發(fā)酵對桔?？辔都袄砘煞钟绊懙难芯?/h1>
2025-03-03 00:00:00劉艷紅焦路何雅婷嚴欣藝郭俊婷何雯靜劉二凱劉生杰
中國調味品 2025年2期
摘要：為了研究發(fā)酵對桔?？辔逗屠砘煞值挠绊懀恼乱孕迈r桔梗為原料，采用發(fā)酵桔梗酵素的方法，通過單因素試驗探究發(fā)酵時間、發(fā)酵劑添加量、糖添加量對桔梗酵素感官評分、pH值、Fe3+還原力、總黃酮含量、桔梗皂苷D含量、還原糖含量的影響；并以桔梗皂苷D含量為指標，進行三因素三水平的正交試驗，確定桔梗發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。結果表明，桔梗發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵劑添加量0.08％、糖添加量1％。在此條件下制得的桔梗酵素呈淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特香氣，苦味明顯降低，酸味較強，微甜，口感清爽，不黏膩；與相同料液比的桔梗原汁相比，桔梗酵素中桔梗皂苷D含量下降30.7％，pH值下降51.2％，F(xiàn)e3+還原力上升17.2％，總黃酮含量上升32.3％，還原糖含量上升將近10倍。
關鍵詞：桔梗；酵素；苦味；理化指標；桔梗皂苷D
中圖分類號：TS205.5""""""文獻標志碼：A"""""文章編號：1000-9973（2025）02-0081-06
Study on Effect of Fermentation on Bitterness and Physicochemical
Components of Platycodon grandiflorus
LIU Yan-hong1，2，3， JIAO Lu2， HE Ya-ting2， YAN Xin-yi3， GUO Jun-ting3，
HE Wen-jing3， LIU Er-kai2， LIU Sheng-jie1，2，3*
（1.School of Biology and Food Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China;
2.College of Information Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China;
3.School of Biology and Food Engineering， Fuyang University of
Technology， Fuyang 236000， China）
Abstract： In order to study the effect of fermentation on the bitterness and the physicochemical components of Platycodon grandiflorus， in this paper， with fresh Platycodon grandiflorus as the raw material， the method of fermenting Platycodon grandiflorus enzyme is adopted to investigate the effects of fermentation time， fermentation agent addition amount and sugar addition amount on the sensory score， pH value， Fe3+ reducing power， total flavonoid content， Platycodon grandiflorus saponin D content and reducing sugar content of Platycodon grandiflorus enzyme through single factor test. With Platycodon grandiflorus saponin D content as the index， three-factor and three-level orthogonal test is conducted to determine the optimal process parameters for Platycodon grandiflorus fermentation. The results show that the optimal process parameters for Platycodon grandiflorus fermentation are the fermentation time of 7 d， the addition amount of fermentation agent of 0.08%， and the sugar addition amount of 1%. Under these conditions， the obtained Platycodon grandiflorus enzyme is light yellow translucent liquid， with a unique aroma of fermented Platycodon grandiflorus. The bitterness is significantly reduced， the sourness is strong， the sweetness is slight， and the taste is refreshing and not
