紫花苜蓿葉枯病病原菌鑒定、生物學(xué)特性及防治藥劑篩選

收稿日期：2024-02-22；修回日期：2024-04-07

基金項目：耐寒高產(chǎn)苜蓿育種技術(shù)創(chuàng)新及新種源創(chuàng)制（2022ZD040120401）資助

作者簡介：

肖鈺瑩（2001-），女，漢族，黑龍江鶴崗人，碩士研究生，主要從事牧草抗病育種研究，E-mail：18846803061@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：cgw603@163.com

摘要：為明確紫花苜蓿（Medicago sativa L.） 葉枯病病原菌種類及生物學(xué)特性，篩選出有效防治藥劑，本試驗于2023年8月在黑龍江省肇東市和大慶市分別采集紫花苜蓿葉枯病病樣，采用組織分離法分離并純化病原菌，依據(jù)柯赫氏法則驗證致病性，通過菌絲生長速率法進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選。形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)分析結(jié)果表明，引起紫花苜蓿葉枯病的病原菌為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，菌絲生長最適溫度25℃、最適pH值為10，全光照條件有利于菌絲生長，菌絲在馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato saccharose agar，PSA）培養(yǎng)基上生長速度最快，在水瓊脂（Water agar，WA）培養(yǎng)基上生長速度最慢。碳源和氮源選擇上，菌絲分別在麥芽糖和磷酸二氫銨上生長速度最快，在蔗糖和硝酸鉀上生長速度最慢。室內(nèi)藥劑毒力測定表明，30%吡唑醚菌酯抑菌作用最強(qiáng)，半數(shù)效應(yīng)濃度（Median effect concentration，EC50）為0.2819 μg·mL^-1。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；黑附球菌；病原菌鑒定；生物學(xué)特性；藥劑毒力測定

中圖分類號：S435.4""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）11-3391-09

Identification，Biological Characteristics and Screening of Control Agents of

the Medicago sativa Leaf Blight

XIAO Yu-ying， TULUHONG Mu-zhapaer， XU Wen， WANG Bai-ji，

LIU Qian-ning， ZHANG Qing-wen， CUI Guo-wen*

（College of Animal Science and Technology， Northeast Agricultural University， Harbin， Heilongjiang Province 150036， China）

Abstract：To clarify the species and biological characteristics of pathogenic bacteria of Medicago sativa L. leaf blight，and screen out the effective fungicides to control this disease. Leaf samples of alfalfa leaf blight were collected in Zhaodong City and Daqing City，Heilongjiang Province in August，2023. Tissue isolation method was used to isolate and purify pathogenic bacteria，according to Koch’s rule to verify pathogenicity，and the mycelium growth in plate was used to investigate fungicides toxicity on the pathogen. Combined analyses of morphology and molecular biology indicated that the pathogen causing alfalfa leaf blight was Epicoccum nigrum. The results of studied biological characteristics showed that the optimum temperature for mycelial growth was 25℃，which was favorable for mycelial growth under all light conditions and pH value was 10. The mycelium growth rate was the fastest on PSA medium，but the growth rate was the slowest on WA medium. In the choice of carbon source，mycelium grew fastest on maltose and slowest on glycerol. In the choice of nitrogen source，the mycelium grew fastest on tryptone and slowest on urea. The indoor toxicity test showed that 30% pyraclostrobin had the strongest inhibitory effect，and the EC50 value was 0.2819 μg·mL^-1.

Key words：Medicago sativa;Epicoccum nigrum;Pathogen identification;Biological characteristics;Toxicity test

