基于核心專利識別視角的作物生物育種核心技術(shù)研究

摘要：生物育種是種業(yè)創(chuàng)新的核心，是種源核心技術(shù)攻關(guān)的重要手段。明晰作物生物育種核心技術(shù)，對我國戰(zhàn)略性部署育種技術(shù)研發(fā)、破解種源“卡脖子”、實現(xiàn)種業(yè)現(xiàn)代化以及建設(shè)種業(yè)強國具有指導(dǎo)意義?；贒erwent Innovation專利數(shù)據(jù)庫，圍繞核心技術(shù)特征構(gòu)建核心特征測度指數(shù)，結(jié)合專家智慧識別作物生物育種領(lǐng)域核心專利，通過計量分析和文本挖掘，從研發(fā)機構(gòu)、布局區(qū)域和技術(shù)分布視角分析領(lǐng)域核心專利布局概況，洞察作物生物育種核心技術(shù)研發(fā)熱點和重點演變趨勢，經(jīng)專家研判識別出五大作物生物育種核心技術(shù)主題，并結(jié)合我國作物生物育種核心技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)對我國未來生物育種研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化進行了展望。

關(guān)鍵詞：生物育種；核心專利；熵值法；核心特征測度指數(shù)；核心技術(shù)；文本挖掘

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0683

中圖分類號：S336 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2025）03003514

種子是確保國家糧食安全的基礎(chǔ)，生物育種是種業(yè)創(chuàng)新的核心。近年來我國高度重視種業(yè)安全和生物育種工作，提出要加快推進農(nóng)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)、加快生物育種產(chǎn)業(yè)化步伐。2021年出臺的《種業(yè)振興行動方案》將啟動種源關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)列為重點部署工作。面向種源核心技術(shù)攻關(guān)的迫切需求，如何有效識別核心技術(shù)成為首要解決的問題。

專利作為公開獲取的技術(shù)信息源，是國家、企業(yè)、行業(yè)競爭優(yōu)勢的核心要素之一，能夠更好地揭示領(lǐng)域核心技術(shù)[1]。核心專利承載著產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)，深入挖掘核心專利是洞察領(lǐng)域核心技術(shù)的有效途徑。因此，如何從海量專利中識別核心專利近年來得到廣泛關(guān)注，相關(guān)研究與應(yīng)用日益豐富。

目前，已有學(xué)者采取多種方法對目標(biāo)領(lǐng)域的核心專利進行識別和分析。郭劍明等[2]構(gòu)建了基于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的核心專利識別方法；付振康等[3]基于影響專利壽命的指標(biāo)，通過深度學(xué)習(xí)模型識別數(shù)字通信技術(shù)領(lǐng)域的核心專利；陳祥等[4]通過構(gòu)建專利進化模型和技術(shù)擴散指數(shù)識別疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域的核心專利；王曰芬等[5]從行為效果和動機目的視角構(gòu)建核心專利識別指標(biāo)體系，篩選人工智能領(lǐng)域核心專利；謝萍等[6]構(gòu)建了核心專利綜合價值指標(biāo)體系，以識別風(fēng)能領(lǐng)域的核心專利；羅立國等[7]通過多元回歸模型分析了多種專利屬性指標(biāo)與核心專利的相關(guān)性，識別出新能源汽車裝置領(lǐng)域的核心專利；鞏永強等[8]基于專利對創(chuàng)新鏈中基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用環(huán)節(jié)的作用構(gòu)建測度指標(biāo)，篩選出白血病相關(guān)藥物領(lǐng)域的核心專利。趙蓉英等[9]根據(jù)被引頻次對人工智能領(lǐng)域核心專利進行了深入挖掘與研究；崔斌等[10]基于權(quán)利申請數(shù)量、發(fā)明人數(shù)量等指標(biāo)，運用超體積函數(shù)測度識別出基因工程疫苗領(lǐng)域的核心專利；崔遵康等[11]基于Innography 專利強度遴選出糧食作物生物育種領(lǐng)域核心專利。以上研究為本研究中核心專利識別指標(biāo)選擇及方法構(gòu)建提供了重要參考。