sticky. Compared with Platycodon grandiflorus juice with the same solid-liquid ratio， "saponin D ""content in Platycodon grandiflorus enzyme decreases by 30.7%， pH value decreases by 51.2%， Fe3+"reducing power increases by 17.2%， total flavonol content increases by 32.3%， and reducing sugar content increases by nearly 10 times.
Key words： Platycodon grandiflorus; enzyme; bitterness; physicochemical index; Platycodon grandiflorus saponin D
桔梗是桔梗科桔梗屬的多年生草本植物，桔?？伤幱?，最早見于《神農本草經(jīng)》，被列為下品，味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)，有祛痰排膿之功效[1]，是我國治療咳嗽和咽喉痛的中草藥，臨床上用于治療胸悶不暢、咽痛喑啞、肺癰吐膿[2]。桔梗提取物具有消炎、抗氧化作用，添加到護膚品中可以起到美容作用，維持肌膚條件穩(wěn)定[3]。在中國東北地區(qū)及朝鮮半島等東亞地區(qū)，桔梗常鮮用或制成咸菜，是一種很好的功能性食品[4]。桔梗是藥食兩用植物，目前多用于有效成分的開發(fā)，但其味苦，限制了其在食品領域的深加工。桔梗的主要苦味物質是萜類化合物，而桔梗皂苷類成分是桔梗主要的活性成分，均屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，其中桔梗皂苷D含量較高[5]。桔梗中皂苷類成分在人體內難以吸收，可利用度低，其被腸道有益菌分解生成的苷元具有藥理作用[6]。
酵素是以一種或多種蔬菜、水果、中草藥為原料，利用植物乳桿菌等多種有益菌發(fā)酵而成，含有豐富的維生素、酶、礦物質等成分的功能性微生物發(fā)酵產品[7]，具有增強免疫力、調節(jié)腸道菌群、抗氧化等功能[8]。人體內會產生酵素，但需從食物中攝取外部酵素，酵素不足可能會引發(fā)肝臟病、糖尿病等[9]。目前市場上的酵素多以傳統(tǒng)方式生產，種類多，質量參差不齊，缺乏監(jiān)管，酵素的發(fā)展需要創(chuàng)新，多種類復配，開發(fā)出更多的功能性食品[10]。植物乳桿菌常用于發(fā)酵植物性食品，其安全性高、適用度廣，能利用糖類產生酸類[11]。乳酸菌在發(fā)酵過程中能降解皂苷類物質和酚類物質，還能提高還原糖、維生素等活性成分的含量[12-14]。因此，本研究利用植物乳桿菌（植物乳桿菌N13、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）發(fā)酵桔梗酵素，探究在植物乳桿菌的發(fā)酵作用下，新鮮桔梗的苦味和理化成分的變化，并通過測定桔梗皂苷D含量的變化，探究發(fā)酵對桔?？辔睹摮Ч挠绊?，以期解決由于桔?？辔遁^重，限制其在食品領域進行深加工應用的問題，為桔梗資源的開發(fā)利用提供技術支持。
1"材料與方法
1.1"材料與試劑
安琪酵母果蔬酵素益生菌發(fā)酵劑（含有麥芽糊精、植物乳桿菌N13、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）：江蘇微康生物科技有限公司；河南省伏牛山農家種植的3年生新鮮桔梗，桔梗水分充足，無汁液流失，無蟲蛀，無霉點，無腐壞；纖維素酶（食品級）：河南宗耀生物科技有限公司；果膠酶（食品級）：廣東康達生物科技有限公司；桔梗皂苷D標準品：成都植標化純生物技術有限公司。香草醛、硫酸、無水甲醇、蘆丁（≥95％）、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、亞鐵氰化鉀、亞甲基藍、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水葡萄糖等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。
1.2"儀器與設備
BPC-250F型電熱恒溫培養(yǎng)箱"上海一恒科學儀器有限公司；HR2062打漿機"飛利浦（中國）投資有限公司；C21-ST06型電磁爐"美的生活電器制造有限公司；PHS-25型pH計"上海儀電科學儀器股份有限公司；FA2104A型電子天平"上海精天電子儀器有限公司；UV-2600A型紫外分光光度計"上海美譜達儀器有限公司；HH-4J型數(shù)顯恒溫水浴鍋"金壇市杰瑞爾電器有限公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀"上海亞榮生化儀器廠。
1.3"桔梗酵素的制作工藝流程
清洗→去皮→殺菌→打漿→裝罐→加發(fā)酵劑、酶劑、白砂糖→密封→恒溫發(fā)酵。
1.4"操作要點
清洗：將新鮮桔梗表面的泥土沖洗干凈。
去皮：用刀具除去桔梗表皮，切段，稱重。
殺菌：用沸水將打漿機、發(fā)酵罐進行浸燙。按照比例稱取桔梗，于沸水中浸燙10 s。
打漿、裝罐：將浸燙好的桔梗放入打漿機中，加入純凈水，打成質地均勻、帶有組織纖維的桔梗漿，倒入發(fā)酵罐中。