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一種廣泛種植的多年生豆科牧草，具有適口性好、粗蛋白含量高、高產(chǎn)、富含礦物質(zhì)和維生素等特點，因而被譽(yù)為“牧草之王”。然而，隨著種植面積的擴(kuò)大，病害成為制約苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)、限制其廣泛應(yīng)用的主要因素^［1-2］。苜蓿病害種類繁多且危害嚴(yán)重，不僅造成苜蓿減產(chǎn)，嚴(yán)重情況下甚至導(dǎo)致整塊苜蓿地全部毀壞。據(jù)不完全統(tǒng)計，全國大約有90多種苜蓿病害，僅東北地區(qū)苜蓿病害就有30多種，全國各地區(qū)苜蓿病害造成的損失大約在15%～70%^［3］。因此，對紫花苜蓿病害的防治十分重要，而明確引起紫花苜蓿病害的病原菌種類是防治病害的關(guān)鍵。常見的苜蓿葉片病害包括：炭疽?。–olletotrichum trifolii，Colletotrichum destructivum，Colletotrichum truncatum）^［4］，黃萎病（Verticillium alfalfae）^［5］，白粉?。‥rysiphe poiygoni，Leveillula leguminosarum，Erysiphepisi）^［6］，霜霉病（Peronospora aestivalis）^［7］和褐斑?。≒seudopeziza medicaginis）^［8］等。

目前關(guān)于黑附球菌的研究大多集中于生物防治方面^［9］。黑附球菌能對小麥禾旋孢腔菌（Cochliobolus sativus）產(chǎn)生拮抗作用^［10］，也可有效抑制桃褐腐菌（Monilinia laxa），它在實際生產(chǎn)中得到了應(yīng)用^［11］，根據(jù)夏麗琴報道，黑附球菌孢子懸浮液對馬鈴薯晚疫病有較好的保護(hù)作用^［12-13］。近年來，也有報道稱黑附球菌可引起水稻穗的褐變病^［14］、百脈根葉斑病^［15］等病害。王瑜等人調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黑附球菌能引起紫花苜蓿葉片病害，但并未對其進(jìn)行深入研究^［16］。葉枯病是一種常見的真菌病害，主要危害植株葉片，但引起不同植物葉枯病的病原菌大不相同，有關(guān)葉枯病病害及藥劑防治的相關(guān)報道很多。沈?qū)氂畹冗M(jìn)行防治藥劑篩選時發(fā)現(xiàn)，5%己唑·四霉素對遼五味子葉枯病防治效果較好，并進(jìn)行了田間防效試驗^［17］；任曉鳳等發(fā)現(xiàn)95%苯醚甲環(huán)唑?qū)η囡L(fēng)藤葉枯病病原菌抑菌效果最佳^［18］。但關(guān)于紫花苜蓿葉枯病的藥劑防治研究還未曾有報道。

因此，本研究對從紫花苜蓿葉片中分離得到的葉枯病病原菌——黑附球菌（Epicoccum nigrum）進(jìn)行了分離鑒定、生物學(xué)特性和室內(nèi)毒力測定的研究，旨在為未來紫花苜蓿葉枯病的診斷和防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

該試驗病原菌為本實驗室2023年8月從黑龍江省肇東市（125°89′ E，46°04′ N）和大慶市（124°67′ E，46°77′ N）紫花苜蓿葉片發(fā)病部位采用組織分離法分離所得，回接紫花苜蓿品種為‘東農(nóng)1號’和‘肇東’苜蓿。

1.2 病原菌的分離與純化

在實驗室條件下，采用常規(guī)組織分離法^［19］分離病原菌。從紫花苜蓿上收集帶病癥狀的葉片，用蒸餾水沖洗葉片，去除表面的污物和多余病菌，并在無菌環(huán)境下自然晾干。在超凈工作臺上，用手術(shù)刀切取病健交界處的組織塊，將組織塊放入75%乙醇中浸泡消毒30 s，進(jìn)行表面初步消毒，將消毒后的組織塊放入0.1%的升汞溶液中消毒2 min，用無菌水漂洗3次，去除組織塊中的殘留消毒液，然后在無菌環(huán)境下將其放置在已滅菌的濾紙上，待樣品表面水分自然晾干。最后將其放在pH值為7.0的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基中25℃避光培養(yǎng)3～5 d。待組織塊長出菌落后，采用單胞分離法^［20］進(jìn)行純化培養(yǎng)，并將純化后的分離物接種于PDA斜面上培養(yǎng)好后，4℃存放備用。

1.3 病原菌的致病性測定

將病原菌在PDA培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)7 d后，使用直徑5 mm的無菌打孔器采集菌餅，將紫花苜蓿健康葉片接種部位先用75%無水乙醇進(jìn)行表面消毒，再用接種針刺傷，將菌餅的菌絲面放置在傷口處^［21］；根據(jù)資料所描述的方法配制孢子懸浮液備用^［22］，將孢子懸浮液噴灑在健康的紫花苜蓿植株上，對照組噴灑等量無菌水，25℃保濕培養(yǎng)14 d，期間觀察并記錄紫花苜蓿葉片發(fā)病情況。

