丁香酚對(duì)合果芋果膠桿菌(Pectobacterium aroidearum)L6抑菌效果研究

摘要 以實(shí)驗(yàn)室前期分離的果膠桿菌（P.aroidearum）L6為對(duì)象，探究丁香酚對(duì)其抑菌效果。通過(guò)常量稀釋法測(cè)定丁香酚對(duì)合果芋果膠桿菌（P.aroidearum）L6的抑菌活性；利用紫外分光光度法測(cè)定經(jīng)丁香酚處理后菌液的K+、AKP、ATP、核酸和蛋白質(zhì)含量；測(cè)定其電導(dǎo)率，再利用掃描電子顯微鏡觀察經(jīng)丁香酚處理后的菌體，從細(xì)胞水平探究丁香酚抑菌效果。結(jié)果顯示，丁香酚對(duì)合果芋果膠桿菌（P.aroidearum）L6的MIC為800 mg/L，EC 50為409.33 mg/L；通過(guò)對(duì)比丁香酚處理前后的菌體破壞特征，發(fā)現(xiàn)K+、AKP、核酸、蛋白質(zhì)和電導(dǎo)率上升，ATP水平下降；掃描電子顯微鏡觀察顯示，丁香酚處理的菌體出現(xiàn)裂解、黏連現(xiàn)象。丁香酚通過(guò)破壞果膠桿菌（P.aroidearum）L6細(xì)胞膜完整性，引起內(nèi)含物泄露、能量代謝失衡，從而達(dá)到抑菌作用。

關(guān)鍵詞 丁香酚；果膠桿菌；抑菌作用；細(xì)胞膜

中圖分類(lèi)號(hào) S 482.2" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A" 文章編號(hào) 0517-6611（2025）04-0124-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.04.025

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Antibacterial Effect of Eugenol on Pectobacterium aroidearum L6

LU Jin peng1，LIU" Wen bo1， FAN" Hong yan2 et al

（1.Tropical Agriculture and Forestry Colloege，Hainan University/Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests，Ministry of Education，Haikou，Hainan 570228;

2.Institution of Tropical Fruit Trees，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou，Hainan 571199）

Abstract The study investigated the antibacterial effect of eugenol against P.aroidearum L6，which was isolated in the laboratory.The antibacterial activity of eugenol was determined using the constant dilution method.Ultraviolet spectrophotometry was used to measure the levels of K+，AKP，ATP，nucleic acid，and protein in the bacterial solution treated with eugenol.The electric conductivity was measured.Scanning electron microscopy was used to observe eugenol treated bacteria and explore the antibacterial effect at the cellular level.The MIC of eugenol for P.aroidearum L6 was 800 mg/L.And the EC 50 of eugenol for P.aroidearum L6 was 409.33 mg/L.Comparison of bacterial damage characteristics before and after eugenol treatment revealed increased levels of K+，AKP，nucleic acid，protein，electric conductivity and decreased ATP levels.Scanning electron microscopy images showed lysed and adhered bacteria following eugenol treatment.Eugenol disrupts the integrity of the cell membrane of P.aroidearum L6，causing leakage of intracellular contents and an imbalance in energy metabolism，thereby achieving its antibacterial effect.

Key words Eugenol;Pectobacterium aroidearum;Antibacterial effect;Cell membrane

基金項(xiàng)目 海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（322MS025，321RC470）;海南省院士創(chuàng)新平臺(tái)科研專(zhuān)項(xiàng)（YSPTZX202018）。