在生物育種領(lǐng)域，已有學(xué)者開展了關(guān)于核心技術(shù)的探索研究，梁翰文等[12]綜述了作物育種關(guān)鍵技術(shù)發(fā)展態(tài)勢；陳贏男等[13]概述了現(xiàn)代林木育種關(guān)鍵核心技術(shù)研究現(xiàn)狀；楊艷萍等[14]通過專利共被引聚類和組合分析識別出作物育種技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)。

綜上所述，已有研究多基于專家定性分析以及專利關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)聚類分析方面，鮮有從核心專利與核心技術(shù)的關(guān)聯(lián)性出發(fā)，通過定量分析方法識別核心專利，進而挖掘核心技術(shù)的研究。因此，本研究圍繞核心技術(shù)特征構(gòu)建核心特征測度指數(shù)，結(jié)合專家智慧識別作物生物育種領(lǐng)域核心專利，通過文本挖掘明晰該領(lǐng)域核心技術(shù)，以期為我國科學(xué)開展作物育種技術(shù)布局、優(yōu)化產(chǎn)業(yè)布局、破解國外技術(shù)封鎖、推動我國種業(yè)現(xiàn)代化、建設(shè)種業(yè)強國提供數(shù)據(jù)支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)來自Derwent Innovation 全球?qū)＠麛?shù)據(jù)庫，其收錄了德溫特世界專利索引（DerwentWorld Patent Index， DWPI）和德溫特專利引文索引（Derwent Patent Citation Index， DPCI）數(shù)據(jù)庫的全部專利以及來自全球48個專利授予機構(gòu)、90多個國家和地區(qū)的9 300 萬件專利信息。根據(jù)經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for EconomicCo-operation and Development， OECD）確定的生物技術(shù)專利分類號提取涉及育種領(lǐng)域的專利分類號，包括A01H1*、A01H4*、C12M*、C12N*、C12Q*，并與代表作物領(lǐng)域的分類號（A01H）相組合，按照數(shù)據(jù)庫的檢索式表達要求，確定作物生物育種技術(shù)檢索表達式。專利申請時間范圍為2000—2020年，檢索時間為2021年12月30日，共獲得專利108 742件。

1.2 研究方法

核心專利識別。本研究參考前人方法[15-17]從基礎(chǔ)性、影響性和競爭性3個維度表征核心技術(shù)，并選擇相關(guān)測度指標(biāo)（表1）。為減少無效專利的影響，選取各項指標(biāo)均大于零的專利，共計16 749件；然后采集其相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，將所選指標(biāo)通過熵值法進行賦權(quán)。

熵值法是根據(jù)各項指標(biāo)值所提供的信息大小來確定指標(biāo)權(quán)重的客觀賦權(quán)法，基于信息論原理，指標(biāo)的信息熵越小，不確定性就越小，所提供信息量越大，在綜合評價中所發(fā)揮的作用越大，權(quán)重越高。熵值法具體步驟如下。

①由n 年數(shù)據(jù)來源的m 項評價指標(biāo)構(gòu)成數(shù)據(jù)矩陣X。

建立情報專家和育種領(lǐng)域?qū)＜覉F隊，通過專家反復(fù)研討，選取CCIi排名前3%的專利形成初始核心專利集，經(jīng)作物育種領(lǐng)域?qū)＜覍訉渝噙x，得到116件核心專利（圖1）。

通過文獻計量法，利用德溫特數(shù)據(jù)分析軟件（Derwent data analyzer，DDA）和 Excel 等工具，從申請趨勢、地域分布、申請人、技術(shù)分布等維度進行計量統(tǒng)計，利用DDA 主題詞抽取和可視化功能分析作物生物育種核心專利熱點主題詞，通過詞頻逆文本頻率指數(shù)（term frequency-inversedocument frequency，TF-IDF）統(tǒng)計方法挖掘?qū)＠匾黝}詞。