針對接種后呈現(xiàn)顯著病狀的葉片進(jìn)行致病菌分離，觀察并記錄重新分離的菌株與初始菌株之間的差異，從而完成柯赫氏法則的驗證。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上，7 d后觀察其菌落生長情況，包括大小和顏色，記錄菌落外觀特征。使用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、分生孢子的大小、形態(tài)特征和著生方式，參照文獻(xiàn)^［23-24］并根據(jù)觀察到的各特征，確定病原菌的種類。

1.5 病原菌的分子鑒定

從上述培養(yǎng)7 d后的病原菌的菌落中刮取約150 mg菌絲，采用NuClean Plant Genomic DNA Kit試劑盒說明書提取病原菌DNA，將其作為PCR模板，分別用ITS，TUB2和RPB2三種引物（引物見表1）對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖檢測后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果通過Blast在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，最后使用MEGA-X軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 病原菌的生物學(xué)特性研究

1.6.1 不同溫度、光照及pH值對菌絲生長的影響 將病原菌在25℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，使用直徑5 mm的無菌打孔器從菌落邊緣采集菌餅，接種在以下不同條件的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)：設(shè)置8個溫度梯度，分別為5，10，15，20，25，30，35和40℃；光照條件設(shè)置3種處理，包括全天光照（L）、全天黑暗（D）和半天光照、半天黑暗（12L/12D）；使用pH計、配置好的1%NaOH和1%HCl母液，將PDA培養(yǎng)基pH值分別調(diào)至4，5，6，7，8，9，10，11共8個梯度。各處理條件設(shè)置3個重復(fù)，并進(jìn)行25℃恒溫暗培養(yǎng)7 d后使用十字交叉法對菌落直徑進(jìn)行測量。

1.6.2 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 供試培養(yǎng)基為水瓊脂培養(yǎng)基（Water agar，WA），PDA，馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato saccharose agar，PSA），查比克培養(yǎng)基（Czapek dox agar，CDA），燕麥培養(yǎng)基（Oat meal agar，OMA），玉米粉培養(yǎng)基（Corn meal agar，CMA）^［25］。使用直徑5 mm的無菌打孔器從病原菌菌落邊緣取數(shù)個菌餅，并將菌餅分別轉(zhuǎn)接到不同培養(yǎng)基平板中央，對每種培養(yǎng)基設(shè)置3個重復(fù)，25℃條件下暗培養(yǎng)7 d。按照上文描述的方法測定菌落直徑。

1.6.3 不同碳源對菌絲生長的影響 CDA培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基^［26］，以同等質(zhì)量的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、丙三醇、和D-甘露醇替換蔗糖，配得不同碳源的培養(yǎng)基，不加蔗糖培養(yǎng)基作為缺碳對照。按照上文描述的方法測定菌落直徑。

1.6.4 不同氮源對菌絲生長的影響 CDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用同等質(zhì)量的硫酸胺、胰蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氫銨、酵母浸膏、尿素代替其中的硝酸鉀，配成氮源不同的培養(yǎng)基，以不加硝酸鉀培養(yǎng)基作為缺氮對照。按照上文描述的方法測定菌落直徑。

1.7 病原菌室內(nèi)藥劑毒力測定

采用菌絲生長速率法^［27-28］將6種藥劑依據(jù)表2濃度進(jìn)行稀釋，每種藥劑分別稀釋成5個不同濃度梯度。將各濃度藥劑混合到已滅菌的未凝固PDA培養(yǎng)基中，調(diào)制成藥劑比1∶9的帶藥培養(yǎng)基，倒入平板，待其冷卻后用5 mm打孔器在長滿病原菌的培養(yǎng)皿上打取數(shù)個菌餅，每個帶藥培養(yǎng)皿中央放置1塊菌餅，重復(fù)5次，以不含藥劑的平板作為對照。放置在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑大小，計算藥劑對病菌的抑制情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。對試驗數(shù)據(jù)通過鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離和致病性檢測

