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    不同生長(zhǎng)年份牛大力根淀粉和蔗糖代謝途徑轉(zhuǎn)錄組分析

    2025-01-12 00:00:00羊青顧學(xué)金王清隆張旻晏小霞湯歡王祝年馮世秀王茂媛
    熱帶作物學(xué)報(bào) 2025年1期
    關(guān)鍵詞:年份蔗糖淀粉

    摘""要:牛大力是一種重要的多年生藥食同源植物,其主要成分為淀粉和糖類。為了探究不同生長(zhǎng)年份牛大力根淀粉和糖類物質(zhì)合成的規(guī)律及其內(nèi)在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),本研究以3年生(NG3)、7年生(NG7)、10年生(NG10)和15年生(NG15)4個(gè)生長(zhǎng)年份的牛大力根為研究對(duì)象,測(cè)定總多糖、淀粉和蔗糖的含量,并完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,篩選分析不同年份間牛大力根的差異表達(dá)基因(DEGs),重點(diǎn)解析淀粉和蔗糖代謝途徑DEGs的功能。糖類和淀粉物質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明,隨著年份的增長(zhǎng),總多糖與淀粉含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì),生長(zhǎng)至15年時(shí)的含量最高,而蔗糖含量在3年時(shí)最高,隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),隨著生長(zhǎng)年份跨度增加,NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15對(duì)比的DEGs總數(shù)呈上升趨勢(shì),分別為526、1848和1937個(gè)。進(jìn)一步挖掘淀粉和蔗糖代謝途徑中的DEGs,共有62個(gè)DEGs在3個(gè)比較組中差異表達(dá),其中,蔗糖合成基因的表達(dá)量隨年份增加而下降,淀粉合成基因隨年份的增加較淀粉降解基因占主導(dǎo),纖維素降解酶隨年份增加表達(dá)量降低。最終篩選出5個(gè)淀粉和蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,其表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致。研究結(jié)果表明,牛大力在3~7年時(shí)處于生長(zhǎng)活躍期,以蔗糖、纖維素和淀粉的合成為主,促進(jìn)根部快速膨大發(fā)育。生長(zhǎng)至7年時(shí),以淀粉的積累、蔗糖的分解和纖維素的降解為特征,進(jìn)入生長(zhǎng)平穩(wěn)期。本研究對(duì)于牛大力根膨大特性的研究、高成薯性牛大力種質(zhì)創(chuàng)新和科學(xué)采收都有積極的指導(dǎo)意義。

    關(guān)鍵詞:牛大力;根;生長(zhǎng)年份;淀粉;蔗糖代謝;轉(zhuǎn)錄組分析中圖分類號(hào):S567.19""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    Transcriptome"Analysis"Related"to"Starch"and"Sucrose"Metabolism"Pathways"of"C."specisoa"at"Different"Developmental"Stages

    YANG"Qing1,"GU"Xuejin2,"WANG"Qinglong1,"ZHANG"Min3,"YAN"Xiaoxia1,"TANG"Huan1,"WANG"Zhunian1,"FENG"Shixiu3,"WANG"Maoyuan1*

    1."Tropical"Crops"Genetic"Resources"Institute,"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Cultivation"of"Herb"Medicine"(Haikou),"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Tropical"Wild"Plant"Gene"Resource,"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Provincial"Engineering"Research"Center"for"Tropical"medicinal"plants,"Haikou,"Hainan"571101,"China;""2."College"of"Tropical"Crops,"Yunnan"Agricultural"University,"Pu’er,"Yunnan"665001,"China;"3."Fairy"Lake"Botanical"Garden,"Shenzhen"amp;"Chinese"Academy"of"Sciences"/"Key"Laboratory"of"South"Subtropical"Plant"Diversity,"Shenzhen,"Guangdong"518004,"China

