日本平腹小蜂滯育幼蟲的表型研究

摘要

日本平腹小蜂Anastatus japonicus Ashmead是多種蝽類害蟲的優(yōu)勢卵寄生蜂， 以老熟幼蟲滯育。本研究比較了日本平腹小蜂非滯育、滯育、滯育解除老熟幼蟲的體重、體長、體寬及體色的變化， 并通過尼羅紅染色來觀察滯育幼蟲體內(nèi)脂滴的變化。結(jié)果表明： 滯育期間老熟幼蟲體重逐漸減輕， 體長逐漸縮短， 體寬無顯著變化， 體色灰度值呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢;相較于非滯育個體， 隨著滯育時間的延長，滯育老熟幼蟲體腔內(nèi)脂滴數(shù)量逐漸減少， 同時出現(xiàn)表皮附近脂滴聚集現(xiàn)象， 表明脂質(zhì)是日本平腹小蜂滯育期間主要的能源物質(zhì)， 隨著滯育時間延長， 脂質(zhì)被逐漸消耗。而脂滴向日本平腹小蜂老熟幼蟲表皮附近大量聚集， 有助于增強滯育個體的抗凍能力。本文為深入研究日本平腹小蜂滯育機制奠定基礎。

關(guān)鍵詞

日本平腹小蜂;" 滯育;" 生物學表型;" 脂滴

中圖分類號：

S 436.67

文獻標識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024326

收稿日期：" 20240614""" 修訂日期：" 20240815

基金項目：

國家重點研發(fā)計劃（2023YFD1400600）;國家自然科學基金青年基金（32001968）;國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-32-09）;廣東省科技計劃（2023B0202010010）;廣東省農(nóng)業(yè)科學院“青年研究員項目” （R2023PY-QY007）

致" 謝：" 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

zhaocan@gdaas.cn

#

為并列第一作者

Phenotypic study on diapause larvae of Anastatus japonicus Ashmead

XIAO Junjian1，2#，" YUAN Longyu1#，" XIA Yue1，2，" LI Dunsong1，nbsp; ZHAO Can1*

（1. Institute of Plant Protection， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of Green Prevention and

Control on Fruits and Vegetables in South China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Guangdong Provincial Key

Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou" 510640， China; 2. State Key Laboratory of Green

Pesticide， College of Plant Protection， South China Agricultural University， Guangzhou" 510642， China）

Abstract

Anastatus japonicus Ashmead is a dominant egg parasitic wasp for various bug pests， entering diapause as mature larvae. In this study， the body weight， body length， body width and body color of mature larvae of A.japonicus in non-diapause， diapause and diapause-terminated states were measured. Additionally， the changes of lipid droplets within the larvae were observed using Nile red staining. The results showed a gradual decrease in body weight and grayscale value of body color during diapause， while the body length shortened with no significant change in body width. Compared to non-diapause larvae， the lipid droplets in the body cavity of diapause larvae gradually decreased with the prolongation of diapause period， along with an accumulation of lipid droplets near the body surface. These results indicate that lipids serve as the main energy source during diapause of A.japonicus， and are progressively consumed over time. The accumulation of lipid droplets near the larval body surface likely aids in enhancing the freezing resistance of diapause individuals. This study lays a foundation for further research into the diapause mechanism of A.japonicus.