在紫花苜蓿田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病初期葉面出現(xiàn)形狀不規(guī)則的褐色病斑，病斑邊緣葉面枯黃，逐漸擴(kuò)大，死亡組織呈淺褐色中部略帶黑色，葉面干枯皺縮（圖1A-C）。通過常規(guī)組織分離法對收集到的80份發(fā)病紫花苜蓿葉片病樣進(jìn)行病原菌分離并純化，得到16個菌株，純化培養(yǎng)后的分離物編號為MYH1-MYH16，將代表菌株MYH1接種于活體紫花苜蓿葉片7 d后，觀察到葉片接種部位發(fā)黑腐爛周圍黃褐色，病組織呈水漬狀崩解腐爛，發(fā)病癥狀顯著（圖1D-E）；將代表菌株MYH1孢子懸浮液噴施于健康植株14 d后葉片出現(xiàn)黑色斑點并發(fā)黃枯萎，發(fā)病癥狀顯著（圖1F-I）。但室內(nèi)接種病原菌的紫花苜蓿離體葉片和植株，發(fā)病后產(chǎn)生的病害癥狀均與田間發(fā)病癥狀有所不同，這可能是實驗環(huán)境與田間環(huán)境之間存在差別造成的。對發(fā)病病樣進(jìn)行病原菌再分離，獲得的菌落形態(tài)與MYH1一致，經(jīng)過柯赫氏法則驗證可以確定菌株MYH1為紫花苜蓿葉枯病的病原菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株MYH1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后即可長滿全皿，培養(yǎng)初期菌絲呈白色絮狀，中后期由紅橙色變?yōu)樯铧S褐色。培養(yǎng)后期出現(xiàn)氣生菌絲，菌落表面出現(xiàn)紅黑色液滴，背面為紅橙色（圖2A）。分生孢子黃褐色，扁圓形或近球形，表面有褶皺，大小為（10.10～15.82） μm×（11.58～15.66） μm（n=50）（圖2B-C）。

2.3 病原菌的分子鑒定

將具有代表性的4個菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（MYH1-MYH4），將擴(kuò)增的4個菌株的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、β-微管蛋白（TUB2）和RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基（RPB2）基因序列上傳至GenBank中。在與GenBank中的序列進(jìn)行BLAST比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中ITS基因序列與黑附球菌（登錄號：LC543647）同源性達(dá)到100%（登錄號：PP320244，PP320371，PP320374，PP320377），TUB2基因序列與黑附球菌（登錄號：MZ078817）同源性達(dá)到99%（登錄號：PP333176，PP333177，PP333178，PP333179），RPB2基因序列與黑附球菌（登錄號：OQ410140）同源性達(dá)到100%（登錄號：PP333172，PP333173，PP333174，PP333175）且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起。因此，結(jié)合形態(tài)特征將這4個菌株鑒定為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。

2.4 生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對病原菌菌落直徑的影響 在不同溫度條件下，MYH1菌株均能生長，其中25℃為菌絲生長最適溫度，培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑達(dá)65.75 mm，顯著高于其他溫度條件下菌落直徑（P＜0.05）。當(dāng)溫度為40℃時，菌絲生長受到顯著抑制，菌落直徑僅為9.33 mm，而在低溫條件下菌絲仍能較好生長（圖4A）。

2.4.2 光照對病原菌菌落直徑的影響 不同光照條件下菌株MYH1均能生長，全光照條件下菌絲生長速率最快，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為69.33 mm，顯著高于其他光照條件下菌落直徑（P＜0.05）。全黑暗條件下菌絲生長速率最慢，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為52.55 mm（圖4B）。

2.4.3 pH值對病原菌菌落直徑的影響 菌株MYH1在pH值為4～11范圍內(nèi)均能生長，pH值由4到6時，菌落直徑逐漸變小，在pH值為6時菌落直徑最小，培養(yǎng)7 d后菌落直徑達(dá)57.17 mm，pH值由6到10時，菌落直徑逐漸變大，從10到11時逐漸變小，在pH值為10時菌落直徑最大，達(dá)73.42 mm。總體來看該病原菌在酸、堿環(huán)境下均能正常生長（圖4C）。