作者簡(jiǎn)介 祿錦鵬（2003—），男，甘肅蘭州人，碩士研究生，研究方向：植物病理。

*通信作者，助理研究員，碩士，從事熱帶作物病理學(xué)研究。

收稿日期 2024-06-24

合果芋（Syngonium podophyllum），也被稱(chēng)為箭葉藤、鵝掌葉、尼芬芋，是天南星科草本常綠植物，原產(chǎn)于中美洲和南美洲的潮濕森林地帶^［1］。目前，合果芋在觀葉植物中使用最為廣泛，包括室外園林觀賞、室內(nèi)盆栽或者吊籃裝飾等^［2-3］。Pectobacterium spp.是細(xì)菌性軟腐病的主要病原，其寄主范圍很廣，各個(gè)種都可以侵染農(nóng)作物、水果、觀賞植物等造成破壞性的軟腐病害^［4-5］。實(shí)驗(yàn)室前期在合果芋葉片上發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)菌性軟腐病，通過(guò)室內(nèi)分離、單孢純化及致病性測(cè)定，并通過(guò)形態(tài)特征、生理生化特性、16S rNA及DNA-DNA雜交等方法，鑒定引起合果芋軟腐病的病原為果膠桿菌（P.aroidearum）^［6-7］，該病原是許多植物上的致病病原，為害嚴(yán)重，目前還缺少有效藥劑防治^［8］，已有研究利用貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BPC16和W2-7對(duì)P.aroidearum引起魔芋軟腐病進(jìn)行防治，但防效均未超過(guò)45%^［9］；羅林麗等^［10］從13種常見(jiàn)的殺細(xì)菌劑中篩選出7種對(duì)P.aroidearum有抑菌效果，但其化學(xué)農(nóng)藥在田間進(jìn)行的試驗(yàn)還未見(jiàn)報(bào)道，而且化學(xué)藥劑防治會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染。因此，尋找新型天然安全的抑菌劑尤為重要。

丁香酚作為一種植物天然的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因其廣譜的抑菌活性和天然安全的特性，是一種天然抑菌劑。2022年發(fā)布食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，丁香酚可作為食品添加劑，是一種穩(wěn)定安全綠色的藥劑，在醫(yī)療、食品和微生物抑制等領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注^［11-13］。目前已有眾多研究揭示丁香酚對(duì)不同病原菌的抑菌機(jī)理和抑菌活性^［14-21］，且已有研究利用新型納米級(jí)星狀聚合陽(yáng)離子材料（StarPolycation，SPc）和丁香酚進(jìn)行組裝，提高遞送效率，經(jīng) SPc 遞送的丁香酚提高了對(duì)馬鈴薯晚疫病的防效^［20］。但丁香酚抑制細(xì)菌果膠桿菌屬的研究較少，尤其在丁香酚對(duì)P.aroidearum的抑菌活性和機(jī)理上尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者以前期在合果芋上分離的引起嚴(yán)重細(xì)菌性軟腐病的合果芋果膠桿菌（P.aroidearum）L6作為研究對(duì)象，探究丁香酚對(duì)該菌的抑菌效果并測(cè)定抑菌活性。采用微量二倍梯度稀釋法算出丁香酚對(duì)P.aroidearum L6的最小抑菌濃度（Minimal Inhibit Concentration，MIC）為800 mg/L，進(jìn)一步繪制不同濃度下丁香酚對(duì)L6生長(zhǎng)曲線，并結(jié)合核酸和可溶性蛋白質(zhì)含量、K+含量、AKP活性、ATP酶活性、胞外相對(duì)電導(dǎo)率、掃描電子顯微鏡觀察，揭示丁香酚對(duì)P.aroidearum L6的抑菌效果，以期為由P.aroidearum引起的植物軟腐病菌的藥劑篩選和田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株。

2019年7月在海南省?？谑忻捞m區(qū)海南大學(xué)海甸校區(qū)農(nóng)科實(shí)驗(yàn)基地中發(fā)現(xiàn)具有嚴(yán)重細(xì)菌性軟腐病的合果芋葉片，經(jīng)分離、純化得到P.aroidearum L6菌株，菌株保存于熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑。

Luria-Bertani液體培養(yǎng)基（LB），純度為98.5%丁香酚（上海源葉生物科技有限公司），純度為99.5%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（廣州賽國(guó)生物科技有限公司），K+離子試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、三磷酸腺苷（adenosine triphophate，ATP）酶試劑盒（南京建成生物工程研究所），純度為50%戊二醛（麥克林公司）。

1.1.3 儀器與設(shè)備。

小型5417R型冷凍離心機(jī)（Eppendorf），組合式ZQZY-CS8E型全溫振蕩型培養(yǎng)箱（上海知楚），雷磁DDS-11A電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），721N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌懸濁液制備。

在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)果膠桿菌（P.aroidearum）L6，用LB培養(yǎng)基稀釋?zhuān)蛊渚w濃度為107～108 CFU/mL備用。