    Abstract:"Callerya"speciosa"is"an"important"perennial"medicinal"and"edible"plant,"with"starch"and"saccharides"as"the"main"contents."This"study"investigated"the"development"law"of"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"of"C."specisoa"at"different"developmentalnbsp;stages"and"its"internal"gene"regulatory"network."Four"growth"years"of"C."speciosa"roots,"including"3-year-old"(NG3),"7-year-old"(NG7),"10-year-old"(NG10),"and"15-year-old"(NG15),"were"used"as"the"research"objects."The"content"of"total"polysaccharide,"starch,"and"sucrose"was"determined,"and"transcriptome"sequencing"was"carried"out."Differentially"expressed"genes"(DEGs)"between"different"years"were"screened,"and"the"functions"of"DEGs"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"were"focused"on."The"results"showed"that"with"the"increase"of"years,"the"content"of"total"polysaccharides"and"starch"both"showed"an"increasing"trend,"with"the"highest"content"at"15"years,"while"the"sucrose"content"was"the"highest"at"3"years,"followed"by"a"downward"trend."Through"transcriptome"sequencing,"NG3"was"compared"with"NG7,"NG10,"and"NG15,"respectively,"for"intergroup"gene"expression"analysis."With"the"increase"of"the"growth"year"span,"the"total"number"of"DEGs"increased."To"further"explore"DEGs"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways,"a"total"of"62"DEGs"were"differentially"expressed"in"the"three"comparison"groups,"mainly"participating"in"the"regulation"of"starch,"sucrose,"and"cellulose"metabolism."Among"them,"the"expression"of"sucrose"synthesis"genes"decreased"with"the"increase"of"years;"the"expression"of"starch"synthesis"genes"dominated"over"starch"degradation"genes"with"the"increase"of"years;"and"the"expression"of"cellulose"degradation"enzymes"decreased"with"the"increase"of"years."Five"key"genes"in"the"starch"and"sucrose"metabolism"pathways"were"screened"out"for"fluorescence"quantitative"PCR"verification,"and"the"expression"trend"was"basically"consistent"with"the"transcriptome"sequencing"results."The"results"indicate"that"C."speciosa"is"in"the"growth"active"period"from"3"to"7"years,"with"the"synthesis"of"sucrose,"cellulose,"and"starch"as"the"main"promoters"for"rapid"root"expansion"and"development."When"it"grows"to"7"years,"the"plant"enters"a"stable"growth"phase"characterized"by"starch"accumulation,"sucrose"decomposition,"and"cellulose"degradation."This"research"would"provide"valuable"insights"on"the"study"of"C."speciosa"root"expansion"mechanism,"the"innovation"of"high-yielding"varieties,"and"scientifically"guided"harvesting"practices.

    Keywords:"Callerya"speciosa;"root;"developmental"stages;"starch;"sucrose"metabolism;"transcriptome"analysis

    DOI:"10.3969/j.issn.1000-2561.2025.01.003

    牛大力為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya"speciosa"(Champion"ex"Bentham)"Schot],是多年生藥食兩用植物,以根入藥,主產(chǎn)我國(guó)廣東、廣西和海南等地。牛大力是華南地區(qū)重要的煲湯食材,也是壯腰健腎丸、舒筋健腎丸的主要配伍藥材,具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺和強(qiáng)筋活絡(luò)的功能。牛大力現(xiàn)作為新資源食品,產(chǎn)品開(kāi)發(fā)類型多樣,市場(chǎng)需求旺盛,原料價(jià)格逐年上漲。人工種植是牛大力的主要來(lái)源,以廣東和和海南兩省種植面積較大。牛大力根兼有膨大根和非膨大根的雙重特征,一般栽培1年后側(cè)根開(kāi)始膨大,3年以上膨大根系發(fā)達(dá),膨大達(dá)到一定程度方可采收。據(jù)報(bào)道,綜合產(chǎn)量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和指標(biāo)成分含量,其最佳采收年限為5~7年左右,但在實(shí)際生產(chǎn)中亦有種植期在7~10年甚至以上的牛大力,民間習(xí)慣認(rèn)為,生長(zhǎng)年份越久,其根(膨大根)的品質(zhì)越高[1-4]。

    利用基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù),解析藥用植物的形態(tài)發(fā)育過(guò)程、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成和藥效物質(zhì)積累的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),是當(dāng)前中藥產(chǎn)業(yè)科學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵步驟。近年來(lái),基于全基因組解析的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析成為藥用植物研究熱點(diǎn),包括人參、石斛、三七、丹參、銀杏、金銀花和當(dāng)歸等多種藥用植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已被分析獲取。牛大力含淀粉、粗纖維、蛋白質(zhì)和三萜、黃酮、酚苷等多種活性物質(zhì),在生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段,其外觀形態(tài)和內(nèi)在物質(zhì)積累都在發(fā)生階段性的變化。牛大力根系膨大調(diào)控的關(guān)鍵基因研究一直備受關(guān)注,無(wú)參轉(zhuǎn)錄組的分析取得了一系列的進(jìn)展,主要集中在淀粉合成基因、蔗糖代謝基因和黃酮類物質(zhì)生物合成關(guān)鍵基因方面[5-8]。研究結(jié)果表明,牛大力膨大根的形成和發(fā)育與淀粉、蔗糖、植物激素和細(xì)胞壁發(fā)育密切相關(guān)[9-10]。不同生長(zhǎng)年份牛大力根淀粉和多糖的動(dòng)態(tài)變化及其調(diào)控的分子機(jī)制,卻鮮有報(bào)道。

