视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费看美女性在线毛片视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 天堂动漫精品| 村上凉子中文字幕在线| 国产av在哪里看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产真人三级小视频在线观看| videosex国产| 日本 欧美在线| 大型av网站在线播放| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品国产高清国产av| 国产成人av激情在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美一级毛片孕妇| 婷婷亚洲欧美| 国产精品av视频在线免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美黑人巨大hd| 国产区一区二久久| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品久久久久久成人av| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲一区中文字幕在线| 一区二区三区高清视频在线| 听说在线观看完整版免费高清| 久久这里只有精品19| 日日夜夜操网爽| 中文在线观看免费www的网站 | 激情在线观看视频在线高清| 精品国产乱子伦一区二区三区| 特大巨黑吊av在线直播| 1024手机看黄色片| 中文字幕熟女人妻在线| 美女免费视频网站| 国产成人系列免费观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产一区二区在线av高清观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 91老司机精品| 亚洲国产精品成人综合色| 99在线视频只有这里精品首页| 天堂影院成人在线观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 久久这里只有精品19| av视频在线观看入口| 一二三四社区在线视频社区8| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日本 av在线| 国产主播在线观看一区二区| 免费看十八禁软件| 国产成人av激情在线播放| 国产99白浆流出| 99热只有精品国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲精华国产精华精| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 小说图片视频综合网站| 全区人妻精品视频| 亚洲专区中文字幕在线| 我要搜黄色片| 欧美中文综合在线视频| 一本综合久久免费| 黄色成人免费大全| 国产伦一二天堂av在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲免费av在线视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 91大片在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日韩大码丰满熟妇| 此物有八面人人有两片| 国产三级在线视频| 麻豆成人av在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 成年版毛片免费区| 亚洲专区中文字幕在线| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲18禁久久av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 午夜免费成人在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩免费av在线播放| 精品国产美女av久久久久小说| 免费观看人在逋| 午夜免费激情av| 欧美在线一区亚洲| 久久久国产欧美日韩av| 两个人的视频大全免费| 日韩精品青青久久久久久| 国产三级在线视频| 亚洲精品在线美女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久精品成人免费网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 狠狠狠狠99中文字幕| www.精华液| 香蕉久久夜色| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 全区人妻精品视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 曰老女人黄片| 成人av一区二区三区在线看| 他把我摸到了高潮在线观看| 波多野结衣高清作品| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产乱人伦免费视频| 国产91精品成人一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人国产综合亚洲| 国产精品影院久久| av欧美777| 一区二区三区高清视频在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美不卡视频在线免费观看 | 日韩欧美精品v在线| 久久久国产欧美日韩av| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲avbb在线观看| 日日爽夜夜爽网站| svipshipincom国产片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久99久视频精品免费| 久久这里只有精品19| 国产精华一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 精品欧美一区二区三区在线| 丁香六月欧美| 日本五十路高清| 男女视频在线观看网站免费 | 国产av不卡久久| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| 少妇粗大呻吟视频| 欧美在线黄色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久国产精品影院| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本 av在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 丝袜美腿诱惑在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费观看人在逋| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 身体一侧抽搐| 欧美日韩黄片免| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线观看一区二区三区| 久久久久久大精品| 亚洲av熟女| 国产精品亚洲av一区麻豆| 在线观看66精品国产| 国产亚洲欧美在线一区二区| 午夜久久久久精精品| 亚洲 国产 在线| 欧美黑人巨大hd| 一区二区三区国产精品乱码| 美女黄网站色视频| 无人区码免费观看不卡| 看黄色毛片网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99久久精品热视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美午夜高清在线| 九色成人免费人妻av| 中亚洲国语对白在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 中文字幕久久专区| 一级黄色大片毛片| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品电影一区二区在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美三级三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 在线观看舔阴道视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久久久久久久久黄片| 日本 av在线| 中国美女看黄片| 亚洲第一电影网av| www日本在线高清视频| 不卡一级毛片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产欧美日韩一区二区三| 国产亚洲精品久久久久5区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品久久久久久精品电影| www.www免费av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲成av人片在线播放无| 国产成人精品久久二区二区免费| 操出白浆在线播放| 久久精品91无色码中文字幕| 成人国语在线视频| 又黄又粗又硬又大视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| av天堂在线播放| 听说在线观看完整版免费高清| xxx96com| www日本黄色视频网| 可以在线观看的亚洲视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品久久久久久,| 一个人免费在线观看电影 | 两个人看的免费小视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 窝窝影院91人妻| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲国产欧美网| 精华霜和精华液先用哪个| 高清毛片免费观看视频网站| 日本一本二区三区精品| 国产探花在线观看一区二区| 日本一本二区三区精品| 中文字幕高清在线视频| 看片在线看免费视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 丰满的人妻完整版| 十八禁人妻一区二区| 亚洲最大成人中文| 黄频高清免费视频| 久久精品国产综合久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 一边摸一边抽搐一进一小说| 伦理电影免费视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产乱人伦免费视频| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品久久久av美女十八| 俄罗斯特黄特色一大片| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩欧美在线二视频| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区激情短视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩精品免费视频一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 香蕉久久夜色| 成人av一区二区三区在线看| 哪里可以看免费的av片| bbb黄色大片| 男男h啪啪无遮挡| 欧美日本亚洲视频在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 精品国产乱码久久久久久男人| 成人亚洲精品av一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 成人三级黄色视频| 国产一区二区激情短视频| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲黑人精品在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 