中甸刺玫的葉綠體基因組特征及種內(nèi)變異

摘 要： "中甸刺玫（Rosa praelucens）是云南香格里拉市的特有“極?！敝参锖蛧叶壷攸c保護植物，也是著名的高山花卉和重要的十倍體月季種質(zhì)資源，種內(nèi)存在豐富的表型多樣性。為了澄清中甸刺玫種內(nèi)表型變異的遺傳背景，該文利用二代測序技術(shù)對40個不同表型的中甸刺玫代表性個體的葉綠體基因組進行測序、組裝注釋和比較分析。結(jié)果表明：（1）中甸刺玫的基因組序列長157 173～157 261 bp，植株間僅相差88 bp，共編碼132個功能基因，主要為與光合作用和自我復制相關(guān)的基因。全部基因共由27 155個密碼子編碼，以A-和U-為末端的密碼子較常見。（2）中甸刺玫的葉綠體基因組共鑒定出36個重復序列和73個簡單重復序列（SSRs），后者大部分為單核苷酸SSRs，主要位于大單拷貝（LSC）區(qū)的基因間隔區(qū)。（3）中甸刺玫種內(nèi)葉綠體全基因組的單倍型多樣性為0.928±0.027，核酸多態(tài)性（Pi）為0.000 12；位于LSC的petN-trnD、psaA-ycf3等基因間隔區(qū)，以及rps16和ycf1等基因的核酸多態(tài)性相對較高；不同表型的代表性個體的葉綠體基因組間在結(jié)構(gòu)上不存在大片段或基因的逆轉(zhuǎn)或者丟失。該研究結(jié)果表明，中甸刺玫種內(nèi)在葉綠體基因組大小、序列和結(jié)構(gòu)等方面均高度保守，其種內(nèi)豐富的表型多樣性并非由葉綠體基因組變異而引起。

關(guān)鍵詞： 中甸刺玫， 葉綠體基因組， 比較基因組， 簡單重復序列， 核酸多態(tài)性， 密碼子偏好

中圖分類號： "Q943

文獻標識碼： "A

文章編號： nbsp;1000-3142（2025）01-0015-16

基金項目： "國家自然科學基金（31972443）； 云南省高層次科技人才及創(chuàng)新團隊選拔專項（202305AS350002）。

第一作者： 王其剛（1977—），碩士，研究員，研究方向為月季遺傳育種，（E-mail）171068976@qq.com。

*通信作者： "蹇洪英，博士，研究員，研究方向為月季種質(zhì)資源研究與利用，（E-mail）ynwildflower@aliyun.com。

Chloroplast genome features and intraspecific

variation of Rosa praelucens

WANG Qigang"CAO Shirui^1，2， WANG Huichun"MA Changle²，

YAN Huijun"QIU Xianqin"JING Weikun"JIAN Hongying^1*

（ 1. Flower Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205， China; 2. College

of Landscape and Horticulture， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract： "Rosa praelucens is a critically endangered alpine wild flower endemic to Shangri-La City of Yunnan Province. Rich in phenotypic diversity and with a high ploidy level of decaploid， R. praelucens is a very important rose germplasm resource. In order to clarify the genetic background of its phenotypic variation， the chloroplast genomes of 40 R. praelucens individual plants representing different phenotypes within the species were sequenced by using the Illumina HiSeq 2000 platform， and then assembled， annotated， compared and analyzed. The results were as follows： （1） Chloroplast genomes of R. praelucens were 157 173 - 157 261 bp in length， with a size difference of 88 bp among different individual plants. The genomes encoded 132 function genes， mainly related with photosynthesis and self-replication. A total of 27 155 codons， preferring using codon ending of A or U， were found in all the coding sequences. （2） A total of 36 repeats and 73 simple sequence repeats （SSRs） were detected in the chloroplast genome of R. praelucens. Most of the SSRs were mononucleotide type and located in the intergenic region of large single scale （LSC）. （3） The haplotype diversity among the 40 chloroplast genomes was 0.928±0.027， and the nucleotide polymorphism （Pi）"was 0.000 12. The intergenic region of petN-trnD and psaA-ycf gene rps16 and ycf1 were relatively more divergent. No reverse or loss of large DNA fragments and genes were found among the chloroplast genomes of different individuals. These results indicate that the chloroplast genomes are highly conserved in size， sequence and structure within R. praelucens. The rich intraspecific phenotypic diversity is not caused by the variation of chloroplast genomes among different individual plants.