2 結(jié)果與分析

2.1 核心專利計量分析

2.1.1 重要研發(fā)機構(gòu) 作物生物育種核心專利主要來自陶氏益農(nóng)、Broad研究所、麻省理工學(xué)院和孟山都（表2），陶氏益農(nóng)和孟山都的專利申請主要集中在2010年，內(nèi)容聚焦轉(zhuǎn)基因技術(shù)；Broad研究所和麻省理工學(xué)院的專利申請主要集中在2013年，內(nèi)容以基因組編輯技術(shù)為主。

2.1.2 主要布局區(qū)域 作物生物育種核心專利主要在美國（57件）和歐盟地區(qū)（11件），這與現(xiàn)代生物育種技術(shù)多起源于美國和歐洲地區(qū)有關(guān)，申請人一般會優(yōu)先考慮在本國進行專利布局。在美國布局的核心專利重要主題詞涵蓋轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)；在歐盟地區(qū)布局的核心專利重要主題詞則集中在CRISPR/Cas（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated）基因編輯技術(shù)（表3）。這與2個地區(qū)對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因組編輯技術(shù)的監(jiān)管制度緊密相關(guān)。美國對于現(xiàn)代生物育種技術(shù)持相對寬松的監(jiān)管方式，在全球最早頒布并執(zhí)行轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)管制度，基于“個案分析”以基因編輯作物最終產(chǎn)品作為監(jiān)管對象，綜合評估產(chǎn)品的安全性、新穎性，目前已有基因編輯產(chǎn)品獲批上市[1819]，相對明朗寬松的監(jiān)管政策促進了相關(guān)技術(shù)的研發(fā)及專利布局。歐盟地區(qū)對轉(zhuǎn)基因作物持相對謹慎的監(jiān)管態(tài)度，嚴(yán)格限制轉(zhuǎn)基因作物在歐洲地區(qū)種植，而對于基因編輯作物則從最初將其視為轉(zhuǎn)基因作物等同監(jiān)管轉(zhuǎn)向釋放放寬基因編輯在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域監(jiān)管限制的信號[20]，促使其成為基因組編輯技術(shù)專利布局的熱點地區(qū)之一。

2.1.3 技術(shù)分布 作物生物育種核心專利主要分布在C12N15和A01H5這2個技術(shù)領(lǐng)域（表4），熱點主題詞包括CRISPR、轉(zhuǎn)基因、特異性堿基對序列、靶標(biāo)DNA、新DNA 靶向RNA、位點特異性修飾、多肽、定點等（圖2）。從時間分布來看，大致以2012年為分割點，2012年之前的熱點主題詞以轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因、害蟲、防控雜草、防控鱗翅目害蟲等轉(zhuǎn)基因技術(shù)相關(guān)詞組為主；2012年之后的熱點主題詞以CRISPR、靶標(biāo)DNA、特異性堿基對序列、位點特異性修飾、定點、多肽、新DNA靶向RNA、CRISPR酶系統(tǒng)等基因組編輯技術(shù)相關(guān)詞組居多（圖3）。

重要主題詞的時間分布（表5）顯示，2012年之前作物生物育種技術(shù)的研發(fā)重心集中在防控雜草與蟲害、新型抗蟲蛋白、轉(zhuǎn)基因植物；2012年首次出現(xiàn)specific base pair sequence主題詞；2013年首次出現(xiàn)CRISPR enzyme system、target DNA、newDNA-targeting RNA、performing site-specificmodification、site-directed、interspaced shortpalindromic repeats （CRISPR）-CRISPR 等主題詞，并延續(xù)出現(xiàn)在之后的年份。由此可見，2012年以前作物育種主要是以轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)為主，以提升作物的抗蟲、抗除草劑性能；2012年之后作物生物育種技術(shù)的研發(fā)重心轉(zhuǎn)向以CRISPR為代表的基因組編輯技術(shù)和靶向育種技術(shù)。從技術(shù)類別來看，作物生物育種核心專利主要涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)（75件）和基因組編輯技術(shù)（41件），同樣呈現(xiàn)出由轉(zhuǎn)基因技術(shù)向基因組編輯技術(shù)遷移的趨勢（圖4）。