1.2.2 MIC和EC 50濃度測(cè)定。

將丁香酚溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的DMSO，采用二倍稀釋法^［18］配制不同質(zhì)量濃度的丁香酚，得到終濃度為6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00、1 600.00 mg/L的丁香酚稀釋液，向5 mL無(wú)菌離心管中分別加入1.1 mL不同濃度的丁香酚稀釋液、1 mL LB培養(yǎng)基和100 μL細(xì)菌懸濁液，對(duì)照組1加入1.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% DMSO和100 μL細(xì)菌懸濁液，對(duì)照組2加入1.1 mL 無(wú)菌水和100 μL細(xì)菌懸液，在28 ℃下培養(yǎng)24 h，計(jì)算最小抑菌濃度MIC和半數(shù)有效作用濃度EC 50，重復(fù)3次。

1.2.3 可溶性蛋白和核酸含量測(cè)定。

參考“1.2.2”方法，1 mL細(xì)菌懸濁液中加入終濃度為0（對(duì)照）、0.25 MIC、0.50 MIC、1.00 MIC、2.00 MIC的丁香酚稀釋液，對(duì)照組加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的DMSO，在搖床中以180 r/min、28 ℃條件培養(yǎng)5 h 后，8 000 r/min離心15 min，取其上清液測(cè)得OD 280 nm和OD 260 nm，以O(shè)D 260 nm表示胞外核酸相對(duì)量，以O(shè)D 280 nm表示胞外可溶性蛋白相對(duì)量，重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.4 K+含量測(cè)定。

通過(guò)“1.2.3”的方法獲得上清液，用K+試劑盒檢測(cè)上清液中K+含量，重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.5 堿式磷酸酶（AKP）活力測(cè)定。

通過(guò)“1.2.3”的方法獲得上清液，用AKP試劑盒測(cè)定上清液中AKP的活力，重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.6 ATP酶活力測(cè)定。

通過(guò)“1.2.3”的方法處理細(xì)菌懸濁液，獲得上清液和沉淀，將上清液用于胞外可溶性蛋白含量測(cè)定，蛋白質(zhì)定量利用紫外（UV）吸收測(cè)定法以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估^［22］。取離心后沉淀，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)于冰浴環(huán)境下超聲粉碎20 min，用ATP酶試劑盒檢測(cè)上清液ATP酶活性，重復(fù)3次。

1.2.7 電導(dǎo)率測(cè)定。

參考“1.2.2”方法和陳夢(mèng)玲等^［23］的方法，并稍加修改，將濃度107～108 CFU/mL的細(xì)菌懸濁液中加入終濃度為0（對(duì)照）、0.25 MIC、0.50 MIC、1.00 MIC、2.00 MIC的丁香酚稀釋液，對(duì)照組加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的DMSO，在搖床中以180 r/min、28 ℃培養(yǎng)12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取培養(yǎng)液測(cè)定其電導(dǎo)率，重復(fù)3次。

1.2.8 菌體微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定。

參考“1.2.2”方法，濃度107～108 CFU/mL細(xì)菌懸濁液中加入終濃度為0（對(duì)照）、0.50 MIC和1.00 MIC的丁香酚稀釋液，對(duì)照組1加入等體積的LB培養(yǎng)基，對(duì)照組2加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的DMSO，在搖床中以180 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 h后，8 000 r/min離心15 min，去除上清液，用PBS漂洗2次，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液固定30 min，再轉(zhuǎn)移至4 ℃保存，送至武漢塞維爾生物有限公司進(jìn)行制片，掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察細(xì)菌的表面形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS Statistics 23、Origin 2018、Excel軟件整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05）和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚對(duì)果膠桿菌抑菌活性

不同質(zhì)量濃度丁香酚對(duì)果膠桿菌（P.aroidearum）L6的抑菌作用見(jiàn)表1。由表1可知，無(wú)明顯生長(zhǎng)（OD 600 nmlt;0.05）的濃度確定為最小抑菌濃度，為800 mg/L。通過(guò)數(shù)據(jù)計(jì)算得出丁香酚對(duì)P.aroidearum L6的抑菌回歸方程為y=2.128x-0.575，R2=0.919 7。且經(jīng)過(guò)對(duì)照，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5% DMSO對(duì)P.aroidearum L6無(wú)明顯抑菌作用。

