菊花用藥規(guī)律分析及其核心藥物組合協同藥理活性研究

摘要：為分析含菊花組方的用藥規(guī)律及其核心組合藥物的藥理活性，對含菊花方劑進行用藥頻次、復雜網絡、關聯規(guī)則分析，采用網絡藥理學方法構建核心組合藥物的“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡。利用預測結果，采用體外細胞模型評價菊花藥物組合的藥理作用。共得到含菊花組方92首，涉及藥物212味，使用頻次≥10的中藥32味；關聯規(guī)則顯示菊花-甘草組合的支持度和置信度最高，其次依次為菊花-甘草-荊芥、菊花-甘草-荊芥-川芎、菊花-甘草-荊芥-川芎-防風組合。網絡藥理學分析顯示，菊花-甘草組合用藥可治療腫瘤、消化系統疾病、神經系統疾病等。體外細胞活性研究顯示，菊花-甘草藥物組合對一氧化氮的抑制率優(yōu)于單味藥物。與菊花單味藥物相比，組合用藥活性更為顯著，體現了中醫(yī)臨床用藥配伍的科學性。

關鍵詞：菊花；數據挖掘；用藥規(guī)律；網絡藥理學；活性驗證

中圖分類號：R285""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1002-4026（2025）01-0001-08

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20240051【藥理與毒理】

收稿日期：2024-04-03

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（2021CXGC010508）；齊魯工業(yè)大學（山東省科學院） 重大新專項（2022JBZ02-04）；山東省泰山學者項目（tstp20221138）；山東省重點扶持區(qū)域引進急需緊缺人才項目

作者簡介：孫京甜（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中藥活性成分分離及質量評價方法。E-mail：jingtiansun0120@163.com，Tel：19854196316

*通信作者，董紅敬（1986—），女，博士，副研究員，研究方向為中藥藥效成分及質量評價。E-mail：donghongjing_2006@163.com，Tel：13361055730

Exploring the medication rule of Chrysanthemum morifolium Ramat. and

investigating the synergistic pharmacological activity of core combination herbs

SUN Jingtian1，2，3， LIU Feng 1，2，3， ZHANG Zhe1，ZHANG Yufu4， MA Xinhui1，2，3， LI Qingjun1，" WANG Xiao1，2，3， DONG Hongjing1，2，3*

（1.College of" Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355; 2. Key Laboratory for Applied

Technology of Sophisticated Analytical Instruments of Shandong Province， Shandong Analysis and Test Center， Qilu University

of Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250014， China; 3. Key Laboratory for Natural Active Pharmaceutical

Constituents Research in Universities of Shandong Province， College of Pharmacy， Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250014， China;4.Shandong Boda Medical Products Co.，Ltd.， Heze 274300， China）

Abstract∶To explore the medication rule and pharmacological activity of the core combination of chrysanthemi flos，the drug frequency， complex network and association rules of Chrysanthemum prescriptions were analyzed. The network pharmacology research method was used to construct the \"herbs-key target-disease\" of core combination drugs. Combined with the forecast results， an in vitro cell model was used to evaluate the pharmacological effects of chrysanthemi flos drug combinations. A total of 92 prescriptions containing chrysanthemi flos were obtained， involving 212 herbs， and 32 herbs with frequency greater than or equal to 10.The association rules showed that the sustain and confidence degree of chrysanthemi flos-Glycyrrhizae radix et rhizoma were the highest， and chrysanthemi flos-glycyrrhizae radix et rhizoma-schizonepetae herba， chrysanthemi flos-glycyrrhizae radix et rhizoma-schizonepetae herba-chuanxiong rhizoma， chrysanthemi flos-glycyrrhizae radix et rhizome-schizonepetae herba-chuanxiong rhizome-saposhnikoviae radix were next to each other， respectively. Network pharmacology analysis showed that the core drug combination of chrysanthemi flos-glycyrrhizae radix et rhizoma could treat tumors， digestive system diseases， nervous system diseases and other diseases. In vitro cell activity study showed that the combination of chrysanthemi flos and glycyrrhizae radix et rhizoma had a better inhibition rate on NO levels than the single drug. Compared with the single use of chrysanthemi flos， the combination of drugs showed more significantactivity， reflecting the scientificity of compatibility of TCM in clinic.