2.2 作物生物育種領(lǐng)域核心技術(shù)解析

通過專家解讀，作物生物育種領(lǐng)域核心技術(shù)主題包括：①外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進與優(yōu)化；②RNA干擾遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建；③CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建；④抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定；⑤綜合性狀改良基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育。其中，主題①的專利申請年份最早，核心特征測度指數(shù)最高，代表基礎(chǔ)核心技術(shù)；主題③的核心特征測度指數(shù)較高，且平均申請年份較新，代表新興核心技術(shù)；主題④的核心專利最多，研究熱度最大。從時間脈絡(luò)來看，作物生物育種核心技術(shù)大致經(jīng)歷了從外源基因轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建與優(yōu)化、功能基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育到RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建，再到CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的演進過程。

2.2.1 外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進與優(yōu)化 與常規(guī)雜交育種相比，外源基因轉(zhuǎn)入可以打破生殖隔離，在更大范圍內(nèi)利用基因資源，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)在不同物種間的傳遞，更快地獲得具有理想性狀的新品種；其次，外源基因轉(zhuǎn)入還可以更為精準(zhǔn)地在同一物種內(nèi)傳遞遺傳物質(zhì)，將多種優(yōu)良性狀快速集于一身，大幅提高育種效率。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是影響轉(zhuǎn)基因作物培育的重要環(huán)節(jié)。近年來，作物轉(zhuǎn)基因效率得到大幅提高，特別是小麥，轉(zhuǎn)化效率從不足1% 提高到近20%，并且已經(jīng)基本克服了基因型限制[21]。目前主要研究方向是利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化替代基因槍，用成熟胚或其他外植體替代幼胚培養(yǎng)，以簡化操作程序和消除設(shè)備依賴性；載體改造方面實現(xiàn)單次多基因轉(zhuǎn)化和多基因同步編輯，以提高轉(zhuǎn)化效率和降低成本。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利包括通過轉(zhuǎn)基因載體的改造提高轉(zhuǎn)化效率和更有效地改變目標(biāo)基因的表達活性。孟德爾生物公司從擬南芥蛋白質(zhì)乙烯反應(yīng)因子中鑒定得到一個新的強轉(zhuǎn)錄激活域EDLL，當(dāng)EDLL結(jié)構(gòu)域通過序列特異性DNA結(jié)合蛋白或通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作鉚定到靶基因啟動子時可顯著提高靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，可以作為高效的轉(zhuǎn)錄激活工具，增強轉(zhuǎn)基因植物中靶基因的活性[22]。孟山都鑒定出一套可操縱靶基因在植物中表達的調(diào)控序列，其中5’啟動子DNA序列在單子葉和雙子葉作物中均具有可調(diào)節(jié)靶基因表達活性的功能，3’非翻譯區(qū)用于基因轉(zhuǎn)錄后加工，以保證轉(zhuǎn)錄本的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[23]。