    因此,本研究以3、7、10、15年株齡的牛大力塊根為研究對(duì)象,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究,參考已發(fā)表的牛大力基因組數(shù)據(jù)[11],對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類和功能注釋。以年份跨度為分組依據(jù),篩選和富集差異表達(dá)基因和代謝通路。重點(diǎn)對(duì)牛大力發(fā)育過(guò)程中淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和分析,并結(jié)合總多糖、淀粉和蔗糖含量的測(cè)定,解析牛大力發(fā)育過(guò)程中淀粉和蔗糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)情況和規(guī)律,以期能夠科學(xué)揭示牛大力品質(zhì)形成的規(guī)律,并為牛大力的精準(zhǔn)育種和品質(zhì)提升提供科學(xué)的依據(jù),推動(dòng)其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

    1""材料與方法"

    1.1""材料

    研究材料采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所藥用植物資源圃,經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院王祝年研究員鑒定為豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤[Callerya"speciosa"(Champion"ex"Bentham)"Schot]。于2021年10月,分別選擇3年生(NG3)、7年生(NG7)、10年生(NG10)和15年生(NG15)牛大力植株各9株,每3株牛大力的塊根合并為1份即1個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生長(zhǎng)年份設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),用于RNA數(shù)據(jù)采集。具體取樣方法為:沿牛大力根際周邊開(kāi)挖,深度80~100"cm。采挖后選擇直徑4~8"cm的塊根,截取20"cm使用PBS水沖洗并擦拭干凈,再分別從前、中、后部迅速切取厚度0.5"cm的切片,包裹于錫箔紙中,做好標(biāo)記,置液氮罐冷凍,于24"h后轉(zhuǎn)入–80"℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2""方法

    1.2.1""總多糖、淀粉和蔗糖含量測(cè)定""取不同年份牛大力的根樣本,使用Eyela"FDU-2110冷凍干燥機(jī)(日本EYELA東京理化器械株式會(huì)社)冷凍干燥后,研磨粉碎,使用Bio"Tek"EON多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司),按照總多糖、植物淀粉含量和蔗糖含量試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)說(shuō)明書測(cè)定各組樣本中總多糖、淀粉和蔗糖含量。

    1.2.2""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格執(zhí)行。首先使用TRI@Regent試劑盒提取牛大力根樣本的總RNA,經(jīng)純度、濃度和完整性檢測(cè),質(zhì)檢合格后構(gòu)建cDNA文庫(kù)。使用Agilent"2100"bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的insert"size進(jìn)行檢測(cè),庫(kù)檢合格后采用Illumina"NovaseqTM6000進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序讀長(zhǎng)為雙端2×150"bp(PE150)。為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,過(guò)濾去除帶接頭的reads、含N的reads和低質(zhì)量的reads后得到clean"reads。將clean"reads使用Hisat2進(jìn)行牛大力參考基因組比對(duì),根據(jù)Hisat2的比對(duì)結(jié)果,使用StringTie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本并計(jì)算每個(gè)樣本中的所有基因的表達(dá)水平。

    1.2.3"""差異表達(dá)基因分析""使用FPKM值對(duì)樣本基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化,根據(jù)比較組內(nèi)基因的表達(dá)情況進(jìn)行差異分析。以差異倍數(shù)(fold"change)≥2,即|log2"(Fold"Change)|≥1,且q值(p值的校正值)lt;0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選差異表達(dá)基因(differentially"expressed"genes,"DEGs)。通過(guò)完成對(duì)DEGs的整體分布情況、GO和KEGG分析,結(jié)合特定的KEGG通路和GO注釋等信息,對(duì)重要代謝通路及關(guān)鍵基因進(jìn)行篩選。運(yùn)用SPSS"21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(oneway"analysis,ANOVA),數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