Key words∶flos of Chrysanthemum

morifolium Ramat.; data mining; medication rule; network pharmacology; biological validation

菊花是菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序，味甘、苦，微寒，具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒的功效［1］?，F代研究表明菊花具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)免疫、保護心血管等多種藥理作用［2］。中醫(yī)臨床上菊花多以復方用藥，通過配伍用藥能夠增強藥物的療效，例如菊花-枸杞子配伍具有顯著的延緩衰老和神經營養(yǎng)等活性［3］。因此，系統梳理菊花的用藥規(guī)律，挖掘其核心藥物組合，對菊花大健康產品的開發(fā)具有重要的指導意義。

《中華醫(yī)典》［4］收錄了千余種中醫(yī)學古籍，是至今為止規(guī)模最為宏大的中醫(yī)類電子叢書。本文以《中華醫(yī)典》中含菊花的處方為基礎，分析含菊花組方的用藥規(guī)律，基于網絡藥理學技術及體外細胞活性評價方法探究含菊花組方的潛在用途及其組方用藥優(yōu)勢，旨在為含菊花復方的開發(fā)和利用提供理論基礎，并推動其開發(fā)和利用。

1" 材料與方法

1.1" 儀器與試劑

HF90型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司）；Spark型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）。

RAW264.7細胞株（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco 公司）；一氧化氮（NO）試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）（Biological Industries公司）；DMSO（北京索萊寶科技有限公司）；磷酸緩沖溶液（PBS，武漢塞維爾生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素（Gibco公司）；噻唑藍（MTT，索萊寶科技有限公司）。

1.2" 數據來源、數據篩選及處理

基于《中華醫(yī)典》第五版數據庫，以“菊花”為關鍵詞，查找明確含有“菊花”的中藥復方。

將給藥方式為“口服的中藥復方”納入分析范圍。根據《中國藥典》2020版以及《中華本草》來規(guī)范各處方的中藥名稱［1，5］。如當歸尾規(guī)范為當歸，甘菊花規(guī)范為菊花，白花蛇規(guī)范為金錢白花蛇等。

1.3" 用藥規(guī)律分析

將篩選并規(guī)范好的中藥復方錄入Excel表格中，插入數據透視表以統計中藥的出現頻次，借助SPSS Modeler 18.0軟件進行復雜網絡、關聯規(guī)則分析。綜合用藥頻次、復雜網絡以及關聯規(guī)則結果，篩選出核心組合藥物。

1.4" 網絡藥理學分析

通過TCMSP數據庫［6］獲取核心藥物組合的藥物靶點，采用String數據庫［7］查詢靶點蛋白對應的基因名稱；借助CTD數據庫［8］預測藥物靶點的現代藥理作用；通過Excel中的數據透視表統計靶點的出現頻次，得到出現頻次高的關鍵靶點，利用Excel使關鍵靶點與疾病相互映射，利用Cytoscape軟件構建“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡，并通過分析該拓撲網絡特征，揭示藥-靶-病的內在關系；采用String數據庫獲取關鍵靶點的蛋白互作網絡（PPI），進一步篩選核心靶點，并基于DAVID數據庫［9］對關鍵靶點進行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

1.5" 一氧化氮抑制活性評價

取對數生長期巨噬細胞RAW264.7，將細胞濃度調整為1.0×106 mL-1，每孔100 μL接種于96孔板中，置于恒溫37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗組中分別加入含不同濃度樣品溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL（含200 ng/mL LPS和5%FBS）；空白組加入等體積含5% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基；模型組加入等體積含5% FBS和200 ng/mL LPS的DMEM高糖培養(yǎng)基，每組各接種5孔后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，取50 μL上清液于96孔板中，按照NO試劑盒說明書測定上清液中NO的含量。

2" 結果

2.1" 復方數據統計及用藥頻次分析

統計獲得含菊花組方92首，涉及212味中藥，使用頻次≥10的中藥有32味（表1），屬于高頻藥物。其中，出現頻次排名前10的有菊花、甘草、防風、川芎、當歸、荊芥、黃芩、蒺藜、黃連和羌活