Key words

Anastatus japonicus;" diapause;" biological phenotype;" lipid droplets

日本平腹小蜂Anastatus japonicus Ashmead隸屬于膜翅目Hymenoptera旋小蜂科Eupelmidae， 是我國農(nóng)林害蟲生物防治的一種重要卵寄生蜂［13］， 能夠寄生多種果樹及林業(yè)害蟲， 如茶翅蝽Halyomorpha halys、荔枝蝽Tessaratoma papillosa和點蜂緣蝽Riptortus pedestris等［46］。滯育是昆蟲為度過不利環(huán)境條件， 而進化出的一種生存策略［78］。在天敵昆蟲產(chǎn)品儲存中， 利用昆蟲滯育的生物學習性來延長寄生蜂產(chǎn)品的貨架期是最經(jīng)濟可靠的手段［9］。日本平腹小蜂能夠以柞蠶Antheraea pernyi卵作為替代寄主進行大批量生產(chǎn)， 并通過田間大規(guī)模釋放來有效地控制害蟲［10］。趙燦等對誘導日本平腹小蜂滯育和解除滯育的環(huán)境因子進行了系統(tǒng)研究， 發(fā)現(xiàn)低溫（17℃）、短光照（L∥D=10 h∥14 h）可誘導日本平腹小蜂以老熟幼蟲進入滯育， 而高溫（27℃）、長光照（L∥D=16 h∥8 h）可解除滯育［1， 11］。昆蟲的滯育常伴隨著一系列的生理和生化特征變化， 部分昆蟲出現(xiàn)顯著的滯育表型。研究昆蟲的滯育表型有利于解析昆蟲滯育過程的生理和生化的變化， 為滯育調(diào)控分子機制的研究奠定基礎。

不同昆蟲在滯育階段會發(fā)生不同的外在生物學和內(nèi)在生理生化的變化， 且部分明顯的表型特征被作為昆蟲進入滯育或滯育解除的有效判斷依據(jù)。如棉鈴蟲Helicoverpa armigera滯育前期大量合成海藻糖、山梨醇等抗凍物質(zhì)及脂肪、糖原等能源物質(zhì)， 蛹在滯育期間逐漸積累血糖以增強抗寒能力［1214］;同時棉鈴蟲化蛹后眼點會發(fā)生特殊變化， 該特征被作為判斷其進入滯育的直接表型［1516］。昆蟲滯育期間維持低水平的生理代謝活動， 部分昆蟲由于環(huán)境因子的改變使得其在滯育過程中出現(xiàn)顯著的體色變化。滯育期間七星瓢蟲Coccinella septempunctata 能量消耗減少， 活動能力減弱， 鞘翅顏色偏淺［17］;牧草盲蝽Lygus pratensis成蟲滯育越冬期間體色產(chǎn)生多種變化［18］。大多數(shù)昆蟲在滯育前期會儲存大量脂類物質(zhì)作為滯育期間的能量來源， 如七星瓢蟲的滯育成蟲腹部脂肪含量顯著增加［19］。目前在日本平腹小蜂幼蟲滯育生理生化表型研究中， 僅有劉子欣等發(fā)現(xiàn)滯育老熟幼蟲顯著積累脂類、甘油三酯、糖原等能量物質(zhì)以及山梨醇等低溫保護物質(zhì)， 滯育個體的抗氧化能力顯著增強［20］， 但其他表型研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究擬對日本平腹小蜂滯育期間的體型、體色和脂滴變化進行研究， 研究結(jié)果將為深入研究日本平腹小蜂滯育調(diào)控機制奠定基礎。

1" 材料與方法

1.1" 供試蟲源和室內(nèi)飼養(yǎng)方法

供試日本平腹小蜂種群采自北京地區(qū)被寄生的茶翅蝽卵塊， 由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部-CABI生物安全聯(lián)合實驗室提供， 在室內(nèi)以柞蠶卵為替代寄主繁殖多代， 建立穩(wěn)定的室內(nèi)種群， 作為供試蟲源。

日本平腹小蜂在養(yǎng)蟲盒（320 mm×252 mm×92 mm）中以柞蠶卵為寄主在人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司， RDZ-300D-4W）內(nèi)飼養(yǎng)， 飼養(yǎng)條件： 溫度（24±0.5）℃， 光周期L∥D=16 h∥8 h， 相對濕度（70±5）%， 光照強度3 000 lx。

1.2" 試蟲處理

用新鮮柞蠶卵制作的卵卡經(jīng)日本平腹小蜂寄生2 d后，分別置于滯育誘導［溫度（17±0.5）℃， 光周期L∥D=10 h∥14 h， 相對濕度（70±5）%， 光照強度3 000 lx］和非滯育［溫度（24±0.5）℃， 光周期L∥D=16 h∥8 h， 相對濕度（70±5）%， 光照強度3 000 lx］環(huán)境中發(fā)育。