加白糖、發(fā)酵劑、纖維素酶、果膠酶：稱取1％白糖、0.08％發(fā)酵劑、0.5％纖維素酶、0.2％果膠酶，加入發(fā)酵罐中混合均勻，留有約發(fā)酵罐1/3的容積。
密封：用保鮮膜封口提高密閉性，擰緊瓶蓋，貼上標簽，做好標記。
恒溫發(fā)酵：恒溫培養(yǎng)箱設置32 ℃，確定發(fā)酵時間96 h以上，將發(fā)酵罐密封好后放入恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵桔梗酵素。
1.5"感官評價
1.6"桔梗酵素單因素試驗設計
以感官評分、pH值、Fe3+還原力、總黃酮含量、桔梗皂苷D含量、還原糖含量為指標，桔梗發(fā)酵時間（4，5，6，7，8 d）、發(fā)酵劑添加量（0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％）、糖添加量（0%、0.5％、1％、1.5％、2％）為因素進行單因素試驗。
1.7"正交試驗設計
在單因素試驗的基礎上，運用L9（33）正交表，以桔梗皂苷D含量為考察指標，選擇發(fā)酵時間、發(fā)酵劑添加量、糖添加量為因素進行三因素三水平正交試驗，確定桔梗酵素的最佳發(fā)酵工藝。正交試驗因素水平見表2。
1.8"桔梗酵素理化指標的測定方法
1.8.1"pH值的測定
使用pH計測定桔梗酵素的pH值。取發(fā)酵好的桔梗酵素上清液于小燒杯中，pH計預熱后用pH值為4.00，6.86的緩沖溶液進行校正，再測量桔梗酵素發(fā)酵液的pH值。
1.8.2"Fe3+還原力的測定
參照張月等[15]的方法，分別移取各樣品1 mL于試管中，加入pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，再加入1％鐵氰化鉀溶液2.5 mL于50 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，然后加入10％三氯乙酸溶液2.5 mL充分混合均勻，用離心機在3 000 r/min下離心10 min，之后向試管中加入離心后的上清液2.5 mL，再向盛有上清液的試管中加入2.5 mL蒸餾水，再加入0.1％三氯化鐵溶液0.5 mL，在常溫環(huán)境下反應5 min，然后使用紫外可見分光光度計設定波長為700 nm，在比色皿中加入樣品溶液，測定吸光度。同時做空白對照組，即不加樣品，加入1 mL蒸餾水。每組試驗重復3次。按照公式（1）計算還原能力：
還原能力（%）=（A－A0）×100%。（1）
式中：A為樣品的吸光度；A0為空白組的吸光度。
1.8.3"總黃酮含量的測定
采用硝酸鋁分光光度法[16]。精確制備不同濃度的蘆丁標準品溶液并進行前期反應，然后在510 nm波長處測定吸光度值并繪制標準曲線。以不加蘆丁對照品溶液的平行樣品作為空白，取1 mL桔梗酵素上清液于試管中，加蒸餾水稀釋，再吸取1 mL稀釋過的樣液于試管中，加入70％乙醇溶液1 mL，按照上述方法測定，若吸光度值過高，則將樣品稀釋，由標準曲線計算出樣品中總黃酮的含量。
1.8.4"還原糖含量的測定
采用直接滴定法測定樣品中還原糖的含量[17]。按照公式（2）計算還原糖含量：
X=Am×V250×1 000×100。（2）
式中：X為樣品溶液中還原糖含量，g/100 g；A為堿性酒石酸銅溶液（甲、乙液各5 mL）相當于葡萄糖標準溶液的質量，mg；m為樣品的質量，g；V為平均消耗樣品溶液的體積，mL。
1.8.5"桔梗皂苷D含量的測定
采用香草醛-濃硫酸法[18]。將4.4 mg桔梗皂苷D標準品加水溶解并繼續(xù)加水于10 mL容量瓶中定容。取桔梗酵素樣品分別稀釋2倍，取1 mL于具塞試管中，采用旋轉蒸發(fā)儀于70 ℃水浴蒸干水分，之后精確加入0.5 mL的10％香草醛試液、4.5 mL的60％硫酸，充分搖勻，于60 ℃水浴鍋中加熱15 min，冰水浴冷卻3 min，同時以不加桔梗酵素的平行樣品作為空白，紫外掃描，確定最大吸收波長為472 nm，再取上述標準品0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL分別測定吸光度，以桔梗皂苷D含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
2"結果與分析
2.1"標準曲線的繪制
蘆丁標準品標準曲線和桔梗皂苷D標準品標準曲線見圖1，測定總黃酮類含量的標準曲線方程為y=9.241 4x+0.035 4（R2=0.989 6），測定桔梗皂苷D含量的標準曲線方程為y=0.003x+0.064 8（R2=0.995 3）。
2.2"單因素試驗結果與分析
2.2.1"發(fā)酵時間對桔梗酵素感官評分、理化指標和活性物質的影響
桔梗酵素成品為淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特氣味，酸味較酸，可以接受，苦味與原汁相比有所降低，但仍具有較濃的苦味，靜置后有少許沉淀。由圖2中a可知，在發(fā)酵7 d時感官評分最高，為65分。隨著發(fā)酵時間的增加，桔梗皂苷D含量下降并逐漸趨于平緩，說明發(fā)酵菌在經(jīng)過酶系活躍、代謝旺盛的指數(shù)生長期后，達到穩(wěn)定期[19]?？衫玫臓I養(yǎng)物逐漸減少，代謝產物積累，C/N比值、氧化還原電勢等理化條件也不適宜菌體的生長繁殖，酶活性減弱，對桔梗皂苷D的分解能力減弱。因此，桔梗皂苷D含量減少緩慢。由圖2中b可知，隨著發(fā)酵時間的延長，桔梗酵素中總黃酮含量呈上升趨勢，還原力逐漸增加，說明發(fā)酵菌使桔梗中的總黃酮更大程度地釋放出來，且不斷積累，推斷還原力的增加與總黃酮含量的增加有關。由圖2中c可知，隨著發(fā)酵時間的增加，還原糖含量逐漸降低，說明發(fā)酵菌在糖化后利用葡萄糖進行糖酵解產生能量和乳酸。桔梗酵素的pH值持續(xù)降低，這是因為桔梗酵素發(fā)酵過程中經(jīng)過適應期后，發(fā)酵菌之間有協(xié)同共生作用，產酸快[20]。綜上可知，當發(fā)酵時間在6～8 d范圍內時，桔梗酵素的感官評分、理化指標和活性物質較好。
