從“非主流”到“主流”的華麗轉(zhuǎn)身：miRNA如何逆天改命

微RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在不同的細胞活動及生命進程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。1993年，安布羅斯（V.Ambros）和魯夫昆（G.Ruvkun）在《細胞》（Cell）雜志以背靠背形式發(fā)表兩篇研究論文[1，2]，驚人地發(fā)現(xiàn)秀麗隱桿線蟲（C.elegans，以下簡稱線蟲）中22個核苷酸的lin-4竟能與lin-14mRNA的3’UTR部分互補，從而抑制其翻譯成蛋白質(zhì)。然而，由于lin-4僅存在線蟲中，這一重要發(fā)現(xiàn)被當時的科學(xué)界所忽視。7年后，魯夫昆團隊在線蟲中發(fā)現(xiàn)第二個miRNA——let-7，不僅能靶向lin-413’UTR降低其表達，而且在果蠅和斑馬魚等動物界高度保守[3]。隨后，成千上萬的miRNA在人以及小鼠、擬南芥等動植物中被發(fā)現(xiàn)，由此開啟了RNA調(diào)控基因的全新領(lǐng)域。目前，miRNA靶向抑制基因理論已經(jīng)成為經(jīng)典，但卻讓miRNA研究由“熱”轉(zhuǎn)“冷”。近些年，核內(nèi)miRNA靶向增強子激活基因理論正悄然興起，能否借諾貝爾獎之東風(fēng)掀起miRNA研究的新浪潮，讓我們拭目以待！

興趣碰撞開啟miRNA新紀元

1953年，安布羅斯出生于美國新罕布什爾州，家里有8個孩子，其父親是波蘭人，因躲避戰(zhàn)火連中學(xué)都沒有念完。他為父親感到惋惜，懂得珍惜學(xué)習(xí)機會，自小立志成為一名科學(xué)家。他在申請麻省理工學(xué)院（MIT）讀書時就表明，“我想當個科學(xué)家”。隨后，他進入MIT學(xué)習(xí)天文，但發(fā)現(xiàn)自己對物理學(xué)興趣一般，在室友的熏陶下，癡迷于揭示分子生物與基因組學(xué)的奧秘，徹底愛上了分子生物學(xué)。在博士期間，他師從巴爾的摩教授（D.Baltimore，1975年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎），研究脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制。在此期間，霍維茨教授（H.R.Horvitz，2002年獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎）來到MIT建立實驗室，進行了線蟲研究的學(xué)術(shù)報告，讓安布羅斯對線蟲產(chǎn)生濃厚興趣。1979年，他加入霍維茨實驗室進行博士后訓(xùn)練，研究lin-4和unc-86對線蟲發(fā)育的調(diào)控作用。

1952年，魯夫昆出生在美國加州伯克利市的猶太家庭，其父母鼓勵他對科學(xué)的熱愛。童年時期，他對科學(xué)充滿興趣，因愛好無線電，對電子學(xué)和物理學(xué)很著迷，后來他進入加州大學(xué)伯克利分校學(xué)習(xí)電氣工程。1973年，魯夫昆獲得學(xué)士學(xué)位，恰逢經(jīng)濟蕭條，對未來困惑不已。于是，他買了一輛面包車，沿美國西海岸旅行直到玻利維亞，曾嘗試應(yīng)聘電臺DJ等工作都未成功，最后得到酒吧的種樹工作，與滿懷理想的年輕嬉皮士共同種樹和生活。然而，一次偶然的機會，他被《科學(xué)美國人》雜志所吸引，內(nèi)心科研的火種被再次點燃，命運的齒輪也由此反轉(zhuǎn)。1976年，他返回美國進入哈佛大學(xué)攻讀博士學(xué)位，師從植物分子生物學(xué)家奧蘇貝爾（F.Ausubel），并共同解開了植物固氮的諸多謎團。1982年，他獲得生物物理學(xué)博士學(xué)位后，決定改變研究方向，在哈佛大學(xué)吉爾伯特（W.Gilbert，1980年獲諾貝爾化學(xué)獎）和MIT的霍維茨實驗室進行博士后研究，關(guān)注線蟲發(fā)育相關(guān)的信號通路，并與安布羅斯相遇。