非滯育老熟幼蟲樣品獲取： 日本平腹小蜂寄生柞蠶卵后在非滯育條件下發(fā)育約12 d后， 從被寄生的柞蠶卵中解剖出非滯育日本平腹小蜂老熟幼蟲， 為非滯育組（ND）。

滯育老熟幼蟲樣品獲?。?日本平腹小蜂寄生柞蠶卵后置于滯育條件下發(fā)育， 分別在滯育誘導第25、35、45、55天解剖柞蠶卵取出滯育老熟幼蟲， 為滯育組， 分別編號為D25、D35、D45、D55。

滯育解除老熟幼蟲樣品獲?。?日本平腹小蜂寄生柞蠶卵后置于滯育誘導條件下發(fā)育55 d， 轉(zhuǎn)移至非滯育條件中繼續(xù)發(fā)育12 d， 解剖柞蠶卵取老熟幼蟲， 為滯育解除組（DT）。

1.3" 生理表型研究

體重： 解剖寄生后柞蠶卵， 小心挑取出日本平腹小蜂老熟幼蟲， 置于精度為萬分之一的電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司， ME204E）上稱重， 每處理不少于15頭。

體長、體寬： 使用電子體視顯微鏡（Leica， S9E）測量體長、體寬， 每處理不少于15頭。

體色： 將日本平腹小蜂老熟幼蟲按照相同間隔整齊擺放在標準色卡上， 在設置統(tǒng)一背景參數(shù)的電子體視顯微鏡下拍照， 獲取的圖片通過ImageJ V 2.1.1.7軟件測量圖片灰度值IntDen， 每處理不少于3個生物學重復。

1.4" 脂滴染色

取非滯育和滯育不同天數(shù)的老熟幼蟲， 置于4%多聚甲醛［生工生物工程（上海）股份有限公司］中， 常溫固定， 備用， 每處理取3頭日本平腹小蜂老熟幼蟲。使用冷凍切片機（MICROM， HM560）將樣品切成厚度為10 μm的薄片， 將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上置于4%多聚甲醛固定15 min， PBS［生工生物工程（上海）股份有限公司］稍稍洗3次;尼羅紅（上海麥克林生化科技有限公司）染色10 min， PBS洗滌3次， 每次5 min;加入抗熒光淬滅封片劑（北京索萊寶科技有限公司）封片， 使用熒光正置顯微鏡（ZEISS， AxioScope A1）采集圖像。

采用ImageJ進行圖像分析，染色部位經(jīng)IntDen轉(zhuǎn)換后計算切片染色部位面積。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 體重、體長、體寬的比較

不同發(fā)育狀態(tài)的日本平腹小蜂老熟幼蟲的體重存在顯著差異（F5， 234=10.713， Plt;0.001）， 其中滯育誘導45 d和55 d的老熟幼蟲體重顯著輕于非滯育個體（圖1）， 分別平均減輕了0.318 mg和0.493 mg， 且老熟幼蟲滯育期間體重呈現(xiàn)緩慢減輕的趨勢;滯育解除個體的體重顯著低于非滯育和滯育誘導25～45 d的老熟幼蟲， 分別減輕了0.705、0.618、0.488 mg和0.388 mg， 但與滯育誘導55 d的個體無差異（圖1）。

不同發(fā)育狀態(tài)的日本平腹小蜂老熟幼蟲的體長和體寬存在顯著差異（體長： F5，84=9.195， Plt;0.001;體寬：F5，84=6.392， Plt;0.001）。滯育誘導35、45 d及55 d的老熟幼蟲體長均顯著低于非滯育個體， 分別縮短了0.207、0.304 mm和0.283 mm， 且老熟幼蟲滯育期