2.2.2 RNA 干擾遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是真核生物中由RNA介導(dǎo)的保守調(diào)節(jié)機制，由雙鏈RNA 誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi技術(shù)可特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，已成為植物性狀改良的重要方式之一。目前，已利用RNAi技術(shù)培育出抗病蟲害、抗非生物脅迫和品質(zhì)改良的植物新品種[24]。由于RNAi技術(shù)具有抗蟲靶標(biāo)基因來源廣、基因特異性強等優(yōu)點，能夠有效延緩害蟲抗性進化，目前已廣泛應(yīng)用于作物病蟲害防治，在擬南芥、煙草、馬鈴薯、玉米、小麥、棉花和大豆等多種作物均實現(xiàn)了基于RNAi的抗蟲品種培育[25]。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利主要涉及將雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引入植物的方法以及其在培育抗蟲、抗逆和綜合品質(zhì)改良植物品種中的應(yīng)用。孟山都研發(fā)出與植物中靶基因序列互補或相同的dsRNA，植物經(jīng)約2.5 μm的顆粒研磨后與dsRNA 接觸，以滲透壓劑方式將dsRNA引入植物，賦予植物增產(chǎn)、抗非生物脅迫、抗病等優(yōu)異性狀[26]。在抗蟲研究方面，孟山都研發(fā)出由編碼dsRNA的DNA及其相關(guān)異源啟動子構(gòu)成的重組DNA構(gòu)建體，通過向植物中轉(zhuǎn)入該構(gòu)建體觸發(fā)產(chǎn)生抑制害蟲靶基因的dsRNA，實現(xiàn)對跳甲蟲物種的防治[27]。在抗非生物脅迫和品質(zhì)改良研究方面，孟山都研發(fā)出異源miRNA識別位點的分子構(gòu)建體和用于基因抑制的分子構(gòu)建體，以及含有該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，可有效提高植物非生物脅迫抗性、生物應(yīng)激耐受性、病蟲害抗性、產(chǎn)量及氮利用率等農(nóng)藝性狀[28]。

2.2.3 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)來源于細菌和古細菌的獲得性免疫，其通過設(shè)計1個特定短引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）補充目標(biāo)位點即可對DNA進行定點切割，實現(xiàn)了基因編輯的易編輯性，開創(chuàng)了基因編輯新時代，2位創(chuàng)始人也因此獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎[29]。隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動物細胞中的應(yīng)用，麻省理工學(xué)院張峰團隊首次將Cas9改造為缺口酶以促進同源重組[30]；哈佛大學(xué)Church G團隊完成Ⅱ型系統(tǒng)設(shè)計，引入多個gRNA實現(xiàn)對目標(biāo)基因座的多重編輯[31]；加州大學(xué)舊金山分校開發(fā)出CRISPRi技術(shù)，將Cas9蛋白改造為失去核酸內(nèi)切酶活性的dCas9，與gRNA共表達，通過結(jié)合目標(biāo)DNA抑制其表達[32]。

CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)在植物領(lǐng)域的研究與應(yīng)用日益廣泛，多種植物CRISPR/Cas基因編輯體系成功建立，CRISPR/Cas系統(tǒng)逐步發(fā)展擴充為CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13及CRISPR/Cas14四大編輯系統(tǒng)[33]。目前，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于小麥、玉米、水稻、大豆、馬鈴薯、番茄、油菜和花生等農(nóng)作物的育種改良[34]，基本實現(xiàn)了靶向基因敲除與插入、DNA-free編輯、RNA編輯、單堿基編輯、基因定位、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和表觀修飾等功能，培育出具有高產(chǎn)、抗病蟲害、抗除草劑和非生物脅迫的作物新品種[35]。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利主要涉及在不同環(huán)境下使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯的方法，包括不同的sgRNA或Cas9的不同結(jié)合方式，將靶向目標(biāo)基因組序列的CRISPR與Cas9基因構(gòu)建到同一載體上，CRISPR序列在被轉(zhuǎn)錄成為RNA后，能夠與Cas9蛋白形成復(fù)合體，導(dǎo)向Cas9蛋白到基因組靶序列進行切割，實現(xiàn)原核或真核細胞內(nèi)基因組的精準(zhǔn)靶向編輯。Doudna等[36]研發(fā)出不限環(huán)境的靶標(biāo)DNA切割，首次將CRISPR/Cas9這一自然界存在的細菌對病毒的防疫機制進行體外重組，實現(xiàn)復(fù)雜基因組的查找、切割等工具化操作，專利權(quán)限包括體外或細胞內(nèi)使用CRISPR/Cas9；Zhang[37]研發(fā)出在真核或有核細胞內(nèi)（尤其是哺乳動物細胞和植物基因組）對靶標(biāo)DNA切割的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，專利權(quán)限包括在真核細胞或任何有細胞核的物種中使用CRISPR/Cas9，首次將CRISPR/Cas9在和人類關(guān)系最為密切的真核細胞中進行應(yīng)用。

