氫自由基水對慢性應激誘導的抑郁樣行為的改善作用研究

Study on improvement effect of hydrogen free radical water on depression?like behavior induced by chronic unpredictable mild stress

LI Xiaole1， HAN Shifan2，3，4，5，6，7*， CHENG Junxiang2，8， ZHU Ruifang2， PAN Mengyi8， YOU Kaiqi8， WU Jing1， ZHANG Hong1， ZHANG Xiaohui1， ZHANG Qian1， ZHAO Yu1，8， SONG Jie1，8， FENG Yaoqing9， DONG Wenjing8， LIU Qia8

1.Shanxi Bethune Hospital， Shanxi Academy of Medical Sciences， Tongji Shanxi Hospital， Third Hospital of Shanxi Medical University， Shanxi 030032 China；2.First Hospital of Shanxi Medical University；3.Shanxi Quanneng Family Nurse Pharmaceutical Technology Co.， Ltd；4.Shanxi Medical Periodical Press Co.， Ltd；5.Shanxi Province Dietary Therapy and Agricultural Product Prescription Industry Technology Innovation Strategic Alliance；6.Shanxi Province's Major Platform Carrier and Training Base for the Integration of Health Education and Industry；7.Shanxi Medical University Dietary Therapy Technology Research Center；8.Nursing College of Shanxi Medical University；9.Nursing College of Inner Mongolia Medical University

*Corresponding Author" HAN Shifan， E?mail： shifan.han@sxmu.edu.cn

Abstract" Objective：To observe the safety of hydrogen free radical water and its improvement effect on depression?like behavior in rats.Methods：20 Sprague Dawley（SD） rats of 6 weeks of age in which half was male and half was female were randomly divided into the experimental group and the control group based on body weight.During the experiment，high concentration hydrogen" free" radical" water and equal amount of distilled water were given gavage，respectively.After gavage，the general conditions and body weight changes of the rats in each group were observed and recorded，and related pathological examinations were carried out.32 male SD rats of 4 weeks of age were randomly divided into the normal control group，model group，low concentration group，high concentration group based on body weight.Chronic unpredictable mild stress intervention was carried out for 6 weeks in the model group，low concentration group，high concentration group.Chronic unpredictable mild stress rat depression model was constructed.The effects of hydrogen free radical water on depressed rats was evaluated by observing the behavioral indexes and serum corticosterone.The short?term safety of hydrogen free radical water was preliminarily evaluated by comparing the results of blood routine，blood biochemistry and pathological sections of each group.Results：When the rats were of the same sex，there were no significant differences in the growth rate" of" body" weight at the same time point and" organ" index of vital" organs between experimental group and control group（Pgt;0.05）.After 6?week CUMS，rats showed depression?like behavior，which could be effectively alleviated in low concentration group and high concentration group.The blood routine results of each group were within the normal range.Although the level of alkaline phosphatase in low concentration group and high concentration group was lower than that in normal control group（Plt;0.05），there was no significant difference compared with model group（Pgt;0.05）.There were no significant differences in the comparison of γ?glutamyltransferase，urea，creatinine，aspartate aminotransferase，and serum albumin among normal control group，model group，low concentration group，high concentration group（all Pgt;0.05）.Microscopically，it was found that the degeneration and necrosis of renal tubular epithelial cells in the model group was more serious than that in the high concentration group.Minor inflammatory cell infiltration was observed locally in the submucosa of the bladder in the model group，but not in the high concentration group.No significant abnormalities were observed in the other organ tissues in the high concentration group compared with the normal control group.Conclusion：Under the experimental conditions，the results of this study don't indicate any acute or short?term toxic effects or toxicological profiles of hydrogen free radical water，and suggest that it may have a protective effect against chronic unpredictable mild stress?induced depressive?like behaviors，possibly with a dose?dependent effect.

Keywords" " hydrogen free radical water； chronic unpredictable mild stress， CUMS； depression?like behavior； security； corticosterone； animal experimentation