    1.2.4""實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析""從牛大力轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中篩選出5個(gè)在淀粉和蔗糖代謝途徑中表達(dá)量相對(duì)較高的關(guān)鍵基因,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。根據(jù)qPCR引物設(shè)計(jì)原則,使用Geneious軟件設(shè)計(jì)各候選基因的引物(表1),擴(kuò)增子長(zhǎng)度控制在120~200"bp之間,由蘇州金唯智生物科技有限公司完成引物合成。取不同年份牛大力的根為材料,以actin作為內(nèi)參,按照SYBR"Premix"Ex"Taq反應(yīng)體系[12]進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),采用2–??Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)總體積20"μL,包括2×ChamQ"SYBR"Color"qPCR"Master"Mix"10"μL、Prime"1"0.4"μL、Primer"2"0.4"μL、50×"ROX"Reference"Dye"1"0.4"μL、Template"DNA/cDNA"5.8"μL、ddH2O"3"μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5"℃"30"s;95"℃"10"s,60"℃"30"s,40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后,以1"℃/"4"s"的速率從60"℃逐步遞增到95"℃,獲得溶解曲線。

    2""結(jié)果與分析

    2.1""不同生長(zhǎng)年份牛大力總多糖、淀粉和蔗糖含量的動(dòng)態(tài)變化

    本研究前期發(fā)現(xiàn),低年份(3~7年)的牛大力根處于快速膨大期,然后進(jìn)入高年份(10~15年)的穩(wěn)定生長(zhǎng)期,隨著年份的增長(zhǎng),其外觀形態(tài)和物質(zhì)積累的差異不斷縮小,根的橫切面由低年份的黃色粗糙的纖維結(jié)構(gòu)向高年份白色細(xì)膩的淀粉結(jié)構(gòu)過(guò)度(圖1A),淀粉含量顯著增加[13]。通過(guò)測(cè)定不同生長(zhǎng)年份牛大力根中的總多糖、淀粉和蔗糖含量發(fā)現(xiàn),隨著年份的增長(zhǎng),總多糖與淀粉含量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì),而蔗糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1B)??偠嗵呛吭?~10年間平穩(wěn)增

    長(zhǎng),10~15年間顯著增長(zhǎng)(Plt;0.05)。與NG3比,總多糖含量在NG10和NG15中的增長(zhǎng)明顯,差異顯著(Plt;0.05)。淀粉在生長(zhǎng)過(guò)程中大量積累,其含量在3~10年間顯著增長(zhǎng)(Plt;0.05),10~15年間平穩(wěn)增長(zhǎng),與NG3比,淀粉含量在NG7、NG10和NG15中的增長(zhǎng)明顯,差異顯著(Plt;0.05)。蔗糖含量在3~15年間隨著生長(zhǎng)年份增加逐漸下降,在相鄰階段變化不顯著,而與NG3比,蔗糖含量在NG10和NG15中的降低趨勢(shì)明顯,差異顯著(Plt;0.05)。結(jié)果表明,在淀粉和蔗糖代謝途徑中,蔗糖與總多糖和淀粉含量的積累整體呈負(fù)相關(guān),可能是以淀粉-蔗糖相互轉(zhuǎn)化為主要模式[14-16]。

    2.2""轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

    基于Illumina測(cè)序平臺(tái),對(duì)4個(gè)生長(zhǎng)年份的牛大力根樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,總共獲得了80.66"Gb的clean"bases。各樣品clean"data的Q20的比率均超過(guò)了97.97%,Q30的比率均超過(guò)了93.83%,說(shuō)明RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)量較好,測(cè)序數(shù)據(jù)可靠度高,掃描下方二維碼(圖2),可查看轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)12個(gè)轉(zhuǎn)錄組樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行參考基因組比對(duì)分析,共獲得41"461個(gè)基因和62"501個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)數(shù)據(jù),基因比對(duì)的匹配率在79.10%~"85.84%之間。表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,基因的注釋率高,能夠開(kāi)展后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

    2.3""差異表達(dá)基因篩選分析

    2.3.1""差異基因表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)""本研究對(duì)4個(gè)年份牛大力根的轉(zhuǎn)錄組樣本進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEGs)篩選,將NG3分別與NG7、NG10和NG15對(duì)比,進(jìn)行組間基因的表達(dá)情況分析。由3個(gè)比較組中篩選的DEGs數(shù)量及其上、下調(diào)表達(dá)情況(圖3A)可知,在3~15年的生長(zhǎng)時(shí)期,隨著生長(zhǎng)年份跨度增加,DEGs總數(shù)呈增長(zhǎng)趨勢(shì),且各組上調(diào)與下調(diào)基因的比例有一定的變化。其中,在NG3"vs"NG7組中DEGs數(shù)量最少,有526個(gè)(205個(gè)上調(diào)和321個(gè)下調(diào));而另外2組的DEGs總數(shù)明顯增加,NG3"vs"NG10組中有1848個(gè),以上調(diào)DEGs為主;NG3"vs"NG15組有1937個(gè),下調(diào)DEGs數(shù)量增加,可能與單糖、多糖和淀粉的合成有關(guān)。