2.2.4 抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定 目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用以抗除草劑基因和抗蟲基因為主，相關(guān)轉(zhuǎn)基因作物已得到大面積推廣應(yīng)用[38]?？瓜x基因主要集中于編碼蘇云金芽孢桿菌Bt蛋白及其重組蛋白的核酸序列，已發(fā)現(xiàn)798個Cry家族基因、177個Vip家族基因和40個Cyt家族基因。商業(yè)化應(yīng)用的抗蟲性狀轉(zhuǎn)化體以Cry類基因居多，其中cry1Ab、cry1Fa2、cry35Ab1基因應(yīng)用最為廣泛[39]。耐除草劑基因主要包括原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PPO）、對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）、草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（glyphosate N-acetytransferase，GLYAT）、突變的纖維素合酶（cellulose synthase，CESA）、5烯醇丙酮酰莽草酸3磷酸合酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）、麥草畏脫羧酶等除草劑靶標(biāo)酶的編碼序列[40]。

該技術(shù)主題的研發(fā)內(nèi)容主要是圍繞廣譜抗蟲基因、抗除草劑基因以及聚合抗除草劑和抗蟲基因的挖掘與鑒定。在抗蟲方面，主要通過修飾抗蟲基因或聚合不同靶標(biāo)害蟲的多個抗蟲基因以實現(xiàn)對鱗翅目、鞘翅目及雙翅目等多種害蟲的抗性，拓寬轉(zhuǎn)基因植物抗蟲譜，并延緩害蟲耐藥性。主要包括防治鱗翅目昆蟲的殺蟲蛋白CRY1Ca 和CRY1Fa[41]，在Cry1Ca蛋白基礎(chǔ)上進行改良，對產(chǎn)生Cry1F抗性的秋粘蟲和甘蔗螟具有殺滅活性的DIG-109及DIG-152蛋白[42]，控制歐洲玉米螟和秋粘蟲的Cry1Ab和Cry1Be蛋白組合[43]，防治秋粘蟲的Cry1Da和Cry1Be蛋白組合[44]，防治草地貪夜蛾的Cry1Da和Cry1Ca蛋白組合[45]以及防治玉米根蟲的Cry3殺蟲多肽[46]的編碼基因。在抗除草劑方面，通過挖掘和創(chuàng)制不同除草劑對應(yīng)的不同靶基因或同一靶基因的不同抗性突變位點，經(jīng)人工誘變及突變體篩選、轉(zhuǎn)基因?qū)胪庠纯剐曰虻仁侄潍@得抗除草劑育種材料。涉及的抗除草劑種類包括草甘膦[4748]、麥草畏[49-51]、乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS）抑制劑類[52]、羥基苯基丙酮酸雙加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvatedioxygenase，HPPD）類抑制劑類[53]。此外，通過多種耐除草劑基因堆疊創(chuàng)制復(fù)合型耐除草劑品種[5455]也是新趨勢之一。

為了同時實現(xiàn)抗蟲、抗除草劑效果，在同一植物中聚合抗除草劑和抗蟲基因是重要方式之一。陶氏益農(nóng)在大豆轉(zhuǎn)基因事件pDAB4468.04.16.1和 pDAB9582.814.19.1中實現(xiàn)了抗除草劑和抗蟲基因的聚合，使大豆包含AAD-12、CrylF、CrylAc（synpro） 和 PAT 編碼基因，為大豆作物同時提供抗蟲性和除草劑耐受性[56]。陶氏益農(nóng)在玉米新aad-1轉(zhuǎn)化事件中插入玉米細胞基因組內(nèi)特定位點的多核苷酸序列，編碼耐除草劑和抑制昆蟲蛋白，并研發(fā)出用于樣品檢測的試劑盒[57]。