摘要" 目的：觀察氫自由基水的安全性及其對大鼠抑郁樣行為的改善效果。方法：將20只雌雄各半的6周齡Sprague?Dawley（SD）大鼠基于體重隨機分為實驗組和對照組，實驗期間分別給予高濃度氫自由基水和等量蒸餾水灌胃，觀察并記錄各組大鼠的一般情況、體重變化并進行相關病理學檢查。將32只雄性4周齡SD大鼠基于體重隨機分為正常對照組、模型組、低濃度組、高濃度組，對模型組、低濃度組、高濃度組大鼠進行慢性不可預測輕度應激干預6周，構建慢性不可預測輕度應激大鼠抑郁模型，通過觀察各組大鼠行為學指標、血清皮質(zhì)酮水平評估氫自由基水對抑郁大鼠的影響；通過比較各組大鼠血常規(guī)、血生化及病理切片結果初步評價氫自由基水的短期安全性。結果：相同性別時，實驗組與對照組同期體重增長率、重要器官臟器指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05）。為期6周的慢性不可預測輕度應激干預大鼠呈現(xiàn)了抑郁樣行為，低濃度組、高濃度組能有效緩解；各組血常規(guī)結果均在正常范圍內(nèi)；低濃度組、高濃度組堿性磷酸酶水平雖低于正常對照組（均Plt;0.05），但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；正常對照組、模型組、低濃度組、高濃度組γ?谷氨酰氨基轉移酶、尿素、肌酐、天門冬氨酸氨基轉移酶、血清白蛋白比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05）；鏡下發(fā)現(xiàn)，模型組腎小管上皮細胞變性壞死程度較高濃度組更嚴重，模型組膀胱黏膜下層局部可見輕微炎癥細胞浸潤，而高濃度組未見，其余臟器組織高濃度組與正常對照組比較均未見明顯異常。結論：在本實驗條件下，實驗結果未顯示出氫自由基水有急性和短期毒性效應及毒作用特征，并發(fā)現(xiàn)其對慢性不可預測輕度應激誘導的抑郁樣行為有一定保護作用，可能具有劑量效應。

關鍵詞" 氫自由基水；慢性不可預測輕度應激（CUMS）；抑郁樣行為；安全性；皮質(zhì)酮；動物實驗

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.22.010

2021年世界衛(wèi)生組織（WHO）報告顯示，全球約有2.8億例抑郁癥病人，每年有超過70萬人因自殺而死亡，自殺是15～29歲人群的第四大死亡原因[1]。預計到2030年，抑郁癥在全球疾病總負擔中將升至第1位[2]，抑郁障礙已成為重要的公共衛(wèi)生問題[3]。目前，抑郁癥治療成功率約為50%，20%～30%的抑郁癥病人需要長期或終身治療[4]，急需尋求預防和治療疾病的新方式。關于抑郁癥炎癥病因假說研究已逐漸成為抑郁癥發(fā)病機制的研究熱點[5]，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD?like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）炎癥小體被認為是潛在的抑郁癥炎性標志物之一[6]。已有研究表明，富氫水可以有效抑制海馬和前額葉皮層NLRP3炎性小體激活，減少白細胞介素?1β（IL?1β）和活性氧（ROS）的生成，改善慢性不可預測輕度應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘導的抑郁樣行為[7]。許多學者認為，氫之所以能在醫(yī)學領域發(fā)揮作用是基于其選擇性抗氧化清除細胞毒性自由基的特性[8?9]，氫自由基水是利用氫自由基溶解技術將氫自由基穩(wěn)定地溶解在水中以提高水的健康價值的新型氫健康飲品。適量的氫自由基可以與其他自由基或大分子物質(zhì)發(fā)生反應，起到清除毒性自由基、維護細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。目前，有關氫自由基水的研究有限，其毒理安全性基礎實驗——急性經(jīng)口毒性實驗[9?11]結果及健康益處尚不完全明確，使臨床抑郁癥飲食護理健康食品的選擇與應用受到限制。研究氫自由基水的安全性及其對抑郁癥的保護作用對減輕抑郁癥的公共衛(wèi)生負擔，制訂預防和改善抑郁癥的飲食護理策略具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1 實驗對象

1）氫自由基水的急性經(jīng)口毒性實驗：Sprague?Dawley（SD）大鼠20只，無特定病原體（SPF）級，6周齡，雌雄各半。2）氫自由基水對CUMS誘導的抑郁樣大鼠的干預效果研究：32只雄性SD大鼠，SPF級，4周齡。受試大鼠均由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，本研究涉及的動物實驗已通過山西醫(yī)科大學實驗動物福利倫理審查（批準編號為：SYDL2023037）。

1.2 實驗樣品

2種氫自由基水的定型產(chǎn)品，即低濃度氫自由基水（low concentration of hydrogen free radicals in water，F(xiàn)L）和高濃度氫自由基水（high concentration of hydrogen free radicals in water，F(xiàn)H），其氫自由基分別為9.61 μmol/L和30.1 μmol/L，均為透明色液體，無味，桶裝，生產(chǎn)商為恭養(yǎng)堂醫(yī)療科技（上海）有限公司。

1.3 主要儀器與設備

灌胃針、電子天平、蒸餾水、烏拉坦麻醉劑、實驗室常見解剖器械、顯微鏡、離心機、移液槍、全自動生化分析儀、攤片機、烘片機、全自動包埋機。

1.4 實驗方法

1.4.1 氫自由基水的急性經(jīng)口毒性實驗

選擇6周齡SPF級SD大鼠20只，雌雄各半，適應性喂養(yǎng)7 d后基于體重隨機分為實驗組和對照組，每組雌雄各5只。正式實驗前大鼠需禁食不禁水16 h，實驗開始后實驗組使用高濃度氫自由基水以20 mL/kg灌胃3次，間隔6 h；對照組使用等量蒸餾水以20 mL/kg灌胃3次，間隔6 h。間隔期間實驗組自由飲用氫自由基水，對照組自由飲用蒸餾水，實驗時間為14 d。