2.2.2"發(fā)酵劑添加量對桔梗酵素感官評分、理化指標和活性物質的影響
由圖3中a可知，當發(fā)酵劑添加量為0.08％時，感官評分最高，為65分，桔梗皂苷D含量最低，當發(fā)酵劑添加量為0.04％～0.08％時，桔梗皂苷D含量逐漸下降，當發(fā)酵劑添加量為0.08％～0.12％時，桔梗皂苷D含量逐漸上升，說明當發(fā)酵劑添加量＜0.08％時，營養(yǎng)物質充足，桔梗皂苷D被分解。當發(fā)酵劑添加量＞0.08％時，發(fā)酵罐剩余空間大小和料液比等不適宜更多的菌生長，發(fā)酵菌之間的相互作用和生長關系等也受到影響。由圖3中b可知，當發(fā)酵劑添加量為0.08％時，總黃酮含量和還原力都最大，分別為0.105 mg/mL、72.1％，此時發(fā)酵液中的菌數(shù)量適當，分解產物多，代謝消耗較少，總黃酮提取率較大，還原力與總黃酮含量成正比。由圖3中c可知，當發(fā)酵劑添加量為0.04％～0.08％時，還原糖含量逐漸上升，當發(fā)酵劑添加量為0.08％～0.12％時，還原糖含量呈下降趨勢。隨著發(fā)酵劑添加量的增加，桔梗酵素的pH值先明顯下降后趨于平緩，說明發(fā)酵菌數(shù)量增多的同時，會維持發(fā)酵液中pH值的穩(wěn)定。發(fā)酵菌數(shù)量適當時，糖化作用產生的還原糖供發(fā)酵菌生長繁殖，發(fā)酵菌數(shù)量增多，還原糖消耗較多。綜上可知，當發(fā)酵劑添加量在0.06％～0.10%范圍內時，感官評分、理化指標和活性物質較好。
2.2.3"糖添加量對桔梗酵素感官評分、理化指標和活性物質的影響
由圖4中a可知，隨著糖添加量的增加，桔梗酵素的感官評分逐漸上升，苦味降低，糖的添加使發(fā)酵菌更好地生長，同時也增加了甜味，掩蓋了部分苦味。當糖添加量為0%～1％時，桔梗皂苷D含量呈下降趨勢，當糖添加量為1％～2％時，桔梗皂苷D含量呈上升趨勢。當糖添加量＜1％時，促進發(fā)酵菌生長代謝，桔梗皂苷D被菌產生的酶類分解。當糖添加量＞1％時，發(fā)酵菌增多，桔梗皂苷D含量增加，可能與發(fā)酵菌產生的β-葡萄糖苷酶有關，β-葡萄糖苷酶可將桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3轉化成桔梗皂苷D[21]。由圖4中b可知，當糖添加量為1％時，總黃酮含量最高，F(xiàn)e3+還原力最大，分別為0.106 mg/mL、73.3％。糖的加入有利于發(fā)酵菌的生長，但糖添加量越多，滲透壓增高，總黃酮分解能力變弱，F(xiàn)e3+還原力也隨之降低。由圖4中c可知，隨著糖添加量的增加，桔梗酵素中還原糖含量增加，pH值呈下降趨勢。綜上可知，當糖添加量在0.5%～1.5％范圍內時，感官評分、理化指標和活性物質較好。
2.3"正交試驗結果與分析
由于桔梗皂苷D含量越低，桔梗酵素的苦味越不明顯，因此，優(yōu)化試驗時選取較小的K值。由表3可知，桔梗酵素的最佳工藝組合為A2B2C2，即發(fā)酵時間為7 d，發(fā)酵劑添加量為0.08％，糖添加量為1％。由極差R分析可知，各因素對桔梗酵素中桔梗皂苷D含量影響的主次順序為Bgt;Cgt;A，即發(fā)酵劑添加量對桔梗酵素中桔梗皂苷D含量的影響最大，糖添加量次之，發(fā)酵時間對桔梗酵素中桔梗皂苷D含量的影響最小。
2.4"最佳工藝產物分析
最佳工藝制成的桔梗酵素成品感官評分為66分，桔梗酵素與桔梗原汁的理化指標和活性物質對比見表4。
由表4可知，與桔梗原汁相比，桔梗酵素成品呈淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特氣味，苦味明顯降低，口感清爽，不黏膩，酸味較強，能接受，有少許沉淀物；在理化指標和活性物質方面，與桔梗原汁相比，桔梗酵素的pH值下降了3.32，F(xiàn)e3+還原力上升了17.2％，總黃酮含量上升了32.3％，桔梗皂苷D含量降低了30.7％，還原糖含量上升了將近10倍。
3"結論與討論
桔梗酵素發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵劑添加量0.08％、糖添加量1％。在此條件下，得到的桔梗酵素呈淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特香氣，苦味明顯降低，酸味較強，微甜，口感清爽，不黏膩。與相同料液比的原汁相比，桔梗皂苷D含量降低了30.7％，還原力上升了17.2％，總黃酮含量上升了32.3％，還原糖含量上升了將近10倍，這與曾玲等[22]研究的將桔梗提取液分別接種貝萊斯芽孢桿菌和庫德里阿茲威畢赤酵母菌，發(fā)酵后的桔梗提取液中總黃酮含量顯著高于未發(fā)酵組的結果相一致。
本試驗對桔梗中苦味脫除進行研究，利用植物乳桿菌、保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌等發(fā)酵桔梗酵素，為桔梗脫苦探索新的方法。但是本研究尚未對桔梗酵素成品的抗氧化活性和抑菌作用效果以及對人和動物機體的生理生化代謝影響進行深入研究。因此，桔梗酵素成品的有效成分和功效還需進一步研究分析。