大型黄色视频在线免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 手机成人av网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品久久久久久成人av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产成年人精品一区二区| av视频在线观看入口| 99久久精品国产亚洲精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 激情在线观看视频在线高清| 午夜免费成人在线视频| 90打野战视频偷拍视频| 国产激情久久老熟女| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 丰满的人妻完整版| 日本一区二区免费在线视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 国内精品久久久久精免费| 久久久精品大字幕| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品人妻少妇| 极品教师在线免费播放| 国产成人aa在线观看| 国产免费男女视频| 亚洲人成77777在线视频| 伦理电影免费视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美色视频一区免费| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲在线自拍视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费在线观看黄色视频的| 脱女人内裤的视频| 国产精品久久久av美女十八| www.www免费av| 成人精品一区二区免费| 国产主播在线观看一区二区| 制服诱惑二区| 黄色a级毛片大全视频| 不卡av一区二区三区| 国产三级中文精品| av欧美777| 欧美黑人巨大hd| 亚洲在线自拍视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 天堂√8在线中文| 久久中文字幕一级| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 成人一区二区视频在线观看| 九色成人免费人妻av| 免费在线观看日本一区| 久久久久久久午夜电影| 一区二区三区国产精品乱码| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 狠狠狠狠99中文字幕| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 无限看片的www在线观看| 宅男免费午夜| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲中文字幕日韩| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国内精品久久久久精免费| 999久久久精品免费观看国产| 国产成年人精品一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一区二区三区国产精品乱码| 色在线成人网| 一本久久中文字幕| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜精品久久久久久毛片777| 老熟妇仑乱视频hdxx| 毛片女人毛片| 激情在线观看视频在线高清| 老汉色av国产亚洲站长工具| 麻豆国产av国片精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 宅男免费午夜| 99在线视频只有这里精品首页| 麻豆一二三区av精品| 亚洲中文字幕日韩| 色综合站精品国产| 午夜成年电影在线免费观看| 草草在线视频免费看| 日韩欧美在线二视频| 亚洲片人在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲一区中文字幕在线| 国产一区二区在线观看日韩 | 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 五月玫瑰六月丁香| 久久 成人 亚洲| 91成年电影在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 黄频高清免费视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜两性在线视频| 国产黄色小视频在线观看| 超碰成人久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产1区2区3区精品| 免费电影在线观看免费观看| 精品久久蜜臀av无| 在线观看www视频免费| 亚洲性夜色夜夜综合| 日本在线视频免费播放| 女同久久另类99精品国产91| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 可以在线观看的亚洲视频| 成人永久免费在线观看视频| 黄色女人牲交| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品在线观看二区| 一本一本综合久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品影院久久| av视频在线观看入口| www.精华液| 中文字幕高清在线视频| 99re在线观看精品视频| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久久久国产一级毛片高清牌| 好男人电影高清在线观看| 午夜免费激情av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品国产美女av久久久久小说| 禁无遮挡网站| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久久人人人人人| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本在线视频免费播放| 国产爱豆传媒在线观看 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品野战在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产久久久一区二区三区| 国产精品影院久久| 老鸭窝网址在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 麻豆成人av在线观看| av有码第一页| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜免费观看网址| 国产真实乱freesex| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲人成77777在线视频| 国产高清videossex| 18禁观看日本| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 97碰自拍视频| 又大又爽又粗| 成年版毛片免费区| 欧美性猛交黑人性爽| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲真实伦在线观看| 久久久国产成人免费| 国产亚洲av高清不卡| 色播亚洲综合网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 岛国在线免费视频观看| 国产亚洲精品av在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 人妻久久中文字幕网| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av在线天堂中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久久久久中文| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 村上凉子中文字幕在线| 日本在线视频免费播放| 18禁国产床啪视频网站| 久久伊人香网站| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 国产午夜福利久久久久久| 制服丝袜大香蕉在线| 级片在线观看| 一区福利在线观看| 午夜老司机福利片| 在线观看www视频免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 9191精品国产免费久久| 九色成人免费人妻av| 黄色丝袜av网址大全| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲片人在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 丝袜美腿诱惑在线| 一区二区三区激情视频| 美女 人体艺术 gogo| 国产主播在线观看一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 国产成人精品无人区| 久久香蕉精品热| 亚洲成av人片免费观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产成人精品久久二区二区91| 看黄色毛片网站| 日韩三级视频一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精华霜和精华液先用哪个| 最新在线观看一区二区三区| 嫩草影视91久久| 国产av又大| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产探花在线观看一区二区| 十八禁网站免费在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄色a级毛片大全视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 999精品在线视频| 校园春色视频在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲一区二区三区不卡视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 青草久久国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 嫩草影院精品99| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲中文av在线| 国产激情欧美一区二区| 久久久国产精品麻豆| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 一个人免费在线观看的高清视频| 麻豆成人av在线观看| 国产区一区二久久| 国产av不卡久久| 老司机在亚洲福利影院| 欧美色欧美亚洲另类二区| 宅男免费午夜| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久国产成人免费| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产成人影院久久av| 村上凉子中文字幕在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产成人精品无人区| 波多野结衣高清无吗| 天堂影院成人在线观看| 黄频高清免费视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人啪精品午夜网站| 宅男免费午夜| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品1区2区在线观看.| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲av第一区精品v没综合| 婷婷亚洲欧美| 99riav亚洲国产免费| 欧美日韩黄片免|