Key words： Rosa praelucens， chloroplast genome， comparative "genome， simple sequence repeats （SSRs）， nucleotide polymorphism （Pi）， codon preference

葉綠體在植物的生活史中具有重要作用（Wicke et al.， 2011）。大多數(shù)維管植物的葉綠體基因組長度約為150 kb，為保守的四分體結(jié)構(gòu)，包括一個大單拷貝區(qū)（large single copy， LSC）、一個小單拷貝區(qū)（small single copy， SSC）和兩個反向重復區(qū)（inverted repeats， IRs）（Wicke et al.， 2011; Shetty et al.， 2016; Zhu et al.， 2016）。高等植物的葉綠體基因組高度保守，但某些類群的葉綠體基因組中存在大片段的倒置（Sun et al.， 2017）、大量重復序列（Guisinger et al.， 2011）、基因丟失或假基因化（Ye et al.， 2018）以及IR區(qū)的擴張或收縮（Li et al.， 2017; Liu et al.， 2017）。葉綠體基因組在大多數(shù)被子植物中為母系遺傳（Neale amp; Sederoff， 1989；Daniell et al.， 2016）。與核基因組相比，葉綠體基因組具有分子量低、結(jié)構(gòu)簡單、保守性強等特點，還包含大量的重復序列，包括簡單重復序列（simple sequence repeats， SSRs）（Cavalier-Smith， 2002）。因此，被廣泛應用于系統(tǒng)發(fā)育、DNA條形碼、基因工程和親緣關(guān)系等研究（Dong et al.， 2018）。隨著二代測序技術(shù)（next-generation sequencing， NGS）的發(fā)展，越來越多的植物葉綠體全基因組序列被報道，NCBI數(shù)據(jù)庫迄今已公布了超過8 500個植物葉綠體基因組。

中甸刺玫（Rosa praelucens）是云南省香格里拉市的特有“極?！敝参铮↘u amp; Robertson， 2003；覃海寧等，2017），也是國家二級保護植物（http：//www.forestry.gov.cn/main/3954/20210908/163949170374051.html）。中甸刺玫是著名的高山花卉（Li amp; Zhou， 2005）和重要的月季種質(zhì)資源，既耐寒（鄧菊慶等，2013），也高抗蚜蟲（范元蘭等，2021）。自Jian等（2010）發(fā)現(xiàn)其是薔薇屬野生種中唯一的最高倍性——十倍體（2n=10x=70）以來，人們對中甸刺玫的生境和群落特征（關(guān)文靈等，2012）、繁育系統(tǒng)（伍翔宇等，2014）、種群現(xiàn)狀（周玉泉等，2016）、系統(tǒng)位置（王開錦等，2018）、基于染色體熒光原位雜交的核型特征（方橋等，2020）以及遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)（Jian et al.， 2018a）等進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)中甸刺玫種內(nèi)存在豐富的表型多樣性，其中花色和花型變異尤其顯著（李樹發(fā)等，2013；Jian et al.， 2018a）。

理解多倍性如何修飾表型性狀是進化生物學的一個研究熱點和主要目標（Balao et al.， 2011）。大量研究表明自然形成或人工誘導的多倍體植物都會產(chǎn)生遺傳和表觀遺傳的改變，從而改變基因的表達，使其在遺傳、生理和形態(tài)上產(chǎn)生分化，形成新的表型（Ramsey amp; Schemske， 2002）。對于十倍體的中甸刺玫而言，其種內(nèi)豐富的表型變異的機制尚不清楚。中甸刺玫的高倍性特征，限制了多種分子技術(shù)手段在其遺傳背景研究上的應用。Jian等（2017）報道了中甸刺玫的葉綠體基因組大小、各分區(qū)的長度和GC含量、編碼的基因數(shù)量等基本信息，發(fā)現(xiàn)中甸刺玫的葉綠體基因組大小為157 186 bp，與同屬的單瓣月季花（R. chinensis var. spontanea）等其他植物相比，其葉綠體基因組最大且在LSC區(qū)的psbM和trnD之間有一個長為505 bp的插入。在此基礎(chǔ)上，為了探究中甸刺玫種內(nèi)表型變異的遺傳背景，本研究利用二代測序技術(shù)對40個不同表型的中甸刺玫代表性個體的葉綠體基因組進行了測序、組裝和比較分析，探討以下問題：（1）中甸刺玫葉綠體基因組的序列特征和密碼子偏好性；（2）中甸刺玫種內(nèi)不同表型個體在葉綠體基因組上是否存在較大的變異。以期為中甸刺玫的物種形成和保護提供更多的遺傳信息，也為探討其種內(nèi)表型變異的分子機制提供葉綠體基因組方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