，頻次總和為391次，占比33.94%。

2.2" 關聯規(guī)則分析

將數據整理成Y和N的格式，即復方中含有這味中藥標記為Y，不含則標記為N。借助SPSS Modeler 18.0軟件進行關聯規(guī)則分析，以Excel源的格式導入數據，連接數據節(jié)點與類型節(jié)點，在類型節(jié)點中選擇角色為任意，測量為標記，勾選僅顯示true值按鈕，顯示最大鏈接數設置為46，“強鏈接下限”為20，“弱鏈接上限”為5，根據鏈接大小顯示“強”“正?！薄叭酢鳖愋瓦M行繪圖，形成菊花組方的復雜網絡（圖1）；其中，連線的粗細程度代表兩種藥物在復方中同時出現的頻次。圖1顯示，菊花、甘草、防風、當歸的相關性較強，在菊花組方中經常配合使用。選擇關聯中的Apriori算法，將Apriori節(jié)點與類型節(jié)點相連接，使用預定義角色，選擇最低條件支持度10%，最小規(guī)則置信度80%，最大前項數為5，對藥物進行關聯規(guī)則分析。根據Apriori算法，一共產生1 405條規(guī)則，主要的關聯規(guī)則見表2～表5。

2.3" 現代藥理活性挖掘

綜合分析數據挖掘結果，發(fā)現菊花-甘草配伍組合出現頻次較高，為最為常用的核心藥物組合，為挖掘菊花和甘草組合用藥的現代藥理作用，采用網絡藥理學技術對其進行了深層次探究。

通過TCMSP數據庫，獲得菊花、甘草的藥物靶點，建立藥物靶點庫，并借助String數據庫將靶點蛋白規(guī)范成基因名稱；采用CTD數據庫預測現代藥理作用，共有681個與靶點相關的疾病，根據靶點數目進行排序，將前10個疾病與其對應的靶點相互映射，借助Excel中的數據透視表插件，分析并選擇出現頻次較高的靶點作為關鍵靶點，共篩選出52個。

將菊花和甘草的關鍵靶點與疾病相互映射，借助Cytoscape軟件構建“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡（圖2），網絡共包含64個節(jié)點，616條網線。拓撲網絡中的紅色三角形節(jié)點代表疾病，紫色V形節(jié)點代表靶點，綠色圓形節(jié)點表示藥物名稱。

基于String數據庫分析關鍵靶點的蛋白相互作用關系，建立PPI網絡，置信度設置為0.4，通過Cytoscape軟件進行網絡可視化（圖3），分析PPI網絡，節(jié)點的大小和顏色深淺表示Degree值的高低，其中，AKT1、IL6、TP53是Degree值前3的靶點蛋白。

通過DAVID數據庫進行關鍵靶點的GO富集分析和KEGG通路富集分析（圖4、圖5）。GO富集分析包括生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）、和分子功能（molecular function）3個部分。其中，關鍵靶點富集的生物過程條目包括RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡負調控（negative regulation of apoptotic process）、細胞增殖正調控（positive regulation of cell proliferation）等；細胞組分條目包括細胞核（nucleus）、細胞質（cytoplasm）、胞液（cytosol）等；分子功能條目包括蛋白質結合（protein binding）、轉錄因子結合（transcription factor binding）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）等。KEGG通路富集分析結果顯示，關鍵靶點主要富集于癌癥通路（pathways in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等。

2.4" 核心組合藥物對巨噬細胞一氧化氮生成的影響

一氧化氮（NO）是體內一種重要的信使分子，參與機體內的多種生理、病理過程，例如病毒感染、炎癥、癌癥、神經退行性疾病等過程［10-11］。為了探討篩選得到的組合用藥的優(yōu)勢，采用LPS誘導RAW264.7細胞模型，比較了組合藥物（菊花-甘草）及各單味藥物（甘草、菊花）對NO的抑制率（圖6）。在質量濃度為0.25 mg·mL-1和

0.5 mg·mL-1時，菊花-甘草藥物組合對NO的抑制率優(yōu)于單味藥物。當質量濃度由0.5 mg·mL-1提高至1.0 mg·mL-1時，單味藥物對NO的抑制率隨質量濃度提高而升高，而菊花-甘草配伍用藥的抑制率呈先緩慢上升后緩慢下降的趨勢，表明在適當質量濃度范圍內，菊花-甘草藥物組合可減少RAW264.7巨噬細胞的NO釋放量；當超過一定質量濃度范圍，菊花的寒性受到甘草的“甘以緩之”影響，使其功效減弱，避免過分損傷細胞，體現了菊花-甘草配伍用藥治療的優(yōu)勢。