    進(jìn)一步分析3個(gè)比較組中DEGs的重疊和特異性情況(圖3B)發(fā)現(xiàn),3組共有DEGs僅有83個(gè),NG3"vs"NG7組和其他2組的DEGs重疊部分相對(duì)較少,分別有86個(gè)和93個(gè),而NG3"vs"NG10組和NG3"vs"NG15組之間重疊最多,有580個(gè);各組特有DEGs以NG3"vs"NG7組的數(shù)量最少(264個(gè)),而另外2組的特有DEGs數(shù)量更多,NG3"vs"NG15組有1181個(gè),NG3"vs"NG10組有1099個(gè)。結(jié)果說(shuō)明,隨著生長(zhǎng)年份跨度增加,DEGs的數(shù)量明顯增加,牛大力不同生長(zhǎng)階段內(nèi)在物質(zhì)發(fā)生著明顯的變化。

    2.3.2""差異表達(dá)基因的功能富集分析""對(duì)3個(gè)比較組NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15富集的GO"term差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋,結(jié)果分為生物過(guò)程(biological"process)、細(xì)胞組分(cellular"component)和分子功能(molecular"function)。在3個(gè)比較組中,均以生物學(xué)過(guò)程類別注釋GO"term的最多,將3個(gè)類別前25、前15、前10的GO"term進(jìn)行展示(圖4),細(xì)胞組分中含有DEGs數(shù)目較多。進(jìn)一步根據(jù)富集程度對(duì)前20的GO"term進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)3個(gè)比較組中共有條目多與細(xì)胞壁發(fā)育以及木質(zhì)素、木聚糖等相關(guān)物質(zhì)的代謝活動(dòng)有關(guān)(圖5)。其中,在NG3"vs"NG7組中顯著富集的GO"term主要有調(diào)節(jié)防御反應(yīng)(regulation"of"defense"response)、葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性(glucose-1-phosphate"adenylyltransferase"activity)和對(duì)強(qiáng)光照的反應(yīng)(response"to"high"light"intensity)等;在NG3"vs"NG10組中有糖基轉(zhuǎn)移酶活性(glycosyltransferase"activity)、氧化還原酶活性(oxidoreductase"activity)、作用于金屬離子(acting"on"metal"ions)等;NG3"vs"NG15組是年份跨度最大的比較組,顯著富集于苯丙素生物合成過(guò)程(phenylpropanoid"bios ynthetic"process)、晝夜節(jié)律(circadian"rhythm)和次生代謝物生物合成過(guò)程(secondary"metabolite"biosynthetic"process)。

    KEGG富集分析結(jié)果中位居前20的pathway如圖6所示,3個(gè)比較組中均顯著富集的pathway為單萜生物合成(monoterpenoid"biosynthesis),2組共富集的pathway有苯丙素生物合成(phenylpropanoid"biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(starch"and"sucrose"metabolism)、氨基酸糖和核苷酸糖(amino"sugar"and"nucleotide"sugar"metabolism)、苯丙氨酸(phenylalanine"metabolism)以及果糖和甘露糖、亞油酸代謝和植物的晝夜節(jié)律等。

    GO和KEGG富集分析結(jié)果表明,在牛大力根的不同生長(zhǎng)階段,DEGs與細(xì)胞壁發(fā)育及其關(guān)聯(lián)物質(zhì)的代謝活動(dòng)相關(guān),主要涉及碳水化合物代謝、氨基酸代謝、糖合成和次生代謝物合成相關(guān)途徑。說(shuō)明不同年份的牛大力根的差異主要體現(xiàn)

    在碳水化合物和活性物質(zhì)的積累方面。本研究前期發(fā)現(xiàn),隨著生長(zhǎng)年份的增加,牛大力根的橫切面由黃色粗糙的纖維結(jié)構(gòu)(低年份)向白色細(xì)膩的淀粉結(jié)構(gòu)(高年份)過(guò)度,淀粉含量顯著增加[17]。因此,進(jìn)一步圍繞牛大力根淀粉和蔗糖代謝途徑(map"00500)中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行研究。