1980年代，安布羅斯和魯夫昆在霍維茨實驗室中共同探究lin-14在線蟲發(fā)育中的作用機制，但并未解開未知之謎。隨后，他們分別加入哈佛大學(xué)的不同團隊繼續(xù)聚焦lin-14研究，盡管兩人保持相對獨立，但又緊密合作。后來，安布羅斯和魯夫昆分別獨立推導(dǎo)lin-4和lin-14的序列信息，在1992年6月11日晚上交換彼此的結(jié)果，對比后驚奇地發(fā)現(xiàn)，lin-4非編碼RNA在lin-14mRNA的3’UTR存在多個結(jié)合位點，像拉鏈一樣吻合。兩個團隊進一步證實lin-4通過結(jié)合在lin-14mRNA的3’UTR抑制其翻譯，并于1993年將論文同時發(fā)表在《細胞》雜志上[1，2]。一種以miRNA為媒介的新型基因調(diào)控方式被發(fā)現(xiàn)，但當時并未引起科學(xué)界的關(guān)注。直到2000年，魯夫昆團隊證實線蟲中l(wèi)et-7在動物界具有高度保守性[3]，突顯了miRNA抑制基因的普適性，才正式開啟miRNA研究新領(lǐng)域。

miRNA掌控細胞命運轉(zhuǎn)換

研究表明，miRNA生成是一個被精心編排的生物學(xué)過程。首先，在細胞核內(nèi)，基因組DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生長鏈的初級miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA），通常包含一個或多個發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，是miRNA成熟的關(guān)鍵信號。接著，DGCR8蛋白與Drosha酶等相互作用并結(jié)合pri-miRNA，Drosha酶將pri-miRNA剪切成約70個核苷酸長的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。然后，pre-miRNA在exportin-5蛋白協(xié)助下，從細胞核被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，被Dicer酶進一步剪切形成雙鏈RNA，與AGO蛋白組成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（miRNA-inducedsilencingcomplex，miRISC）并完成雙鏈解旋，最終導(dǎo)致RNA雙鏈中僅有一條鏈與AGO蛋白穩(wěn)定結(jié)合，該鏈被稱為引導(dǎo)鏈，即成熟miRNA。目前，最全面的miRNA公共數(shù)據(jù)庫——miRBase已收錄來自271個物種、超過4萬個miRNA的信息，其中，人類miRNA共1917個，可能在疾病和發(fā)育進程中起重要的調(diào)控作用。

miRNA通過調(diào)控基因表達影響細胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)功能，在個體發(fā)育、行為表現(xiàn)以及疾病發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。例如，最早發(fā)現(xiàn)的兩個miRNA——lin-4和let-7都能調(diào)控線蟲的發(fā)育時序。其中，lin-4通過抑制lin-14和lin-28表達，分別調(diào)控線蟲L1～L2期和L2～L3期的轉(zhuǎn)變[1]；let-7通過調(diào)控lin-41、hbl-1等靶基因，調(diào)控線蟲從L4期到成蟲的轉(zhuǎn)變[4]。另外，miR-iab4/iab8突變則顯著影響果蠅幼蟲的自我糾正能力[5]，進而影響其行為表現(xiàn)。然而，miRNA表達異常則導(dǎo)致靶基因表達失控，與腫瘤、自身免疫性疾病以及神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。以乳腺癌為例，低表達的miR-339通過降低抑癌基因表達促進乳腺癌發(fā)生發(fā)展[6]。那么，miRNA如何影響個體發(fā)育和疾病進程呢？