用于葉綠體基因組序列特征分析的中甸刺玫植株來源于香格里拉市小中甸鎮(zhèn)和平村塘安培組（99°49′38.1″ E、27°32′16.68″ N， 3 248 m），其原始序列已上傳至NCBI，序列號為MG450565.1。其余40個不同表型的代表性植株的基本信息見表1。于2021年6月底在野外采集當年生成熟健康葉片，立即用硅膠進行干燥，-18 ℃低溫保存用于后續(xù)實驗。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組總DNA的提取、測序、組裝及注釋 使用改良的CTAB法進行中甸刺玫葉片的總DNA提取，達到建庫測序要求的DNA送到北京諾禾致源科技股份有限公司用Illumina Hiseq 2000測序平臺進行建庫測序，每個樣品得到約3.5 Gb的150 bp短片段原始序列（raw data），用NGSQC Toolkit_v2.3.3軟件（Patel amp; Jain， 2012）按照默認參數(shù)對原始序列進行過濾篩選，得到高質(zhì)量的有效序列（clean data）。使用GetOrganelle（https：//github.com/Kinggerm/GetOrganelle）進行de novo從頭組裝，得到葉綠體全基因組序列。將組裝好的基因組序列使用CpGAVAS（Liu et al.， 2012）自動進行注釋，用Genious 9.1（Kearse et al.， 2012）進行校對和調(diào)整每個注釋基因的邊界區(qū)域，采用OGDRAW（Lohse et al.， 2013）繪制葉綠體基因組物理圖譜。

1.2.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)分析 利用Geneious軟件對已上傳到NCBI、序列號為MG450565.1的中甸刺玫葉綠體全基因組進行葉綠體全基因組編碼基因構(gòu)成統(tǒng)計。用MEGA6（Tamura et al.， 2013）進行密碼子偏好分析，計算同義密碼子相對使用值（relative synonymous codon usage values; RSCU）并統(tǒng)計AT含量。用重復序列分析軟件REPuter軟件（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）（Kurtz et al.， 2001），搜索基因組中的正向重復（forward repeats）和反向重復（reverse repeats）序列。軟件運行時，設(shè)置搜索的重復序列長度不小于20 bp，序列一致性大于85%。此外，利用MISA（Beier et al.，2017）軟件來鑒定簡單重復序列，搜索的閾值設(shè)置為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數(shù)分別不小于10、5、4、3、3和3。

1.2.3 種內(nèi)不同個體的葉綠體基因組序列比較 在Geneious軟件中調(diào)用Mauve程序（Darling et al.， 2004）對中甸刺玫40個代表性植株的葉綠體基因組進行比對，分析不同植株的葉綠體基因組間是否存在大片段的逆轉(zhuǎn)或丟失。用DNASP v5.10軟件（Librado amp; Rozas， 2009）計算種內(nèi)葉綠體基因組的單倍型多樣性和核苷酸多態(tài)性（Pi），篩選葉綠體基因組中的高變區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中甸刺玫葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征

中甸刺玫種內(nèi)不同表型的40個代表性植株的葉綠體基因組序列的長度、各分區(qū)長度、GC含量、編碼基因數(shù)目等基本信息見圖1和表2。中甸刺玫的基因組序列全長157 173～157 261 bp，植株間相差88 bp。基因組最大的是7-1號植株，為157 261 bp，基因組最小的是2-5號植株，為157 173 bp。LSC區(qū)長為86 300～86 353 bp，相差53 bp，最長的是7-1號植株，最短的是2-5號植株；SSC區(qū)長為18 765～18 803 bp，相差38 bp；反向重復IR區(qū)長度均為26 054 bp，說明種內(nèi)基因組大小的差異主要來源于LSC區(qū)和SSC區(qū)?；蚪M的GC含量在不同個體間無顯著差異，全基因組的GC含量均為37.2%，其中IR區(qū)的GC含量為42.7%，LSC區(qū)的GC含量為35.2%，SSC區(qū)的GC含量為31.2%。

2.2 中甸刺玫葉綠體基因組的基因構(gòu)成

由表3可知，中甸刺玫的葉綠體基因組共編碼132個功能基因，包括87個蛋白質(zhì)編碼基因，37個tRNA基因和8個rRNA基因。其中，與光合作用有關(guān)的基因有45個，與自我復制相關(guān)的基因有76個，功能未知的其他基因共11個。6個蛋白編碼基因（ndhB、rpl2、rpl23、rps7、rps12、ycf2）、7個tRNAs（trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC）和4個rRNAs（rrn16、rrn23、rrn 4.5、rrn5）在IR區(qū)完全重復。在132個基因中，petB、petD、ndhA、ndhB、rps16、rpl2、rpl16、rpoC1、trnA-UGC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC等13個基因有1個內(nèi)含子，ycf3和clpP這2個基因各有2個內(nèi)含子，rps12為反式剪接的基因，其5′端在LSC區(qū)，而3′端在IR區(qū)重復。