1.4.2 氫自由基水對CUMS誘導的抑郁樣大鼠的干預效果研究

選擇4周齡SPF級雄性SD大鼠32只，適應性喂養(yǎng)7 d后基于體重隨機分為正常對照組、模型組、低濃度組、高濃度組，每組8只，每日固定時間灌胃1次，灌胃體積均為20 mL/kg，正常對照組與模型組以蒸餾水灌胃，低濃度組以低濃度氫自由基水灌胃，高濃度組以高濃度氫自由基水灌胃。正常對照組大鼠每籠2只或3只維持正常的群居飼養(yǎng)，其余組均單籠飼養(yǎng)。對模型組、高濃度組、低濃度組大鼠進行CUMS干預[7，12?13]，主要包括小籠孤養(yǎng)、24 h晝夜顛倒、4 h噪聲、潮濕墊料、禁食不禁水、擁擠、空墊料、異物、夜間射燈、震蕩、45°傾斜籠子、小管內(nèi)限制運動等項目，每日隨機選擇其中1種或2種干預項目，時間和規(guī)律不可預測，造模時間為6周。

1.5 觀察指標

1.5.1 氫自由基水的急性經(jīng)口毒性實驗

1）灌胃后連續(xù)觀察14 d，觀察內(nèi)容包括大鼠行為活動、是否出現(xiàn)中毒及死亡現(xiàn)象等。2）于大鼠灌胃后1、2、3、7、14 d稱重。3）實驗結束后將大鼠進行大體解剖，肉眼觀察大鼠主要臟器病理變化，稱量各臟器重量（g），計算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器重量/體重×100%）。

1.5.2 氫自由基水對CUMS誘導的抑郁樣大鼠的干預效果研究

1）實驗結束后進行行為學實驗，包括糖水偏好實驗[14]、曠場實驗[12]、強迫游泳實驗[14]，通過電腦監(jiān)測系統(tǒng)進行記錄。2）試驗結束后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行血清皮質(zhì)酮檢驗，按照試劑盒操作步驟進行操作。3）試驗結束后將大鼠麻醉，經(jīng)下腔靜脈取血進行血常規(guī)指標（紅細胞計數(shù)、血紅蛋白、紅細胞分布寬度變異系數(shù)、紅細胞分布寬度標準差、白細胞計數(shù)、淋巴細胞絕對值）、生化指標（γ?谷氨酰氨基轉移酶、堿性磷酸酶、尿素、肌酐、天門冬氨酸氨基轉移酶、血清白蛋白、丙氨酸氨基轉移酶）測定。4）大鼠死亡后對大鼠進行大體解剖并行蘇木精?伊紅（HE）染色組織切片，置于光學顯微鏡下進行組織病理學觀察，通過與正常對照組及模型組比較以初步判斷服用氫自由基水的短期安全性[15]。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 28.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析后再進行最小顯著差異法（LSD）檢驗；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)（四分位間距）[M（IQR）]表示，組間比較采用秩和檢驗；定性資料以頻數(shù)表示，檢驗水準α=0.05。

2" 結果

2.1 氫自由基水的急性經(jīng)口毒性實驗結果

2.1.1 大鼠一般情況

連續(xù)觀察14 d，其間實驗組與對照組大鼠生長情況良好，大鼠飲食、二便、一般活動、常規(guī)狀態(tài)（如呼吸、眼、鼻、口腔、皮膚、被毛等）等均未見異常，無死亡情況出現(xiàn)。

2.1.2 大鼠體重變化（見表1）

2.1.3 各臟器病理學狀況

人道處死所有受試大鼠，大體解剖其主要臟器進行肉眼觀察，均未見異常。對大鼠的主要臟器稱重計算臟器指數(shù)，結果顯示，實驗組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05），見表2。

2.2 氫自由基水對CUMS誘導的抑郁樣大鼠的干預效果

2.2.1 4組大鼠抑郁樣行為及血清皮質(zhì)酮水平比較（見表3）

2.2.2 4組大鼠血常規(guī)指標比較（見表4）

2.2.3 4組大鼠生化指標比較（見表5）

2.2.4 病理學變化

與正常對照組相比，高濃度組的心、肝、脾、輸精管均未見異常；腎臟切片顯示：高濃度組與模型組腎組織腎小球結構基本正常，腎小管上皮細胞均有不同程度的變性壞死，且模型組比高濃度組病變嚴重；模型組膀胱黏膜下層局部可見輕微炎癥細胞浸潤，高濃度組膀胱組織整體結構正常，黏膜下層未見明顯炎癥細胞浸潤。