我們認為，miRNA通過改變時空維度上細胞的身份及狀態(tài)影響發(fā)育和疾病過程。事實上，miRNA具有很強的組織細胞特異性，如肌肉特異性miR-1和肝臟特異性miR-122等。其中，小鼠miR-122隨著胚胎發(fā)育逐漸升高，在出生時急劇升高，這與出生后肝臟代謝功能密切相關(guān)。另外，小鼠被敲除miR-122后導(dǎo)致脂肪在肝臟積累，逐漸獲得脂肪細胞儲肪功能，丟失部分肝臟細胞排除脂肪的能力，引起肝炎，最終在11月齡時發(fā)展成肝癌。此外，miR-17～92家族參與Th細胞身份的塑造，而miR-7在成熟的胰腺β細胞身份維持中發(fā)揮重要作用。因此，miRNA組織特異性表達的特征與細胞特定身份密切相關(guān)，其異常表達會造成細胞身份轉(zhuǎn)變及疾病發(fā)生與進展，但具體作用機制尚不完全清楚。

NamiRNA打破基因沉默的魔咒

目前，沉默基因表達是miRNA調(diào)控基因的經(jīng)典途徑，主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。在細胞質(zhì)中，成熟miRNA與AGO蛋白形成miRISC復(fù)合體并通過堿基互補配對原則與mRNA結(jié)合，負向調(diào)節(jié)其翻譯效率和穩(wěn)定性抑制基因表達。一方面，miRISC復(fù)合體通過阻止翻譯起始因子被招募到mRNA的5’端非編碼區(qū)或者影響核糖體沿mRNA的移動，抑制核糖體的翻譯[7]。另一方面，miRISC復(fù)合體會激活去腺苷化酶，將mRNA3’端的多腺苷酸尾切除，進一步導(dǎo)致mRNA的5’端帽結(jié)構(gòu)丟失，加速mRNA被核酸外切酶降解，降低基因表達。然而，動植物中miRNA與mRNA的結(jié)合方式并不完全相同。在植物中，miRNA常以完全匹配的方式結(jié)合mRNA并形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)沉默基因表達，而在動物中，miRNA與mRNA的結(jié)合通常是不完全匹配的，極大增加miRNA抑制靶標結(jié)合位點預(yù)測的復(fù)雜性和難度[8]。與此相反，miRNA能與啟動子相互作用以非經(jīng)典途徑在轉(zhuǎn)錄水平上激活基因表達。例如，細胞核中的miR-373能夠與E-鈣黏蛋白基因的啟動子區(qū)域序列互補并促進mRNA的轉(zhuǎn)錄，揭示miRNA更為復(fù)雜的生物學(xué)功能。

近些年，復(fù)旦大學(xué)于文強團隊發(fā)現(xiàn)了一種全新的非經(jīng)典途徑——細胞核內(nèi)miRNA靶向增強子激活基因轉(zhuǎn)錄，并將這類miRNA命名為核內(nèi)激活miRNA（nuclearactivatingmiRNA，NamiRNA）。2009年，該團隊發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA在基因組位置上與基因激活元件增強子高度重疊，提示miRNA可能具有激活基因的功能。經(jīng)過8年潛心研究，團隊證實miRNA能夠定位于細胞核內(nèi)，并揭示了核內(nèi)miRNA激活基因的功能機制，創(chuàng)造性地提出了NamiRNA-增強子-基因激活的全新理論[9，10]。NamiRNA指的是一類在細胞核內(nèi)的miRNA，能夠通過與增強子相互作用促進基因轉(zhuǎn)錄。具體來說[10]，miRNA作為楔子，打開基因組DNA雙鏈，AGO2識別增強子與miRNA的雜交鏈，維持DNA單鏈狀態(tài)，促進RNA聚合酶Ⅱ?qū)虻霓D(zhuǎn)錄。事實上，NamiRNA不僅能夠激活與其位置相鄰的靶基因表達，還能夠激活全基因組范圍內(nèi)的基因表達，從而影響細胞身份及功能改變。NamiRNA的發(fā)現(xiàn)開啟了一個新的研究領(lǐng)域，實現(xiàn)了miRNA從沉默基因到激活基因的華麗轉(zhuǎn)身，為miRNA的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了新的視角和方向。