    2.4""淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達(dá)基因分析

    2.4.1""淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達(dá)基因篩選""在牛大力根的4個(gè)生長(zhǎng)階段,注釋到511個(gè)KEGG通路上的unigenes參與淀粉和蔗糖代謝。將NG3"vs"NG7、NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15三個(gè)比較組進(jìn)行分析,共篩選到62個(gè)DEGs,NG3"vs"NG15組中最多,有38個(gè)DEGs,21個(gè)上調(diào),17個(gè)下調(diào);其次是NG3"vs"NG10組,有35個(gè)DEGs,以上調(diào)為主(28個(gè));NG3"vs"NG7組最少,有18個(gè)DEGs,以下調(diào)為主(13個(gè))。由圖7A可知,3個(gè)比較組共有的DEG只有1個(gè),特有的DEGs,NG3"vs"NG7組有8個(gè),NG3"vs"NG10組有14個(gè),NG3"vs"NG15組有12個(gè)。共有45個(gè)DEGs與淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān),詳細(xì)的基因注釋信息見(jiàn)圖8(掃描二維碼,即可查看)。進(jìn)一步通過(guò)層析聚類熱圖(圖7B)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化,分析DEGs在3個(gè)比較組中的表達(dá)情況。富集到淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs中,NG3中顯著上調(diào)的DGEs相對(duì)較多,與NG7、NG10和NG15的表達(dá)情況差異較大,與NG7中的DGEs有一定的關(guān)聯(lián);另外3個(gè)年份中以NG10的DEGs最少,鄰近年份之間有少量DEGs有一定的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明,在牛大力根的不同生長(zhǎng)階段,富集到淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs多為編碼植物糖代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶基因。在生長(zhǎng)年份跨度增大的2個(gè)比較組NG3"vs"NG10和NG3"vs"NG15中,DEGs總數(shù)和特有數(shù)目均增加,與糖代謝關(guān)鍵酶基因存在階段性的特異表達(dá),催化淀粉和蔗糖代謝途徑中重要代謝物的合成、分解及相互轉(zhuǎn)化。

    2.4.2""淀粉和蔗糖代謝途徑差異基因表達(dá)趨勢(shì)""基于上述層次聚類熱圖分析,參與淀粉和蔗糖代謝途徑的DEGs在牛大力根的4個(gè)生長(zhǎng)階段有不同的表達(dá)譜,結(jié)合FPKM平均值(掃描圖9二維碼,即可查看)進(jìn)行表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)上述DEGs在調(diào)控淀粉、蔗糖和纖維素的代謝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。表明不同年份牛大力的形態(tài)發(fā)育和物質(zhì)積累與多糖和淀粉的合成和積累密切相關(guān)。

    與蔗糖和海藻糖代謝相關(guān)的DEGs有4個(gè),其中有3個(gè)為編碼蔗糖合酶(sucrose"synthase,"SUS)的相關(guān)基因,1個(gè)注釋為類蔗糖合酶(EC:2.4.1.13,Ms8g_050410),2個(gè)注釋為蔗糖合酶2(EC:2.4.1.13,Ms8g_045820、Ms8g_045830);另有1個(gè)為調(diào)控海藻糖磷酸合酶(trehalose"phosphate"synthase,"TPS)的基因,注釋為α,α-海藻糖磷酸合酶(EC:2.4.1.15,EC:3.1.3.12,Ms2g_044990)。SUS和TPS的表達(dá)量隨年份增長(zhǎng)而下降,結(jié)果說(shuō)明蔗糖的合成隨年份增加而下降,與蔗糖含量的變化趨勢(shì)整體一致。

    與淀粉代謝相關(guān)的DEGs有11個(gè),主要涉及淀粉合成、淀粉降解相關(guān)基因。淀粉合成涉及直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成,相關(guān)DEGs包括:3個(gè)編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose"pyrophsphorylase,"AGPase)的基因,注釋為葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶大亞基"1(EC:2.7.7.27,Ms3g_020500、Ms6g_001720)和葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶小亞基1(EC:2.7.7.27,Ms2g_"025280);2個(gè)編碼顆粒結(jié)合淀粉合酶(granule-"bound"starch"synthase,"GBSS)相關(guān)的基因(EC:2.4.1.242,Ms3g_079780、Ms3g_073120);1個(gè)編碼可溶性的淀粉合成酶(Soluble"starch"ynthase,"SSS)的基因(EC:2.4.1.21,Ms6g_016280);2個(gè)編碼淀粉分支酶(starch"branching"enzyme,"SBE)基因,注釋為α-1,4葡聚糖分支酶(EC:2.4.1.18,Ms6g_002530、Ms1g_035490)。該類基因中以AGPase、GBSS和SBE相對(duì)高表達(dá),多數(shù)在NG7中的表達(dá)量最高,與NG3比,多為上調(diào)表達(dá)。