2.4.4 培養(yǎng)基對病原菌菌落直徑的影響 菌株MYH1在6種供試培養(yǎng)基上均能生長。菌絲在PSA培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為66.30 mm，其次是OMA培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為63.08 mm，兩者之間差異不顯著，但顯著高于其他培養(yǎng)基條件下的菌落直徑（P＜0.05）。菌絲在WA培養(yǎng)基上菌落直徑最小，培養(yǎng)7天后菌落直徑為35.75 mm（圖5）。

2.4.5 碳源對病原菌菌落直徑的影響 不同碳源條件下菌株MYH1均能生長，菌絲生長最適的碳源為麥芽糖，培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑為70.50 mm，與葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基菌落直徑之間差異不顯著。菌絲在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑最小，顯著低于對照組和其他5種碳源培養(yǎng)基條件下的菌落直徑（P＜0.05），培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑為37.25 mm（圖6）。

2.4.6 氮源對病原菌菌落直徑的影響 不同氮源條件下菌株MYH1均能生長，當(dāng)培養(yǎng)基以磷酸二氫銨為氮源時，菌絲生長最快，培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑為72.08 mm，其次是酵母提取物和尿素，菌落平均直徑為69.17 mm和66.08 mm，三者之間差異不顯著，但與其他條件下菌落直徑之間差異顯著（P＜0.05）。以硝酸鉀為氮源時，菌絲生長最慢，培養(yǎng)7 d后菌落平均直徑為37.25 mm，其次是硫酸銨，菌落平均直徑為40.36 mm（圖7）。

2.5 殺菌劑對黑附球菌菌絲生長的影響

由表3可知，6種殺菌劑對引起黑龍江省紫花苜蓿葉枯病的黑附球菌的菌絲生長均表現(xiàn)出抑制作用，但不同藥劑間的抑制作用有所區(qū)別。其中30%吡唑醚菌酯抑制作用最強(qiáng)，半數(shù)效應(yīng)濃度（Median effect concentration，EC50）值為0.2819 μg·mL^-1；30%唑醚·戊唑醇、30%噁霉靈、32.5%苯甲·嘧菌酯、45%咪鮮胺次之，EC50值分別為0.3246 μg·mL^-1，0.7829 μg·mL^-1，1.1480 μg·mL^-1，1.620 μg·mL^-1；最后是1.5%苦參·蛇床素，EC50值為2.0760 μg·mL^-1，抑制作用最弱。

3 討論

紫花苜蓿葉枯病導(dǎo)致其葉片產(chǎn)生病變甚至枯萎，本研究利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析，結(jié)合柯赫氏法則驗證，鑒定出引起紫花苜蓿葉枯病的病原菌為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。黑附球菌代謝產(chǎn)物有抗菌和抗生物膜活性作用^［29］，但也可引起茶樹（Camellia sinensis L.）褐斑病^［30］、豇豆（Vigna unguiculata L.）葉斑病^［31］、菊苣（Cichorium endivia L.）葉斑病^［32］、巴西櫻桃（Eugenia involucrata）葉斑病^［33］等病害。目前由該病原菌引起的病害研究相對較少，前人的研究主要集中在病原菌鑒定、形態(tài)學(xué)觀察、致病性驗證等方面，對其生物學(xué)特性、防治藥劑篩選等方面涉及較少^［34-35］。因此，本研究對其進(jìn)行生物學(xué)特性分析及室內(nèi)防治藥劑篩選，為紫花苜蓿葉枯病的后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持及參考。

在研究過程中發(fā)現(xiàn)，將病原菌回接到健康植株及葉片后，其發(fā)病癥狀與田間采集的紫花苜蓿葉枯病葉片癥狀略有差別，但從接種后發(fā)病植株上重新分離得到的病原菌與田間分離得到的致病菌為同一種真菌。發(fā)病癥狀存在差異的原因可能與接種環(huán)境、培養(yǎng)溫度、土壤和病原菌侵染天數(shù)不同有關(guān)^［36］。從不同寄主中分離得到的病原菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后菌落形態(tài)有所差別，本研究中黑附球菌培養(yǎng)后期菌落中央呈黃褐色，菌落表面出現(xiàn)紅黑色液滴，與引起水稻穗褐變病^［14］、枇杷褐斑病^［37］的黑附球菌菌落形態(tài)相似，而從火龍果莖中分離得到的黑附球菌培養(yǎng)后期菌落中央呈淺黃白色^［38］，這可能與黑附球菌是一個形態(tài)可變的群體有關(guān)^［39-40］。