圖6" 藥物對NO的抑制率

Fig.6" Inhibition rate of drug on NO

3" 討論

從用藥頻次統計發(fā)現，甘草在菊花組方中出現的頻次較高。甘草味甘、性平，微涼，具有補氣益中、緩急止痛、清熱解毒等功效，用作風熱感冒、解藥毒、食物中毒等；菊花味苦性寒，能清肝熱、平肝養(yǎng)，用作風熱感冒，瘡癰腫毒；菊花與甘草聯用，具有清肝火、明目、清熱解毒、潤肺止咳等功效。甘草可增強菊花清熱解毒的功效，還可發(fā)揮甘緩護胃的功效，緩和菊花苦寒對脾胃的影響。

根據用藥模式可知，菊花-甘草、菊花-甘草-荊芥、菊花-甘草-荊芥-川芎、菊花-甘草-荊芥-川芎-防風分別是4類組合中支持度最高的組合。菊花具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒之功效，主要治療頭痛、眩暈、目赤、心胸煩熱、疔瘡、腫毒等癥［1］；甘草具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥等功效，甘草可抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒、抗?jié)儭⒔獐d、保肝、祛痰和增強記憶力等［12］；荊芥具有解表散風、透疹、消瘡之功效，常用于抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調節(jié)免疫、抗菌、止血等［13］；川芎能活血行氣、祛風止痛，臨床用于胸痹脅痛、腹痛、跌打腫痛、頭痛痹痛、閉經痛經等癥［14］；防風有祛風解表，勝濕止痛，止痙的功效，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理活性［15］。

網絡藥理學分析結果顯示，菊花、甘草可作用的靶點主要與腫瘤（neoplasms）、消化系統疾病（digestive system diseases）、神經系統疾?。╪ervous system disease）等相關。研究表明，菊花多糖對人體肝癌HepG-2細胞的增殖具有顯著的抑制作用［16］。菊花中的β-欖香烯可在體外促進HepG2細胞的凋亡，主要通過上調凋亡相關蛋白Caspase-3、下調NF-κB［17-18］。甘草素可抑制肺腺癌細胞增值，促進細胞凋亡，提升化療敏感性，其作用機制可能與上調miR-216b-5p表達、抑制mTOR信號通路有關［19］。甘草可通過調節(jié)神經遞質、抑制炎癥、抑制氧化應激、修復損傷組織等方式，治療神經退行性疾病或腦損傷疾?。?0］。

通過分析“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡，發(fā)現核心中藥對菊花-甘草主要是通過作用于AKT1、IL6、TP53等關鍵靶點以治療腫瘤、消化系統疾病、神經系統疾病等多種疾病，而甘草能作用于STAT3、SIRT1、ITGB2等特有靶點，菊花能作用于ABCC2、IGF1R等特有靶點，體現了中藥配伍的重要性。KEGG通路富集分析顯示，菊花甘草藥對主要通過調節(jié)癌癥通路（pathways in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）等通路治療疾病。在許多腫瘤中，缺氧導致HIF-1α的表達上調，這與血管生成增加、腫瘤發(fā)生以及不良癌癥預后等相關［21］。研究表明，PI3K-Akt信號通路的激活可以在低氧干預下有效促進神經干細胞的增殖過程［22］。

通過分析菊花-甘草藥物組合對RAW264.7細胞NO釋放量的影響，發(fā)現在一定濃度范圍內，菊花-甘草藥物組合具有較單味藥物更強的藥效，體現出甘草“增強藥效”的作用；當濃度高于一定范圍，菊花-甘草藥物組合的抑制率呈現平緩趨勢，體現出甘草“緩和藥性”的作用，以其溫性緩和菊花之寒性，體現了菊花和甘草并用的必要性以及配伍的科學性，表明中藥方劑及中藥組合用藥并非簡單的機械相加，而是相輔相成又各司其職。本研究為含菊花的傳統復方的開發(fā)和利用提供了理論基礎，對推動含菊花組方大健康產品的開發(fā)和利用具有重要的意義。同時，本研究為其他同類中藥的配伍提效研究提供了思路。

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