2.2 丁香酚對(duì)果膠桿菌的抑菌機(jī)理

2.2.1 丁香酚對(duì)果膠桿菌可溶性蛋白質(zhì)和核酸的影響。

從表2可以看出，丁香酚處理后P.aroidearum L6的可溶性蛋白質(zhì)和核酸釋放量明顯增加，且與丁香酚稀釋液的濃度成正比，這與周倩倩等^［18］研究丁香酚使腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）內(nèi)含物泄露的結(jié)論相似。可能是因?yàn)槎∠惴优c細(xì)胞膜上結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，先降解細(xì)胞壁致使胞質(zhì)膜和膜蛋白類(lèi)受損傷，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)等內(nèi)含物泄露，使其吸光度增大。加入丁香酚的試驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異。這與Zhang等^［24］丁香酚殺菌作用的結(jié)果相似。

2.2.2 丁香酚對(duì)果膠桿菌K+含量的影響。

由圖1可知，丁香酚處理后，P.aroidearum L6的K+泄露含量顯著增加（Plt;0.05）。經(jīng)5 h丁香酚稀釋液處理后，相較于0 h，上清液中K+含量增加，且在5 h丁香酚處理后，丁香酚處理濃度越高，上清液K+泄漏量越多，這說(shuō)明丁香酚能增大細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)菌胞質(zhì)中K+的泄漏，達(dá)到抑菌效果。

2.2.3 丁香酚對(duì)果膠桿菌堿式磷酸酶（AKP）活性的影響。

堿式磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）位于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞壁被破壞，AKP外露，可以在胞外被檢測(cè)到。因此，細(xì)胞懸液中AKP的濃度可以反映細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性^［25］。從圖2可以看出，丁香酚引起P.aroidearum L6 AKP活性顯著增加（Plt;0.05）。經(jīng)丁香酚稀釋液處理5 h后，且隨著處理組溶液中丁香酚含量的增多，上清液AKP活性增大，說(shuō)明丁香酚的濃度增加能增大細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)菌中內(nèi)含物泄露，達(dá)到抑菌效果。

2.2.4 丁香酚對(duì)果膠桿菌ATP活性的影響。

Na+K+ ATP活性、Mg²⁺ ATP活性、Ca²⁺ ATP活性、Ca²⁺Mg²⁺-ATP活性分別在生物體內(nèi)催動(dòng)ATP供能，使Na+、K+、Ca²⁺和Mg²⁺濃度在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定，并影響不同的生理功能^［26］。因此不同離子泵ATP活性反映出生物體生理水平的穩(wěn)定。經(jīng)丁香酚0.50 MIC、1.00 MIC、2.00 MIC處理5 h后，P.aroidearum L6 Na+K+-ATP活性、Mg²⁺-ATP活性、Ca²⁺-ATP活性、Ca²⁺Mg²⁺-ATP活性顯著降低（Plt;0.05）（圖3），且下降程度與丁香酚的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明丁香酚含量的增多能顯著抑制ATP的活性。進(jìn)一步說(shuō)明在丁香酚破壞果膠桿菌細(xì)胞壁完整性初期，丁香酚可能通過(guò)抑制果膠桿菌的ATP供能，使果膠桿菌沒(méi)有足夠能量來(lái)復(fù)原破損的細(xì)胞壁部位。

2.2.5 丁香酚對(duì)果膠桿菌電導(dǎo)率的影響。

由圖4可知，經(jīng)丁香酚稀釋液處理初期，P.aroidearum L6 電導(dǎo)率顯著增加（Plt;0.05），且上升程度與丁香酚質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，說(shuō)明丁香酚對(duì)P.aroidearum L6的作用依賴劑量效應(yīng)。而細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)細(xì)菌菌體起到保護(hù)作用，當(dāng)菌體通透性增加時(shí)，內(nèi)含物中的電解質(zhì)泄露，增大菌體培養(yǎng)液中的電導(dǎo)率。進(jìn)一步說(shuō)明丁香酚破壞果膠桿菌細(xì)胞壁完整性，增大細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)菌中內(nèi)含物泄露，達(dá)到抑菌效果。