病原菌生物學(xué)特性的研究對病原菌的防治及了解其致病機(jī)制具有重要意義，病原菌生長與繁殖受多種環(huán)境因素影響，其中較為重要的有光照、溫度、pH值和氮源、碳源等因素。本研究中從黑龍江省紫花苜蓿中分離得到的黑附球菌在全光照下菌絲生長最快，與從黑龍江省藍(lán)靛果中分離得到的黑附球菌結(jié)果一致^［41］，而從甘肅省云杉中分離得到的黑附球菌菌絲在光照與黑暗交替條件下生長最快^［42］，這可能與病菌采集地環(huán)境差異較大有關(guān)；不同寄主來源的黑附球菌菌絲生長最適溫度無顯著差異，本研究中紫花苜蓿黑附球菌菌絲生長最適溫度為25℃，這與藍(lán)靛果黑附球菌、云杉黑附球菌菌絲生長最適溫度一致^［41-42］。不同寄主來源的病原菌其酸堿適應(yīng)范圍不同，閆浩浩在研究藍(lán)靛果黑附球菌生物學(xué)特性時發(fā)現(xiàn)，菌絲生長最適pH值為6^［41］，而本研究中紫花苜蓿黑附球菌菌絲生長最適pH值為10，這表明黑附球菌能適應(yīng)的酸堿度范圍比較寬泛，在酸、堿條件下均能生長良好；黑附球菌能適應(yīng)多種不同的碳源和氮源，本研究中黑附球菌生長的最適碳源、氮源分別為麥芽糖、磷酸二氫銨，而李柘柘、閆浩浩等認(rèn)為，黑附球菌生長的最適碳源為淀粉，最適氮源為蛋白胨和酵母粉^［41-42］。這可能與病原菌來源不同以及研究人員所選擇的碳源、氮源不同有關(guān)。

目前對黑附球菌防治殺菌劑篩選的研究未見報道。通過本研究室內(nèi)藥劑毒力測定表明，30%吡唑醚菌酯對引起紫花苜蓿葉枯病的黑附球菌抑菌效果最強(qiáng)，該結(jié)果與陳仕江、安可良等人在四川大蒜葉枯病和蘋果葉枯病防治藥劑篩選結(jié)果一致^［43-44］，我們建議可將吡唑醚菌酯作為防治葉枯病的首選藥劑。為了防止長期使用單一藥劑導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗性，本研究中30%唑醚·戊唑醇、30%噁霉靈可以作為防治紫花苜蓿葉枯病備選藥劑交替使用，對該病害的田間化學(xué)防治效果仍需要進(jìn)一步驗證。

本研究對紫花苜蓿葉枯病病原進(jìn)行了分離和鑒定、分析其生物學(xué)特性，測定了常見藥劑的防治效果，為紫花苜蓿葉枯病的診斷和防治提供了技術(shù)參考，其流行規(guī)律、致病機(jī)制及綜合防治方法等還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)分析得出，在紫花苜蓿上引起葉枯病癥狀的病原菌為黑附球菌（Epicoccum nigrum）。該病原菌菌絲生長最適溫度25℃、最適pH值為10，全光照條件下有利于菌絲的生長，在PSA培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快，而在WA培養(yǎng)基上生長速度最慢。麥芽糖為碳源時，菌絲生長速度最快，蔗糖為碳源時菌落平均直徑最??；磷酸二氫銨為氮源時，菌落平均直徑最大，硝酸鉀為氮源時菌落平均直徑最小。室內(nèi)藥劑毒力試驗結(jié)果表明，30%吡唑醚菌酯的防治效果最顯著，而30% 唑醚·戊唑醇可作為替代殺菌劑進(jìn)行輪換應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