2.2.5 綜合性狀改良基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育 面對全球氣候變化、耕地面積減少、人口不斷增加等挑戰(zhàn)，促進作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、提升制作物氣候適應(yīng)性，成為保障糧食安全的基本要求，作物高產(chǎn)及抗旱、抗寒、耐高溫等抗逆基因的挖掘一直是作物遺傳改良的研究熱點。隨著人們生活水平提高，對優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的需求日益高漲，健康品質(zhì)基因的鑒定也逐漸成為重要的研究方向之一。近年來，協(xié)同性狀矛盾基因的鑒定成為重要突破，Wei等[58]發(fā)現(xiàn)了能夠同時提水稻高光合作用效率和氮素利用效率的高產(chǎn)基因OsDREB1C，使水稻增產(chǎn)30%以上；Brown等[59]從小麥Mlo 基因編輯突變體中篩選鑒定出具有白粉病廣譜抗性且對產(chǎn)量沒有負效應(yīng)的植株，為抗病和產(chǎn)量的協(xié)同改良提供了重要育種材料。

該技術(shù)主題的相關(guān)專利包括提升植物健康品質(zhì)、產(chǎn)量和環(huán)境脅迫耐受性的DNA構(gòu)建體組配及相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物選育方法。孟德爾生物公司研發(fā)出使植物高產(chǎn)、耐受滲透脅迫或干旱、開花延遲以及木質(zhì)素含量增加的轉(zhuǎn)錄因子序列及相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物[60]；孟山都研發(fā)出新的重組DNA構(gòu)建體以及獲得含該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子和植物的方法，使植物水分利用率、氮利用率、產(chǎn)量和耐寒性提高，種子蛋白和油脂成分得到改善[61]。聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織研發(fā)出編碼ω-3去飽和酶的DNA構(gòu)建體，并實現(xiàn)了其與植物基因組的整合，使植物產(chǎn)生更多的多不飽和脂肪酸[62]。美國無煙煙草公司研發(fā)出編碼細胞色素p450酶和尼古丁去甲基化酶的核酸序列，可以有效降低煙草中的尼古丁含量[6364]。

3 討論與展望

3.1 討論

作物生物育種核心專利主要來自陶氏益農(nóng)、Broad研究所、麻省理工學(xué)院和孟山都，美國和歐盟地區(qū)是熱點布局地區(qū)，技術(shù)內(nèi)容涵蓋轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)，熱點主題詞包括CRISPR、轉(zhuǎn)基因、特異性堿基對序列、靶標(biāo)DNA、新DNA 靶向RNA、位點特異性修飾、多肽、位點定向。

通過深入分析核心專利，洞察作物生物育種核心技術(shù)發(fā)展態(tài)勢如下。

第一，核心技術(shù)聚焦5大主題。①抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定；②CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建；③RNAi遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建；④綜合性狀改良基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育；⑤外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進與優(yōu)化。其中，抗蟲、抗除草劑基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種鑒定是熱點核心技術(shù)；CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建是新興核心技術(shù)；外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改進與優(yōu)化屬于基礎(chǔ)核心技術(shù)。

第二，技術(shù)布局呈現(xiàn)地區(qū)差異。美國相對明朗寬松的生物育種監(jiān)管方式使其成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因組編輯技術(shù)兩大主流生物育種核心技術(shù)的熱點布局地區(qū)，歐盟在有望放寬基因編輯監(jiān)管限制的形勢下，成為CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的熱點布局地區(qū)。