間體長呈現(xiàn)緩慢縮短的趨勢，但滯育誘導25 d的老熟

幼蟲體長與非滯育個體無顯著

差異;滯育解除個體的體長顯著性短于非滯育個體，

降低了0.293 mm， 但與滯育老熟幼蟲均無顯著差異（圖2a）。滯育期

間老熟幼蟲與非滯育個體的體寬無顯著差異， 滯育解除個體的體寬顯著小于非滯育個體和滯育誘導25～45 d的老熟幼蟲體寬， 分別降低了0.208、0.118、0.137 mm和0.179 mm（圖2b）。

2.2" 體色的比較

日本平腹小蜂非滯育老熟幼蟲為深褐色，隨著滯育誘導時間延長，滯育老熟幼蟲體色逐漸變淺（圖3a）。非滯育和滯育誘導不同時長的

老熟幼蟲的體色存在顯著差異（F5，30=10.713， Plt;0.001）。滯育誘導25～55 d的老熟幼蟲體色灰度值均顯著性低于非滯育老熟幼蟲， 相對于非滯育個體分別降低了24.53%、29.88%、52.08%和53.66%， 且老熟幼蟲滯育期間體色灰度值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢， 其中滯育誘導45～55 d的老熟幼蟲體色灰度值顯著低于誘導25～35 d的個體;滯育解除老熟幼蟲體色灰度值顯著低于非滯育和滯育誘導25、35 d的個體， 相對于非滯育個體降低了59.76%， 但與滯育誘導45～55 d的老熟幼蟲無顯著差異（圖3b）。

2.3" 脂滴的比較

不同發(fā)育狀態(tài)的日本平腹小蜂老熟幼蟲脂滴數(shù)量存在顯著差異（F4，10=57.438， Plt;0.001）。非滯育老熟幼蟲體腔內(nèi)脂滴均勻分布， 滯育誘導25～35 d的個體相比較于非滯育老熟幼蟲， 其體腔內(nèi)脂滴分布明顯減少， 表皮附近脂滴聚集增多;滯育誘導45～55 d的個體相較于非滯育老熟幼蟲， 其體腔內(nèi)脂滴幾乎消失， 表皮附近脂滴聚集增多。整體上滯育老熟幼蟲相較于非滯育個體， 其體腔內(nèi)脂滴隨著滯育時間的延長逐漸減少， 同時出現(xiàn)表皮附近脂滴聚集現(xiàn)象（圖4）。滯育誘導不同時長的老熟幼蟲脂滴相對染色面積均顯著低于非滯育個體， 非滯育老熟幼蟲的脂滴相對染色面積為65.85%， 滯育誘導25～55 d的脂滴相對染色面積分別為36.26%、31.21%、18.23%和14.67%， 其中滯育誘導45～55 d的個體脂滴相對染色面積顯著低于滯育誘導25～35 d的老熟幼蟲（圖5）。

3" 結(jié)論與討論

昆蟲的滯育類型可分為：卵滯育、幼蟲滯育、蛹滯育、成蟲滯育［15］，其中部分蛹滯育和成蟲滯育的昆蟲在滯育期間會出現(xiàn)顯著的外在生物學表型的變化，可將其作為昆蟲進入滯育的判斷依據(jù)。如棉鈴蟲化蛹后眼點始終位于中部的一條直線上被作為判斷其進入滯育的直接表型［2122］。昆蟲滯育期間呼吸速率降低以維持低水平的新陳代謝活動，代謝所產(chǎn)生的能量僅進行基本的生命活動，個體生長發(fā)育幾乎停滯或極度緩慢，如棉鈴蟲蛹的夏滯育、蘋果實蠅Rhagoletis pomonella的蛹滯育等［2325］。本研究發(fā)現(xiàn)日本平腹小蜂老熟幼蟲滯育期間體重逐漸減輕，滯育誘導45 d以上老熟幼蟲體重顯著低于非滯育個體，表明日本平腹小蜂老熟幼蟲滯育期間代謝速率極低。