［1］ 段代祥，趙麗萍，趙鳳娟，等. 苜蓿青貯在牛羊飼料中的應(yīng)用［J］. 飼料研究，2023，46（20）：169-172

［2］ 張春梅，王成章，胡喜峰，等. 紫花苜蓿的營養(yǎng)價值及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 中國飼料，2005（1）：15-17

［3］ 袁慶華. 我國苜蓿病害研究進(jìn)展［J］. 植物保護(hù)，2007，33（1）：6-10

［4］ 陳婧，郭子雯，潘春清，等. 苜蓿病蟲草害研究現(xiàn)狀［J］. 草學(xué)，2022（1）：1-14

［5］ XU S，LI Y Z，NAN Z B. First report of Verticillium wilt of alfalfa caused by Verticillium alfalfae in China［J］. Plant Disease，2016，100（1）：220

［6］ 袁玉濤，史娟，馬新，等. 紫花苜蓿白粉病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性［J］. 微生物學(xué)通報，2020，47（11）：3539-3550

［7］ 楊慶森，湯春梅，蔡繼增. 苜蓿霜霉病病原及其生物學(xué)特性研究［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：207-208

［8］ 李楊，史娟，崔娜娜，等. 苜蓿褐斑病對紫花苜蓿光合作用及草品質(zhì)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2017，26（10）：149-157

［9］ 韓帥，張河慶，吳婕，等. 四川省山藥黑斑病病原菌的鑒定［J］. 植物保護(hù)，2019，45（2）：68-74

［10］李揚(yáng)，王亞南，胡同樂，等. 黑附球菌在植物病害生物防治中的研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（6）：2988-2990

［11］LARENA I，DE CAL A，MELGAREJO P. Solid substrate production of Epicoccum nigrum conidia for biological control of brown rot on stone fruits［J］. International Journal of Food Microbiology，2004，94（2）：161-167

［12］夏麗琴，王亞南，蘇艷超，等. 黑附球菌XF1菌株分生孢子產(chǎn)生和保存條件研究［J］. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（4）：75-79

［13］李揚(yáng). 黑附球菌XF1菌株對馬鈴薯晚疫病的生防作用［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：21-22

［14］臺蓮梅，姜小玉，靳學(xué)慧，等. 黑龍江省水稻穗褐變病病原菌的分離與鑒定［J］. 微生物學(xué)通報，2020，47（6）：1776-1786

［15］COLAVOLPE B，EZQUIAGA J，MAIALE S，et al. First report of Epicoccum nigrum causing disease in Lotus corniculatus in Argentina［J］. New Disease Reports，2018，38（1）：6

［16］王瑜，袁慶華，苗麗宏，等. 東北與華北地區(qū)紫花苜蓿病害調(diào)查與主要病害流行規(guī)律研究［J］. 草業(yè)學(xué)報，2016，25（3）：52-59

［17］沈?qū)氂睿钚?，李維根，等. 遼五味子葉枯病防治藥劑篩選［J］. 農(nóng)藥，2023，62（10）：763-765，770

［18］任曉鳳，劉苗，周倩，等. 青風(fēng)藤葉枯病病原菌的分離鑒定及防治藥劑的篩選［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2023，49（1）：74-78

［19］方中達(dá). 植病研究方法［M］. 第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：122-154

［20］邱小燕，湯智鵬，張敏，等. 一種適用于多數(shù)植物病原真菌的單孢分離方法［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：5263-5264

［21］薛婧，侯學(xué)萍，姜曉東，等. 藜麥炭疽病病原菌鑒定、生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑毒力測定［J/OL］. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.001638，2024-01-30/2024-05-12

［22］WANG L，LIN K，LIU H，et al. First report of leaf spot disease caused by on smooth bromegrass （Bromus inermis） in China［J］. Plant Disease，2023，107（8）：2279-2571

［23］JIN M J，YANG C D，WANG Y D，et al. Isolation and identification of Epicoccum nigrum as the causal agent of brown spot disease in Solanum tuberosum in China［J］. Plant Pathology，2023，72（4）：829-838

［24］張?zhí)鞂? 中國真菌志［M］. 北京：科學(xué)出版社，2009：64-66

［25］CAI Y B，DOU T，GAO F T，et al. Identification and biological characteristics of a pathogen causing leaf blight of Rehmannia glutinosa［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，2022，47（7）：1824-1830