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摘要：為了研究發(fā)酵對桔?？辔逗屠砘煞值挠绊懀恼乱孕迈r桔梗為原料，采用發(fā)酵桔梗酵素的方法，通過單因素試驗探究發(fā)酵時間、發(fā)酵劑添加量、糖添加量對桔梗酵素感官評分、pH值、Fe3+還原力、總黃酮含量、桔梗皂苷D含量、還原糖含量的影響；并以桔梗皂苷D含量為指標，進行三因素三水平的正交試驗，確定桔梗發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。結果表明，桔梗發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵劑添加量0.08％、糖添加量1％。在此條件下制得的桔梗酵素呈淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特香氣，苦味明顯降低，酸味較強，微甜，口感清爽，不黏膩；與相同料液比的桔梗原汁相比，桔梗酵素中桔梗皂苷D含量下降30.7％，pH值下降51.2％，F(xiàn)e3+還原力上升17.2％，總黃酮含量上升32.3％，還原糖含量上升將近10倍。
關鍵詞：桔梗；酵素；苦味；理化指標；桔梗皂苷D
中圖分類號：TS205.5""""""文獻標志碼：A"""""文章編號：1000-9973（2025）02-0081-06
Study on Effect of Fermentation on Bitterness and Physicochemical
Components of Platycodon grandiflorus
LIU Yan-hong1，2，3， JIAO Lu2， HE Ya-ting2， YAN Xin-yi3， GUO Jun-ting3，
HE Wen-jing3， LIU Er-kai2， LIU Sheng-jie1，2，3*
（1.School of Biology and Food Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China;
2.College of Information Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China;
3.School of Biology and Food Engineering， Fuyang University of
Technology， Fuyang 236000， China）
Abstract： In order to study the effect of fermentation on the bitterness and the physicochemical components of Platycodon grandiflorus， in this paper， with fresh Platycodon grandiflorus as the raw material， the method of fermenting Platycodon grandiflorus enzyme is adopted to investigate the effects of fermentation time， fermentation agent addition amount and sugar addition amount on the sensory score， pH value， Fe3+ reducing power， total flavonoid content， Platycodon grandiflorus saponin D content and reducing sugar content of Platycodon grandiflorus enzyme through single factor test. With Platycodon grandiflorus saponin D content as the index， three-factor and three-level orthogonal test is conducted to determine the optimal process parameters for Platycodon grandiflorus fermentation. The results show that the optimal process parameters for Platycodon grandiflorus fermentation are the fermentation time of 7 d， the addition amount of fermentation agent of 0.08%， and the sugar addition amount of 1%. Under these conditions， the obtained Platycodon grandiflorus enzyme is light yellow translucent liquid， with a unique aroma of fermented Platycodon grandiflorus. The bitterness is significantly reduced， the sourness is strong， the sweetness is slight， and the taste is refreshing and not