    與淀粉降解相關(guān)DEGs包括:1個(gè)編碼α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan"phosphorylase,"α-GP)相關(guān)的基因(EC:2.4.1.1,Ms7g_026770);1個(gè)編碼支鏈淀粉酶(starch"debranching"enzyme,"DBE)相關(guān)的基因,注釋為普魯蘭酶1(EC:3.2.1.68,Ms3g_073160);1個(gè)編碼β-淀粉酶(β-amylase,"BAM)相關(guān)的基因,注釋為β-淀粉酶"3(EC:3.2.1.2,Ms5g_038700)。該類基因中α-GP和DBE在NG7的表達(dá)量達(dá)到最高,與NG3比,均為上調(diào)表達(dá);而B(niǎo)AM在NG3中表達(dá)量最高,隨年份增長(zhǎng)整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。淀粉代謝相關(guān)DEGs分析發(fā)現(xiàn),淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于淀粉降解相關(guān)基因,結(jié)合高年份材料淀粉含量顯著高于低年份的情況,說(shuō)明牛大力根在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,淀粉的合成占主導(dǎo)地位。

    與纖維素降解相關(guān)的DEGs有14個(gè),在各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),表達(dá)量隨年份增加整體呈降低的趨勢(shì),多數(shù)在NG3中高表達(dá),在NG10和NG15中低表達(dá)。其中,有5個(gè)編碼β-葡糖苷酶(β-glucosidase,"BG)相關(guān)的基因,注釋為β-葡萄糖苷酶47(EC:3.2.1.21,Ms8g_039920)和一系列的類β-葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.21,Ms7g_004420、Ms5g_053900、Ms8g_024030、Ms8g_024960);有9個(gè)為編碼內(nèi)切葡聚糖酶(endo-glucanase,"EG)相關(guān)的基因,注釋為類內(nèi)切葡聚糖酶10"EC:3.2.1.4,Ms6g_003490),以及一系列的類葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.21,Ms8g_024030、Ms6g_001900、Ms3g_027870)和葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.21,Ms2g_017160、Ms2g_027520、Ms7g_000800、Ms8g_042240、Ms3g_035050)。

    2.5""熒光定量PCR驗(yàn)證

    基于牛大力淀粉和蔗糖代謝途徑差異表達(dá)基因分析結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[12,"18-20],篩選5個(gè)與淀粉和蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因(Ms6g_002530、Ms1g_035490、Ms3g_079780、Ms6g_001720、Ms8g_050410)進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,分析驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,上述驗(yàn)證基因在牛大力不同年份的表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致(圖10),淀粉合成酶基因表達(dá)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在生長(zhǎng)至7年后表達(dá)顯著增加(Plt;0.05);蔗糖合酶基因表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在生長(zhǎng)至高年份(15年)表達(dá)顯著降低(Plt;0.05)。

    3""討論

    本研究基于資源圃保育的3~15年的牛大力種質(zhì)資源,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3年生、7年生、10年生和15年生的牛大力根進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并參考牛大力基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因的注釋和差異基因的挖掘,重點(diǎn)對(duì)淀粉和蔗糖代謝通路相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,闡明牛大力發(fā)育過(guò)程中外在形態(tài)塊根與內(nèi)在物質(zhì)淀粉和多糖積累之間的密切關(guān)系及其潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨著牛大力生長(zhǎng)年份的增加,根中差異表達(dá)基因的數(shù)量呈增加趨勢(shì),功能定位于細(xì)胞壁發(fā)育、糖代謝和其他次生代謝物的合成,有多個(gè)進(jìn)程與碳水化合物代謝相關(guān)。結(jié)合種植中對(duì)牛大力的觀察,其根在多年生長(zhǎng)中會(huì)經(jīng)歷快速膨大直至穩(wěn)定增粗的過(guò)程,并且年份越高的根越粉越細(xì)膩。推測(cè)存在2方面的原因,一是地上部分光合產(chǎn)物碳水化合物運(yùn)送到根部轉(zhuǎn)化為淀粉積累起來(lái),二是存在部分纖維素降解后向淀粉轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。差異表達(dá)基因的通路分析結(jié)果證實(shí),淀粉和糖代謝途徑中的多種酶的表達(dá)有顯著差異,涉及淀粉合成、蔗糖代謝、纖維素代謝和可溶性糖-多糖的相互轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵酶基因。