第三，呈現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因技術(shù)向基因組編輯技術(shù)變遷的趨勢。2012年之前的技術(shù)研發(fā)聚焦轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研發(fā)重心集中在防控雜草與蟲害、新型抗蟲蛋白、轉(zhuǎn)基因植物；2012年之后基因組編輯技術(shù)研究日益升溫，CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)是技術(shù)研發(fā)重心。作物生物育種核心技術(shù)呈現(xiàn)從外源基因轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建與優(yōu)化、功能基因挖掘及轉(zhuǎn)基因品種選育到RNAi 技術(shù)轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建，再到CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的演進趨勢。

3.2 展望

我國正處于深入實施種業(yè)振興行動的關(guān)鍵時期，明晰生物育種核心技術(shù)及國際發(fā)展動態(tài)對于我國推進農(nóng)業(yè)關(guān)鍵核心技術(shù)攻關(guān)、加快生物育種產(chǎn)業(yè)化具有重要指導(dǎo)意義。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種方面，我國獲得了耐儲存番茄、抗蟲棉花、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉(zhuǎn)植酸酶玉米、抗蟲水稻、耐除草劑玉米、雙抗玉米和耐除草劑大豆生物安全生產(chǎn)證書[65]，在作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和材料儲備上已為轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化做出良好準(zhǔn)備，但目前只有抗蟲棉和抗病番木瓜實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，我國技術(shù)儲備潛力有待進一步釋放。亟需通過不斷完善監(jiān)管政策、積極開展轉(zhuǎn)基因技術(shù)公眾科普以及實施全流程監(jiān)管來實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因育種產(chǎn)業(yè)化科學(xué)有序推進。

基因組編輯技術(shù)作為生物育種新興核心技術(shù)，目前主要掌握在技術(shù)源頭機構(gòu)，圍繞在真核細胞中使用CRISPR/Cas9專利優(yōu)先權(quán)和權(quán)限范圍展開了激烈爭奪，相關(guān)專利權(quán)屬之爭仍未了結(jié)，跨國種企通過技術(shù)轉(zhuǎn)讓、許可與合作獲得基因組編輯技術(shù)核心專利使用權(quán)，并在此基礎(chǔ)上延伸出多項應(yīng)用專利，積極部署了CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的研發(fā)與布局[40]。面對如此多CRISPR/Cas相關(guān)專利，任何機構(gòu)都難以獲得所有專利的使用授權(quán)，難以完全避免CRISPR/Cas 專利風(fēng)險。目前歐美國家已經(jīng)對經(jīng)典的基因組編輯工具Cas9及相關(guān)產(chǎn)品進行了較為全面的專利保護，使我國該領(lǐng)域面臨“卡脖子”問題。為解決這一問題，我國科研人員正積極探索并取得一系列重要進展。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的cas12i酶系統(tǒng)[66]和cas12j酶系統(tǒng)[67]已在我國獲得授權(quán)，并向美國、歐盟、日本、澳大利亞等多個國家和地區(qū)遞交了專利申請，同時基于cas12i/j基因編輯器在水稻、玉米等主要農(nóng)作物中構(gòu)建了全新的基因編輯體系；新研發(fā)的cas3c蛋白目前已申請專利，因其更好的編輯效果，已開始應(yīng)用于多種農(nóng)業(yè)生物。未來我國科技工作者需要協(xié)同攻關(guān)，以持續(xù)的技術(shù)創(chuàng)新打通基因編輯技術(shù)上下游，不斷提升效率，降低技術(shù)成本，實現(xiàn)技術(shù)全鏈條的專利保護，以獲取技術(shù)應(yīng)用主動權(quán)；另外，應(yīng)鼓勵研發(fā)不依賴CRISPR/Cas系統(tǒng)核心專利的新系統(tǒng)和新工具，避免基因組編輯技術(shù)核心專利“卡脖子”問題，同時建議盡快部署基因組編輯技術(shù)相關(guān)監(jiān)管法規(guī)的研究與制定，為我國基因組編輯育種產(chǎn)業(yè)化發(fā)展鋪平道路。

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