部分昆蟲在面對不同環(huán)境時會出現(xiàn)體色的改變，以適應不同環(huán)境，如黃底型異色瓢蟲Harmonia axyridis在低溫下產(chǎn)生黑斑的數(shù)量和面積多于高溫環(huán)境下的個體，該表型的變化有助于體表吸收更多的熱量來提高體溫，以度過不良環(huán)境［2630］。而昆蟲滯育期間發(fā)生體色變化的種類常見于成蟲滯育，學者們常以此為依據(jù)來鑒定其是否進入滯育。如異色瓢蟲非滯育雌成蟲的鞘翅顏色顯著紅于滯育個體［29］。七星瓢蟲進入滯育后鞘翅顏色略淺，呈現(xiàn)黃色［17］。牧草盲蝽成蟲滯育越冬期間體色依次產(chǎn)生以下變化：黃綠色、灰綠色、棕褐色、棕紅色和灰褐色［18］。在本研究中，日本平腹小蜂老熟幼蟲進入滯育后體色變淺，通過分析其灰度值發(fā)現(xiàn)老熟幼蟲進入滯育后灰度值隨著滯育時間的延長而逐漸降低，結(jié)合其滯育期間體重的逐漸降低，表明日本平腹小蜂老熟幼蟲在滯育期間并非停止發(fā)育，而是生長發(fā)育非常緩慢。

脂肪體在昆蟲能量儲存和利用中起著關(guān)鍵作用，它是營養(yǎng)物質(zhì)的中央儲存庫，兼具生物合成和分解代謝活性。昆蟲脂肪體大部分由營養(yǎng)細胞構(gòu)成，細胞中存在大量的脂滴，是脂類物質(zhì)的儲存庫，脂滴在能量代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3133］。脂類是昆蟲滯育期間重要的能量物質(zhì)，常在滯育前期開始積累，在滯育期間轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，維持昆蟲的基本生命代謝活動，如麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana滯育前總脂含量顯著升高［34］;馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata成蟲滯育前期大量取食，腹部積累大量的脂肪，為滯育期間提供充足的能量來源［3537］。甘油三酯是昆蟲滯育期間營養(yǎng)物質(zhì)的主要存儲形式，能夠以液態(tài)脂滴的形式胞內(nèi)轉(zhuǎn)運;滯育還會引起甘油三酯組分的變化，有助于提高甘油三酯的流動性和增強昆蟲的抗逆性［38］，如麥紅吸漿蟲、甘藍夜蛾Mamestra brassicae、美國白蛾Hyphantria cunea等［34，3940］，同時脂肪還與昆蟲滯育期間的抗凍能力密切相關(guān)［41］。劉子欣等發(fā)現(xiàn)日本平腹小蜂老熟幼蟲在滯育初期顯著積累脂質(zhì)和甘油三酯，尤其是甘油三酯含量達到了非滯育幼蟲的2倍以上，隨著滯育時間延長，脂質(zhì)和甘油三酯含量顯著降低［20］。與劉子欣的研究結(jié)果相符合，本研究發(fā)現(xiàn)日本平腹小蜂老熟幼蟲在滯育期間體腔內(nèi)脂滴數(shù)量逐漸減少，最后甚至消失，并出現(xiàn)表皮附近大量聚集脂滴的現(xiàn)象。由此表明脂質(zhì)是日本平腹小蜂老熟幼蟲滯育期間的主要能量物質(zhì)，隨著滯育時間延長，脂質(zhì)被逐漸消耗。而脂滴向日本平腹小蜂老熟幼蟲表皮附近大量聚集，有助于提高滯育老熟幼蟲在低溫環(huán)境中的抗凍能力以及儲存能量物質(zhì)。

本研究表明，日本平腹小蜂老熟幼蟲滯育期間，體重、體色、體長、脂滴含量和脂滴分布均發(fā)生顯著變化，該變化與能量儲存、消耗及提高個體抗逆性密切相關(guān)，最終使日本平腹小蜂能順利度過不良環(huán)境。本文為深入研究日本平腹小蜂滯育機制奠定基礎。

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（責任編輯：楊明麗）