2.3 中甸刺玫葉綠體基因組密碼子偏好性

中甸刺玫的葉綠體基因組密碼子使用頻率（RSCU）如表4。全部基因由27 155個密碼子編碼，其中亮氨酸（leucine）是使用頻率最高的氨基酸，共編碼了其中的2 765個密碼子，占總數(shù)的10.85%，而組氨酸（histidine）是使用頻率最低的氨基酸，僅編碼了其中的530個密碼子，占總數(shù)的1.95%。以A-和U-為末端的密碼子較常見，除了trnL-CAA、trnS-GGA、精氨酸Arg-AGG和甘氨酸Gly-GGG以外，所有的首選同義密碼子（RSCUgt;1）都是以A或U結(jié)尾。

2.4 中甸刺玫葉綠體基因組的重復序列

重復序列分析結(jié)果表明，中甸刺玫的葉綠體基因組中共有33個正向重復序列和3個反向重復序列，這些重復序列長度大多為20～30 bp（表5）。最長的重復序列分別位于rps12-trnV（GAC）基因間隔區(qū)和ndhA基因的含子區(qū)域。大多數(shù)重復序列位于LSC區(qū)和IR區(qū)，還有9個重復序列在不同的區(qū)域開始，如第1號重復的2個序列分別開始于IRb區(qū)和SSC區(qū)。

2.5 中甸刺玫葉綠體基因組的簡單重復序列

MISA軟件在中甸刺玫的葉綠體基因組中共找到73個簡單重復序列（SSRs），其中單核苷酸SSRs（A/T/G/C）最多，共有42個；其次是二核苷酸類型（AG/AT/TA/TC），有9個，三核苷酸類型有4個，四核苷酸類型有8個，六核苷酸SSRs有2個，沒有五核苷酸SSRs。絕大部分為單純類型SSRs，復合類型的SSRs較少，二者分別為65個和8個，沒有間接型SSRs（表6）。58個SSRs位于LSC區(qū)，占全部SSRs的79.5%，5個SSRs位于SSC區(qū)，IRa和IRb區(qū)各有5個SSRs。只有23個SSRs位于基因中，其他均位于基因間隔區(qū)。單核苷酸SSRs中的74%屬于A/T，這與SSRs主要由短腺嘌呤（adenine，A）或胸腺嘧啶（thymine， T）重復組成而很少有串聯(lián)鳥嘌呤（guanine， G）和胞嘧啶（cytosine， C）組成的假說相一致。

2.6 中甸刺玫種內(nèi)的葉綠體基因組序列差異

中甸刺玫種內(nèi)不同個體的葉綠體基因組序列差異較小。所有代表性個體的全基因組序列比對分析共檢測到58個變異位點共22個單倍型，單倍型多樣性為0.928±0.027，核酸多態(tài)性為0.000 12。種內(nèi)葉綠體基因組在基因、基因間隔區(qū)的核酸多態(tài)性都較低，相對多態(tài)性較大的是位于LSC區(qū)的psbI-trnS（GCU）、trnS（GCU）-trnG（UCC）、trnG（UCC）-trnfM（CAU）、petN-trnD（GUC）、petA-psbJ、psaA-ycf3等基因間隔區(qū)，以及rps16和ycf1等基因（圖2）。Mauve比對的結(jié)果表明，中甸刺玫種內(nèi)不同代表性個體的葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)上并無顯著差異，并且不存在大片段或基因的逆轉(zhuǎn)或者丟失（圖3）。

3 討論與結(jié)論

雖然植物的葉綠體基因組在基因組成和排列順序上具有較高的保守性，但由于長期對不同環(huán)境的適應常導致同屬植物的葉綠體基因組在大小上發(fā)生改變，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)重排以及IR區(qū)的收縮或擴張等（Daniell et al.， 2016）。中甸刺玫不同表型40個代表性個體的葉綠體基因組大小為157 173～157 261 bp，整個基因組共編碼132個基因，主要與光合作用和自我復制相關(guān)。與同屬的單瓣月季花（Jian et al.， 2018b）、亮葉月季（R. lucidissima）（Zhao et al.， 2019）、木香花（R. banksiae）（楊芳，2019），大花香水月季（R. odorata var. gigantea）（Yang et al.， 2014）、金櫻子（R. laevigata）（Yin et al.， 2020）以及其他種（Chen et al.， 2019; Cui et al.， 2022）的葉綠體基因組相比，中甸刺玫的基因組除在長度上明顯多出約500 bp以外，在基因組的GC含量、基因構(gòu)成和排列順序上與其他種基本一致，表明薔薇屬植物的葉綠體基因組較保守，種間差異較小，主要在非編碼區(qū)有序列長度的變化。