借諾貝爾獎東風(fēng)創(chuàng)miRNA研究新浪潮

截至2024年12月，PubMed檢索“miRNA”文章已超過17萬篇，涵蓋病毒、細菌、真菌、植物和動物自然界五大類生物，不僅揭示了miRNA調(diào)控微生物繁殖及對宿主的作用，而且探究了miRNA在動植物的發(fā)育及不同疾病過程的重要作用，尤其在miRNA的生成加工過程、生物功能以及基因調(diào)控模式等方面都取得很大進展。然而，miRNA文章自2021年開始逐年減少，2024年發(fā)文總量銳減近50%，似乎意味著miRNA研究正由“盛”轉(zhuǎn)“衰”，其背后原因值得我們深思。

首先，miRNA的基礎(chǔ)研究似乎早已陷入“科研怪圈”：過表達miRNA能夠誘導(dǎo)基因的差異表達，但大多數(shù)研究者僅僅關(guān)注下調(diào)的基因，對上調(diào)基因視而不見。相應(yīng)地，miRNA上調(diào)基因的研究少之又少，且主要是miRNA通過沉默中間基因?qū)е孪掠位虻纳险{(diào)。那么，miRNA能否激活基因？如前所述，答案是肯定的。如何探究其正向的基因調(diào)控作用呢？NamiRNA-增強子-基因激活理論為科研工作者指明了具體方向，細胞核內(nèi)的miRNA可以作為激活劑，活化基因組增強子并與其相互作用，打開DNA雙鏈，激活基因轉(zhuǎn)錄。目前，NamiRNA研究尚處于早期階段，還有諸多未知值得深入探究。我們相信，在不遠的未來，NamiRNA研究的新生力量必將涌現(xiàn)，共同實現(xiàn)miRNA基礎(chǔ)研究的繁榮與復(fù)興！

其次，miRNA的臨床應(yīng)用似乎總是“撲朔迷離”，尤其是成藥極其困難。2008年，丹麥制藥公司SantarisPharma宣布SPC3649（Miravirsen）進入臨床試驗，是全球首個靶向miRNA的核酸藥物，能特異性結(jié)合miR-122，旨在降低丙肝病毒（hepatitisCvirus，HCV）載量。隨后的臨床Ⅱ期試驗顯示，該藥物用于慢性丙肝病毒感染患者呈現(xiàn)劑量依賴性的丙肝病毒RNA的降低[11]，但后報道稱Miravirsen會誘導(dǎo)HCV的UTR區(qū)域突變，沒有進一步的進展。2016年，首個miR-34a類似物MRX34的多中心臨床I期試驗因嚴重的免疫副作用致死而終止[12]。目前，尚無臨床可用的靶向miRNA核酸藥物。近些年，核酸藥物的修飾以及遞送系統(tǒng)已取得巨大進步，不僅能降低核酸藥物的免疫原性，而且能促進其向靶組織器官的運輸。那么，決定miRNA成藥的關(guān)鍵是什么呢？我們認為，靶點篩選是miRNA成藥的核心，而篩選策略是重中之重。與經(jīng)典抑制理論不同，NamiRNA-增強子-基因激活理論讓我們更關(guān)注miRNA對全基因組的激活作用，有望引領(lǐng)一種全新的miRNA篩選潮流，突破miRNA成藥難的困境。我們期待，藥物研發(fā)團隊及生物醫(yī)藥企業(yè)能夠重拾信心，提升靶向miRNA核酸藥物的研發(fā)投入，加快miRNA的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化！

借著諾貝爾獎的東風(fēng)，miRNA研究2.0時代已經(jīng)開啟，讓我們共同努力，推動基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，催生臨床可用的靶向miRNA核酸藥物，為人類與疾病的斗爭貢獻力量！

[1]LeeRC，F(xiàn)einbaumRL，AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell，1993，75（5）：843-854.

[2]WightmanB，HaI，RuvkunG.Posttranscriptionalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans.Cell，1993，75（5）：855-862.

[3]PasquinelliAE，ReinhartBJ，SlackF，etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature，2000，408（6808）：86-89.

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關(guān)鍵詞：諾貝爾獎miRNA沉默基因NamiRNA基因激活■