［26］梁嘉俊，李芳紅，高鴻鵬，等. 楊凌區(qū)紫花苜蓿葉枯病病原分離鑒定及其生物學(xué)特性［J］. 草地學(xué)報，2018，26（5）：1208-1214

［27］孫雪艷，蔣晶晶，杜蕙，等. 甘肅隴西黃芩灰霉病病原菌分離鑒定及田間藥劑防治［J］. 草地學(xué)報，2023，31（2）：349-357

［28］馬桂花，段曉明，徐文華，等. 蒙古黃芪根腐病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選［J］. 草地學(xué)報，2022，30（5）：1122-1130

［29］QADER M M，HAMED A A，SOLDATOU S，et al. Antimicrobial and antibiofilm activities of the fungal metabolites isolated from the marine endophytes Epicoccum nigrum M13 and Alternaria alternata 13A［J］. Marine Drugs，2021，19（4）：232

［30］YIN Q X，JIANG S L，LI D X，et al. First report of Epicoccum nigrum causing brown leaf spot in tea in Guizhou Province，China［J］. Plant Disease，2022，106（1）：321

［31］DEEPIKA Y S，MAHADEVAKUMAR S，AMRUTHESH K N，et al. First report of Epicoccum nigrum associated with leaf spot disease of cowpea （Vigna unguiculata） from India［J］. Journal of Plant Pathology，2021，103（1）：391-392

［32］KOU Z A，ZHANG Z K，ZHANG W X，et al. First report of Epicoccum nigrum causing leaf spot of endive （Cichorium endivia L.） in China［J］. Crop Protection，2024，177：106534

［33］BERNARDI C，REY M S，JUNIOR A W，et al. First report of Epicoccum nigrum causing leaf spot of Eugenia involucrata in Brazil［J］. Plant Disease，2023，107（1）：230

［34］BERNARDI C， REY M D S，WAGNER A Jr，et al. First report of Epicoccum nigrum causing leaf spots on Campomanesia guazumifolia （Camb.） Berg in Brazil［J］. Plant Disease，2024，108（1）：214

［35］MAHADEVAKUMAR S，JAYARAMAIAH K M，JANARDH-ANA G R. First report of leaf spot disease caused by Epicoccum nigrum on Lablab purpureus in India［J］. Plant Disease，2014，98（2）：284

［36］譚萬忠. 論作物病害田間診斷與實驗室檢驗原理和技術(shù)［C］//重慶市植物保護(hù)學(xué)會. 慶祝重慶市植物保護(hù)學(xué)會成立10周年暨植?？萍颊搲撐募?重慶：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2007：41-48

［37］WU D，ZHANG D H，TIMKO M P，et al. First report of Epicoccum nigrum causing brown leaf spot of loquat in Southwestern China［J］. Plant Disease，2017，101（8）：1553

［38］王俊麗，任建國，劉紅美. 一種引起火龍果莖病害的病原菌鑒定［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（10）：307-311

［39］KILPATRICK J A，CHILVERS G A. Variation in a natural population of Epicoccum purpurascens［J］. Transactions of the British Mycological Society，1981，77（3）：497-508

［40］ARENAL F，PLATAS G，MARTN J，et al. Evaluation of different PCR-based DNA fingerprinting techniques for assessing the genetic variability of isolates of the fungus Epicoccum nigrum［J］. Journal of Applied Microbiology，1999，87（6）：898-906

［41］閆浩浩. 黑龍江省藍(lán)靛果葉斑病病原黑附球菌Epicoccum nigrum分離鑒定及生物學(xué)特性［J/OL］. https：//doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000903，2023-12-02/2024-05-12

［42］李柘柘，崔凌霄，魏立娟，等. 云杉葉枯病新病原的鑒定及其生物學(xué)特性測定［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2023，32（5）：791-798

［43］陳仕江. 四川大蒜葉枯病病原、流行動態(tài)及防治藥劑研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013：27-30

［44］安可良. 日照市蘋果炭疽菌葉枯病發(fā)生情況及防治［J］. 農(nóng)技服務(wù)，2014，31（6）：164-165

（責(zé)任編輯 閔芝智）