sticky. Compared with Platycodon grandiflorus juice with the same solid-liquid ratio， "saponin D ""content in Platycodon grandiflorus enzyme decreases by 30.7%， pH value decreases by 51.2%， Fe3+"reducing power increases by 17.2%， total flavonol content increases by 32.3%， and reducing sugar content increases by nearly 10 times.
Key words： Platycodon grandiflorus; enzyme; bitterness; physicochemical index; Platycodon grandiflorus saponin D
桔梗是桔梗科桔梗屬的多年生草本植物，桔?？伤幱?，最早見于《神農本草經(jīng)》，被列為下品，味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)，有祛痰排膿之功效[1]，是我國治療咳嗽和咽喉痛的中草藥，臨床上用于治療胸悶不暢、咽痛喑啞、肺癰吐膿[2]。桔梗提取物具有消炎、抗氧化作用，添加到護膚品中可以起到美容作用，維持肌膚條件穩(wěn)定[3]。在中國東北地區(qū)及朝鮮半島等東亞地區(qū)，桔梗常鮮用或制成咸菜，是一種很好的功能性食品[4]。桔梗是藥食兩用植物，目前多用于有效成分的開發(fā)，但其味苦，限制了其在食品領域的深加工。桔梗的主要苦味物質是萜類化合物，而桔梗皂苷類成分是桔梗主要的活性成分，均屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，其中桔梗皂苷D含量較高[5]。桔梗中皂苷類成分在人體內難以吸收，可利用度低，其被腸道有益菌分解生成的苷元具有藥理作用[6]。
酵素是以一種或多種蔬菜、水果、中草藥為原料，利用植物乳桿菌等多種有益菌發(fā)酵而成，含有豐富的維生素、酶、礦物質等成分的功能性微生物發(fā)酵產品[7]，具有增強免疫力、調節(jié)腸道菌群、抗氧化等功能[8]。人體內會產生酵素，但需從食物中攝取外部酵素，酵素不足可能會引發(fā)肝臟病、糖尿病等[9]。目前市場上的酵素多以傳統(tǒng)方式生產，種類多，質量參差不齊，缺乏監(jiān)管，酵素的發(fā)展需要創(chuàng)新，多種類復配，開發(fā)出更多的功能性食品[10]。植物乳桿菌常用于發(fā)酵植物性食品，其安全性高、適用度廣，能利用糖類產生酸類[11]。乳酸菌在發(fā)酵過程中能降解皂苷類物質和酚類物質，還能提高還原糖、維生素等活性成分的含量[12-14]。因此，本研究利用植物乳桿菌（植物乳桿菌N13、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）發(fā)酵桔梗酵素，探究在植物乳桿菌的發(fā)酵作用下，新鮮桔梗的苦味和理化成分的變化，并通過測定桔梗皂苷D含量的變化，探究發(fā)酵對桔?？辔睹摮Ч挠绊?，以期解決由于桔?？辔遁^重，限制其在食品領域進行深加工應用的問題，為桔梗資源的開發(fā)利用提供技術支持。
1"材料與方法
1.1"材料與試劑
安琪酵母果蔬酵素益生菌發(fā)酵劑（含有麥芽糊精、植物乳桿菌N13、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）：江蘇微康生物科技有限公司；河南省伏牛山農家種植的3年生新鮮桔梗，桔梗水分充足，無汁液流失，無蟲蛀，無霉點，無腐壞；纖維素酶（食品級）：河南宗耀生物科技有限公司；果膠酶（食品級）：廣東康達生物科技有限公司；桔梗皂苷D標準品：成都植標化純生物技術有限公司。香草醛、硫酸、無水甲醇、蘆丁（≥95％）、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、亞鐵氰化鉀、亞甲基藍、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水葡萄糖等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。
1.2"儀器與設備
BPC-250F型電熱恒溫培養(yǎng)箱"上海一恒科學儀器有限公司；HR2062打漿機"飛利浦（中國）投資有限公司；C21-ST06型電磁爐"美的生活電器制造有限公司；PHS-25型pH計"上海儀電科學儀器股份有限公司；FA2104A型電子天平"上海精天電子儀器有限公司；UV-2600A型紫外分光光度計"上海美譜達儀器有限公司；HH-4J型數(shù)顯恒溫水浴鍋"金壇市杰瑞爾電器有限公司；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀"上海亞榮生化儀器廠。
1.3"桔梗酵素的制作工藝流程
清洗→去皮→殺菌→打漿→裝罐→加發(fā)酵劑、酶劑、白砂糖→密封→恒溫發(fā)酵。
1.4"操作要點
清洗：將新鮮桔梗表面的泥土沖洗干凈。
去皮：用刀具除去桔梗表皮，切段，稱重。
殺菌：用沸水將打漿機、發(fā)酵罐進行浸燙。按照比例稱取桔梗，于沸水中浸燙10 s。
打漿、裝罐：將浸燙好的桔梗放入打漿機中，加入純凈水，打成質地均勻、帶有組織纖維的桔梗漿，倒入發(fā)酵罐中。
加白糖、發(fā)酵劑、纖維素酶、果膠酶：稱取1％白糖、0.08％發(fā)酵劑、0.5％纖維素酶、0.2％果膠酶，加入發(fā)酵罐中混合均勻，留有約發(fā)酵罐1/3的容積。