    淀粉和蔗糖是牛大力塊根中最主要的多糖和可溶性糖[21]。隨著牛大力比較組中生長(zhǎng)年份跨度增加,鑒定的淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)差異表達(dá)基因數(shù)量更多。SUS在低年份,即3年生牛大力的中表達(dá)量最高,并表現(xiàn)為合成蔗糖,參與細(xì)胞壁構(gòu)建和呼吸消耗等生物過(guò)程。隨著生長(zhǎng)年份增加,SUS發(fā)揮催化蔗糖分解作用,參與淀粉和纖維素等合成,促進(jìn)根的膨大和淀粉的積累。結(jié)合蔗糖含量的變化,發(fā)現(xiàn)隨著年份增加牛大力根中可溶性糖合成顯著減少,前期積累的蔗糖也被分解,進(jìn)入為多糖?細(xì)胞壁與淀粉合成提供前體與底物途徑[22]。而淀粉代謝基因在高年份牛大力根中的表達(dá)相對(duì)更活躍,其中淀粉合成相關(guān)的酶基因AGPase、GBSS和SBE,在7年時(shí)的表達(dá)量顯著增加,而在10年和15年時(shí)表達(dá)下降且表達(dá)量的差異縮小,表明牛大力生長(zhǎng)期間均有淀粉的合成。其中AGPase作為淀粉生物合成途徑中主要調(diào)控位點(diǎn)對(duì)淀粉積累和組成具有決定性作用[12,"19],其在NG7中的表達(dá)明顯增高,說(shuō)明7年時(shí)淀粉合成已經(jīng)進(jìn)入高速合成時(shí)期,此后隨年份增加逐漸平緩。淀粉降解相關(guān)的基因α-GP亦有同樣的趨勢(shì),結(jié)合另一個(gè)主要的淀粉降解酶基因BAM3始終處于低表達(dá)狀態(tài),說(shuō)明淀粉的合成和降解是同步進(jìn)行的,并以合成占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。類β-葡萄糖苷酶EC和內(nèi)切葡聚糖酶EG將纖維素降解為二糖,再經(jīng)β-葡糖苷酶BG水解為葡萄糖。上述纖維素酶相關(guān)達(dá),此后逐漸降低最后趨于平穩(wěn),說(shuō)明在牛大力淀粉和蔗糖代謝途徑中,在3~7年時(shí)可能是通過(guò)β-葡萄糖苷酶促進(jìn)纖維素降解,從而影響葡萄糖的合成,為根部的膨大提供能量和碳骨架[10,"23]基因BG和EG,均在牛大力生長(zhǎng)至3~7年時(shí)高表達(dá)。而在生長(zhǎng)至10~15年時(shí),其表達(dá)量顯著降低,可能更有利于淀粉的儲(chǔ)藏。

    淀粉和纖維素是碳水化合物重要的形式,可用于能量存儲(chǔ)和提供碳骨架支撐,也能被α-葡聚糖磷酸化酶、β-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和內(nèi)切葡聚糖酶等一系列酶降解并釋放能量,在特定的時(shí)期用于植物生長(zhǎng)發(fā)育[23-25]。因此,牛大力中淀粉和纖維素降解DEGs,在低年份表達(dá)相對(duì)活躍,而隨著年份增加表達(dá)量顯著下降,可能是在相關(guān)基因的調(diào)控下減少對(duì)淀粉的水解。因此,牛大力塊根生長(zhǎng)至3年左右,其蔗糖含量處于較高水平,根膨大后其所含的可溶性糖(蔗糖)含量逐漸降低,而多糖(淀粉)和纖維素含量升高,糖類物質(zhì)在不同的發(fā)育時(shí)期相互轉(zhuǎn)化,以不同的形式存在,影響著其塊根的生長(zhǎng)發(fā)育,與前期研究結(jié)果基本一致[1-4,"15]。

    綜上所述,為了在牛大力不同的生長(zhǎng)階段維持糖類物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡,參與蔗糖、淀粉和纖維素代謝的DEGs在各階段差異表達(dá),通過(guò)調(diào)控蔗糖分解、葡萄糖合成、淀粉的合成與分解等復(fù)雜的糖代謝,牛大力在3~7年時(shí)處于生長(zhǎng)活躍期,以糖原生物合成為主為促進(jìn)根部快速膨大發(fā)育發(fā)揮作用,包括蔗糖的合成,纖維素的合成。生長(zhǎng)至7年時(shí),以淀粉的合成、蔗糖的分解,纖維素的降解為特征極為活躍,隨后則進(jìn)入生長(zhǎng)的平穩(wěn)期。本研究結(jié)合相關(guān)研究[2,"5,"15,"18,"26-28],綜合產(chǎn)量、種植投入、經(jīng)濟(jì)效益、物質(zhì)合成、品質(zhì)形成等因素,進(jìn)一步證明牛大力生長(zhǎng)至5~7年采收更為科學(xué)。

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