2.3 丁香酚對(duì)果膠桿菌菌體的影響

由圖5可知，對(duì)照組1和2的P.aroidearum L6菌體表面完整，光滑飽滿呈桿狀，進(jìn)一步說(shuō)明2.5%DMSO對(duì)P.aroidearum L6無(wú)抑制效果。經(jīng)過(guò)丁香酚處理后，菌體表面出現(xiàn)破裂凹陷，菌體整體形態(tài)畸形，部分菌體表面細(xì)胞壁剝落，內(nèi)含物泄露。說(shuō)明丁香酚破壞P.aroidearum L6菌體完整性，致使菌體內(nèi)含物泄露，不能正常生長(zhǎng)而死亡，達(dá)到抑菌效果。周倩倩等^［18］發(fā)現(xiàn)丁香酚對(duì)腐敗希瓦氏菌（S.putrefaciens）和熒光假單胞菌（P.fluorescens）也產(chǎn)生類(lèi)似細(xì)胞形態(tài)損傷。

3 討論

丁香酚作為丁香提取物中的主要成分，因其良好的抑菌效果和藥理活性，在醫(yī)藥、食品、化妝品、化工等領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景^［27］。在微生物防治上，近年來(lái)廣泛被用于真菌、細(xì)菌和線蟲(chóng)防治。潘磊慶等^［14］研究發(fā)現(xiàn)丁香酚對(duì)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）具有顯著的抑菌效果，且處理濃度在120 μL/L時(shí)櫻桃番茄的保鮮效果最好。錢(qián)衛(wèi)東等^［28］研究發(fā)現(xiàn)丁香酚可以通過(guò)破壞大腸桿菌（E.coli）的細(xì)胞結(jié)構(gòu)達(dá)到抑菌效果。段昊沅等^［29］研究發(fā)現(xiàn)丁香酚可以破壞秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）的氧化和抗氧化平衡，影響代謝作用及其體內(nèi)蛋白質(zhì)的正常合成和工作，達(dá)到毒殺效果。可見(jiàn)丁香酚廣譜的抑制活性和發(fā)展前景。

該研究通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)測(cè)出丁香酚對(duì)合果芋果膠桿菌（P.aroidearum）L6的最小抑菌濃度為800 mg/L，抑菌EC 50（50% effective concentration，）為409.33 mg/L，丁香酚稀釋液處理P.aroidearum L6的核酸和可溶性蛋白的泄露量增大，K+含量增大，AKP活性增加，ATP酶活性減弱，電導(dǎo)率增加，說(shuō)明丁香酚可能通過(guò)增大細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜完整性，降低細(xì)胞中能量供應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌中內(nèi)含物泄露，達(dá)到抑菌效果。經(jīng)過(guò)丁香酚處理前后的P.aroidearum L6菌體的SEM拍照結(jié)果，可以觀察到丁香酚破壞P.aroidearum L6菌體表面，致使菌體畸形，表面細(xì)胞壁剝落，內(nèi)含物泄露，進(jìn)一步說(shuō)明丁香酚通過(guò)破壞P.aroidearum L6菌體完整性，增大細(xì)胞膜的通透性，致使菌體內(nèi)含物泄露，達(dá)到抑菌效果。

目前，已揭示出的丁香酚對(duì)病原微生物的抑菌機(jī)理，大部分是丁香酚作用于病原微生物的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜上，造成損傷破壞和通透性的改變，引起細(xì)胞能量代謝障礙，內(nèi)含物泄露，達(dá)到抑菌效果^{［17-18，28，30］}，這與該研究結(jié)果一致。但關(guān)于丁香酚具體與病原微生物細(xì)胞上的某種位點(diǎn)相結(jié)合的分子層面機(jī)制，目前尚不明確，仍需要探究。

綜上所述，丁香酚能抑制P.aroidearum L6菌株的生長(zhǎng)，其抑菌機(jī)理可能是丁香酚作用于細(xì)胞上的某個(gè)受體，引起結(jié)構(gòu)變化，增大

細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞膜完整性，致使表面細(xì)胞壁剝落，降低細(xì)胞中能量供應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)含物泄露，達(dá)到抑菌效果。這表明丁香酚作為一種天然的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有針對(duì)P.aroidearum引起的細(xì)菌性病害的應(yīng)用前景，為P.aroidearum引起的植物病害防治提供了新的思路。

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