密封：用保鮮膜封口提高密閉性，擰緊瓶蓋，貼上標簽，做好標記。
恒溫發(fā)酵：恒溫培養(yǎng)箱設置32 ℃，確定發(fā)酵時間96 h以上，將發(fā)酵罐密封好后放入恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵桔梗酵素。
1.5"感官評價
1.6"桔梗酵素單因素試驗設計
以感官評分、pH值、Fe3+還原力、總黃酮含量、桔梗皂苷D含量、還原糖含量為指標，桔梗發(fā)酵時間（4，5，6，7，8 d）、發(fā)酵劑添加量（0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％）、糖添加量（0%、0.5％、1％、1.5％、2％）為因素進行單因素試驗。
1.7"正交試驗設計
在單因素試驗的基礎上，運用L9（33）正交表，以桔梗皂苷D含量為考察指標，選擇發(fā)酵時間、發(fā)酵劑添加量、糖添加量為因素進行三因素三水平正交試驗，確定桔梗酵素的最佳發(fā)酵工藝。正交試驗因素水平見表2。
1.8"桔梗酵素理化指標的測定方法
1.8.1"pH值的測定
使用pH計測定桔梗酵素的pH值。取發(fā)酵好的桔梗酵素上清液于小燒杯中，pH計預熱后用pH值為4.00，6.86的緩沖溶液進行校正，再測量桔梗酵素發(fā)酵液的pH值。
1.8.2"Fe3+還原力的測定
參照張月等[15]的方法，分別移取各樣品1 mL于試管中，加入pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，再加入1％鐵氰化鉀溶液2.5 mL于50 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，然后加入10％三氯乙酸溶液2.5 mL充分混合均勻，用離心機在3 000 r/min下離心10 min，之后向試管中加入離心后的上清液2.5 mL，再向盛有上清液的試管中加入2.5 mL蒸餾水，再加入0.1％三氯化鐵溶液0.5 mL，在常溫環(huán)境下反應5 min，然后使用紫外可見分光光度計設定波長為700 nm，在比色皿中加入樣品溶液，測定吸光度。同時做空白對照組，即不加樣品，加入1 mL蒸餾水。每組試驗重復3次。按照公式（1）計算還原能力：
還原能力（%）=（A－A0）×100%。（1）
式中：A為樣品的吸光度；A0為空白組的吸光度。
1.8.3"總黃酮含量的測定
采用硝酸鋁分光光度法[16]。精確制備不同濃度的蘆丁標準品溶液并進行前期反應，然后在510 nm波長處測定吸光度值并繪制標準曲線。以不加蘆丁對照品溶液的平行樣品作為空白，取1 mL桔梗酵素上清液于試管中，加蒸餾水稀釋，再吸取1 mL稀釋過的樣液于試管中，加入70％乙醇溶液1 mL，按照上述方法測定，若吸光度值過高，則將樣品稀釋，由標準曲線計算出樣品中總黃酮的含量。
1.8.4"還原糖含量的測定
采用直接滴定法測定樣品中還原糖的含量[17]。按照公式（2）計算還原糖含量：
X=Am×V250×1 000×100。（2）
式中：X為樣品溶液中還原糖含量，g/100 g；A為堿性酒石酸銅溶液（甲、乙液各5 mL）相當于葡萄糖標準溶液的質量，mg；m為樣品的質量，g；V為平均消耗樣品溶液的體積，mL。
1.8.5"桔梗皂苷D含量的測定
采用香草醛-濃硫酸法[18]。將4.4 mg桔梗皂苷D標準品加水溶解并繼續(xù)加水于10 mL容量瓶中定容。取桔梗酵素樣品分別稀釋2倍，取1 mL于具塞試管中，采用旋轉蒸發(fā)儀于70 ℃水浴蒸干水分，之后精確加入0.5 mL的10％香草醛試液、4.5 mL的60％硫酸，充分搖勻，于60 ℃水浴鍋中加熱15 min，冰水浴冷卻3 min，同時以不加桔梗酵素的平行樣品作為空白，紫外掃描，確定最大吸收波長為472 nm，再取上述標準品0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL分別測定吸光度，以桔梗皂苷D含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
2"結果與分析
2.1"標準曲線的繪制
蘆丁標準品標準曲線和桔梗皂苷D標準品標準曲線見圖1，測定總黃酮類含量的標準曲線方程為y=9.241 4x+0.035 4（R2=0.989 6），測定桔梗皂苷D含量的標準曲線方程為y=0.003x+0.064 8（R2=0.995 3）。
2.2"單因素試驗結果與分析
2.2.1"發(fā)酵時間對桔梗酵素感官評分、理化指標和活性物質的影響
桔梗酵素成品為淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特氣味，酸味較酸，可以接受，苦味與原汁相比有所降低，但仍具有較濃的苦味，靜置后有少許沉淀。由圖2中a可知，在發(fā)酵7 d時感官評分最高，為65分。隨著發(fā)酵時間的增加，桔梗皂苷D含量下降并逐漸趨于平緩，說明發(fā)酵菌在經(jīng)過酶系活躍、代謝旺盛的指數(shù)生長期后，達到穩(wěn)定期[19]?？衫玫臓I養(yǎng)物逐漸減少，代謝產物積累，C/N比值、氧化還原電勢等理化條件也不適宜菌體的生長繁殖，酶活性減弱，對桔梗皂苷D的分解能力減弱。因此，桔梗皂苷D含量減少緩慢。由圖2中b可知，隨著發(fā)酵時間的延長，桔梗酵素中總黃酮含量呈上升趨勢，還原力逐漸增加，說明發(fā)酵菌使桔梗中的總黃酮更大程度地釋放出來，且不斷積累，推斷還原力的增加與總黃酮含量的增加有關。由圖2中c可知，隨著發(fā)酵時間的增加，還原糖含量逐漸降低，說明發(fā)酵菌在糖化后利用葡萄糖進行糖酵解產生能量和乳酸。桔梗酵素的pH值持續(xù)降低，這是因為桔梗酵素發(fā)酵過程中經(jīng)過適應期后，發(fā)酵菌之間有協(xié)同共生作用，產酸快[20]。綜上可知，當發(fā)酵時間在6～8 d范圍內時，桔梗酵素的感官評分、理化指標和活性物質較好。