密碼子是連接核酸和蛋白質(zhì)的紐帶，研究物種的密碼子偏好并確定最優(yōu)密碼子，有助于設(shè)計基因表達載體來提高目的基因的表達量，在作物遺傳育種和品種改良方面具有重要應用價值（Qi et al.， 2015）。密碼子偏好性分析顯示中甸刺玫的葉綠體基因組編碼密碼子中，亮氨酸是使用頻率最高的氨基酸，而組氨酸使用頻率最低。此外，中甸刺玫所有的首選同義密碼子都是以A-或U-結(jié)尾（RSCU gt; 1），由于RSCU大于1則表示實際頻率高于其他同義密碼子的使用頻率（晁岳恩等，2012），因此中甸刺玫的密碼子偏好以A-和U-結(jié)尾。這與同屬的單瓣月季花的密碼子偏好性（Jian et al.， 2018b）基本一致，為研究相關(guān)基因的分子進化和外源表達奠定了基礎(chǔ)。

植物的葉綠體簡單重復序列為單親遺傳且有較高的種內(nèi)多態(tài)性，是物種進化和多態(tài)性的重要遺傳標記（Cavalier-Smith， 2002），常被用作野生植物系統(tǒng)演化和居群遺傳研究（Provan， 2000; Flannery et al.， 2006）以及作物遺傳圖譜構(gòu)建的分子標記（Powell et al.， 1995; Xue et al.， 2012）。由于poly A和poly T相比poly C和poly G可能具有更高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（Gragg et al.， 2002），因此大多數(shù)植物的葉綠體基因組單核苷酸SSRs多為poly A和poly T結(jié)構(gòu)。中甸刺玫葉綠體基因組中共有73個簡單重復序列SSRs，主要為單核苷酸SSRs，大部分由短腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）重復組成，主要位于LSC區(qū)的基因間隔區(qū)，與同屬的單瓣月季花（Jian et al.， 2018b）基本一致，也與其他多種植物如山茶屬（Camellia）（丁祥青等，2022；鄧永彪等，2024）、絹蒿屬（Seriphidium）（Jin et al.， 2023）等類似。

Jian等（2018b）研究表明，薔薇屬內(nèi)不同物種的葉綠體基因組間的核酸高變區(qū)主要位于LSC區(qū)的trnK-rps16、ps16-trnQ、trnS-trnG、atpF-atpH、rps2-rpoC2等多個基因隔區(qū)、rps19和ycf1等基因的編碼區(qū)，以及rpl2、rps16、ndhA等基因的內(nèi)含子區(qū)域。中甸刺玫種內(nèi)不同表型代表性個體的全基因組核酸多態(tài)性較低，核酸多態(tài)性相對較高的是位于LSC區(qū)內(nèi)的petN-trnD（GUC）、petA-psbJ、psaA-ycf3等少數(shù)幾個基因間隔區(qū)，以及rps16和ycf1等少數(shù)幾個基因。結(jié)合Mauve比對的結(jié)果，說明中甸刺玫種內(nèi)的葉綠體基因組的基因序列和結(jié)構(gòu)均高度保守，不存在大片段序列或基因的逆轉(zhuǎn)或者丟失，其種內(nèi)不同個體的表型變異并非由葉綠體基因組變異而引起。

綜上所述，本研究在對中甸刺玫的葉綠體基因組進行簡單報道的基礎(chǔ)上，詳細地分析了中甸刺玫葉綠體基因組的基因構(gòu)成、密碼子偏好以及簡單重復序列等基本特征，并對種內(nèi)具有不同表型的代表性個體的葉綠體基因組進行了比較基因組分析，結(jié)果表明，中甸刺玫種內(nèi)的葉綠體基因組大小、序列和基因結(jié)構(gòu)等方面均高度保守，不存在大片段序列或基因的逆轉(zhuǎn)或者丟失，為中甸刺玫的保護和開發(fā)利用提供了葉綠體基因組方面基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究也表明中甸刺玫種內(nèi)豐富的表型變異并非由葉綠體基因組變異而引起，應結(jié)合中甸刺玫的高倍性特征，從染色體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)、基因表達以及表觀遺傳等角度進行深入系統(tǒng)的研究。

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（責任編輯 李 莉 王登惠）