2.2.2"發(fā)酵劑添加量對桔梗酵素感官評分、理化指標和活性物質的影響
由圖3中a可知，當發(fā)酵劑添加量為0.08％時，感官評分最高，為65分，桔梗皂苷D含量最低，當發(fā)酵劑添加量為0.04％～0.08％時，桔梗皂苷D含量逐漸下降，當發(fā)酵劑添加量為0.08％～0.12％時，桔梗皂苷D含量逐漸上升，說明當發(fā)酵劑添加量＜0.08％時，營養(yǎng)物質充足，桔梗皂苷D被分解。當發(fā)酵劑添加量＞0.08％時，發(fā)酵罐剩余空間大小和料液比等不適宜更多的菌生長，發(fā)酵菌之間的相互作用和生長關系等也受到影響。由圖3中b可知，當發(fā)酵劑添加量為0.08％時，總黃酮含量和還原力都最大，分別為0.105 mg/mL、72.1％，此時發(fā)酵液中的菌數(shù)量適當，分解產物多，代謝消耗較少，總黃酮提取率較大，還原力與總黃酮含量成正比。由圖3中c可知，當發(fā)酵劑添加量為0.04％～0.08％時，還原糖含量逐漸上升，當發(fā)酵劑添加量為0.08％～0.12％時，還原糖含量呈下降趨勢。隨著發(fā)酵劑添加量的增加，桔梗酵素的pH值先明顯下降后趨于平緩，說明發(fā)酵菌數(shù)量增多的同時，會維持發(fā)酵液中pH值的穩(wěn)定。發(fā)酵菌數(shù)量適當時，糖化作用產生的還原糖供發(fā)酵菌生長繁殖，發(fā)酵菌數(shù)量增多，還原糖消耗較多。綜上可知，當發(fā)酵劑添加量在0.06％～0.10%范圍內時，感官評分、理化指標和活性物質較好。
2.2.3"糖添加量對桔梗酵素感官評分、理化指標和活性物質的影響
由圖4中a可知，隨著糖添加量的增加，桔梗酵素的感官評分逐漸上升，苦味降低，糖的添加使發(fā)酵菌更好地生長，同時也增加了甜味，掩蓋了部分苦味。當糖添加量為0%～1％時，桔梗皂苷D含量呈下降趨勢，當糖添加量為1％～2％時，桔梗皂苷D含量呈上升趨勢。當糖添加量＜1％時，促進發(fā)酵菌生長代謝，桔梗皂苷D被菌產生的酶類分解。當糖添加量＞1％時，發(fā)酵菌增多，桔梗皂苷D含量增加，可能與發(fā)酵菌產生的β-葡萄糖苷酶有關，β-葡萄糖苷酶可將桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3轉化成桔梗皂苷D[21]。由圖4中b可知，當糖添加量為1％時，總黃酮含量最高，F(xiàn)e3+還原力最大，分別為0.106 mg/mL、73.3％。糖的加入有利于發(fā)酵菌的生長，但糖添加量越多，滲透壓增高，總黃酮分解能力變弱，F(xiàn)e3+還原力也隨之降低。由圖4中c可知，隨著糖添加量的增加，桔梗酵素中還原糖含量增加，pH值呈下降趨勢。綜上可知，當糖添加量在0.5%～1.5％范圍內時，感官評分、理化指標和活性物質較好。
2.3"正交試驗結果與分析
由于桔梗皂苷D含量越低，桔梗酵素的苦味越不明顯，因此，優(yōu)化試驗時選取較小的K值。由表3可知，桔梗酵素的最佳工藝組合為A2B2C2，即發(fā)酵時間為7 d，發(fā)酵劑添加量為0.08％，糖添加量為1％。由極差R分析可知，各因素對桔梗酵素中桔梗皂苷D含量影響的主次順序為Bgt;Cgt;A，即發(fā)酵劑添加量對桔梗酵素中桔梗皂苷D含量的影響最大，糖添加量次之，發(fā)酵時間對桔梗酵素中桔梗皂苷D含量的影響最小。
2.4"最佳工藝產物分析
最佳工藝制成的桔梗酵素成品感官評分為66分，桔梗酵素與桔梗原汁的理化指標和活性物質對比見表4。
由表4可知，與桔梗原汁相比，桔梗酵素成品呈淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特氣味，苦味明顯降低，口感清爽，不黏膩，酸味較強，能接受，有少許沉淀物；在理化指標和活性物質方面，與桔梗原汁相比，桔梗酵素的pH值下降了3.32，F(xiàn)e3+還原力上升了17.2％，總黃酮含量上升了32.3％，桔梗皂苷D含量降低了30.7％，還原糖含量上升了將近10倍。
3"結論與討論
桔梗酵素發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵劑添加量0.08％、糖添加量1％。在此條件下，得到的桔梗酵素呈淡黃色半透明液體，有桔梗發(fā)酵后的獨特香氣，苦味明顯降低，酸味較強，微甜，口感清爽，不黏膩。與相同料液比的原汁相比，桔梗皂苷D含量降低了30.7％，還原力上升了17.2％，總黃酮含量上升了32.3％，還原糖含量上升了將近10倍，這與曾玲等[22]研究的將桔梗提取液分別接種貝萊斯芽孢桿菌和庫德里阿茲威畢赤酵母菌，發(fā)酵后的桔梗提取液中總黃酮含量顯著高于未發(fā)酵組的結果相一致。
本試驗對桔梗中苦味脫除進行研究，利用植物乳桿菌、保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌等發(fā)酵桔梗酵素，為桔梗脫苦探索新的方法。但是本研究尚未對桔梗酵素成品的抗氧化活性和抑菌作用效果以及對人和動物機體的生理生化代謝影響進行深入研究。因此，桔梗酵素成品的有效成分和功效還需進一步研究分析。
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