3" 討論

3.1 氫自由基水的安全性檢測

氫自由基水是利用氫自由基溶解技術將氫自由基穩(wěn)定地溶解在水中以提高水的健康價值的新型氫健康飲品。目前，有關氫自由基水的研究有限。食用安全性是功效研究的前提，急性經(jīng)口毒性實驗是毒理安全性研究中最基礎的一項實驗[9?10]，故本研究在探討氫自由基水抗抑郁效果之前，遵循動物實驗倫理3R原則，參考食品安全國家標準28 d經(jīng)口毒性試驗[15]，實施了氫自由基水的急性經(jīng)口毒性實驗，通過對大鼠血常規(guī)指標、血生化指標及病理學檢查等方面的觀察，初步探討了飲用氫自由基水的短期安全性，結果發(fā)現(xiàn)：1）在14 d的觀察期內(nèi)，各組大鼠生長情況良好，日常活動未見異常，皮毛光潔，自主活動與行為表現(xiàn)正常，同性別各組間進食飲水量差異不明顯，各器官與系統(tǒng)未見異常，無死亡情況出現(xiàn)。表明氫自由基水并未對大鼠一般情況產(chǎn)生明顯的毒性效應。2）體重是評價生長發(fā)育期受試動物健康狀況最敏感的指標之一[11]。觀察期間，同性別實驗組大鼠的體重增長率與同期對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05），表明實驗組大鼠體重受到受試物的影響不明顯，氫自由基水未對大鼠的體重產(chǎn)生明顯的不良影響。3）臟器指數(shù)可以靈敏地反映受試物對受試對象臟器的綜合影響[11]。實驗結束后，肉眼觀察大鼠主要臟器無異常變化，各臟器形態(tài)、顏色、質(zhì)地均正常。同性別實驗組大鼠主要器官的臟器指數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05），表明氫自由基水對大鼠各主要臟器無明顯損害。4）大鼠血液學各組指標均在正常生理范圍內(nèi)，表明短期飲用氫自由基水對大鼠的血常規(guī)無明顯影響。5）低濃度組、高濃度組腎臟功能指標與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05），說明氫自由基水對腎臟功能影響較小。6）低濃度組丙氨酸氨基轉移酶低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但其在正常生理范圍內(nèi)[16]，故無實際意義。低濃度組、高濃度組堿性磷酸酶水平與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05）；正常對照組堿性磷酸酶水平與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），提示可能是由于慢性應激造模致使堿性磷酸酶出現(xiàn)差異，與氫自由基水的“毒性作用”關系不大。

3.2 氫自由基水對大鼠抑郁樣行為及皮質(zhì)酮的影響

壓力在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色[17?20]。抑郁癥動物實驗研究造模方式較多，CUMS是其最經(jīng)典、使用最廣泛的一種造模方式[21?22]。糖水偏好實驗、強迫游泳實驗、曠場實驗等行為測試常被用以評價抗抑郁藥的療效[23]。本研究結果顯示，慢性應激刺激6周后，模型組與正常對照組相比表現(xiàn)出了蜷縮少動、易受驚、毛發(fā)粗糙無光澤，行為學實驗結果表現(xiàn)為模型組糖水消耗量減少，曠場實驗水平運動降低，強迫游泳靜止時間占比增加，提示模型組快感缺乏，對新環(huán)境的探索減少，慢性應激降低了大鼠對周圍環(huán)境的好奇程度，運動活動能力下降，出現(xiàn)絕望情緒，表明抑郁模型建立成功。低濃度組、高濃度組均能提高大鼠糖水消耗量，增加強迫游泳時間，高濃度組能增加水平運動距離，可能是由于氫自由基水逆轉了以上行為。已有研究表明，富氫水可以增加抑郁小鼠的糖水攝入量，縮短強迫游泳不動時間[7]，增加抑郁樣小鼠的曠場活動總距離和平均速度[24]，與本研究結果相似。Hu等[25]研究結果表明，富氫水可以抑制體內(nèi)應激相關的IL?1β，使氧化應激水平升高，還可通過抗炎及抗氧化特性有效控制應激反應。Masuda等[26]研究發(fā)現(xiàn)，富含氫、礦物質(zhì)的天然還原水可減少焦慮相關行為，防止氧化應激水平升高。下丘腦?垂體?腎上腺軸是機體的一種自我保護機制，強烈的慢性應激、工作壓力、離婚、失業(yè)和貧窮等均可導致下丘腦?垂體?腎上腺軸負反饋功能失調(diào)，皮質(zhì)酮釋放增多[12]。抑郁癥病人皮質(zhì)酮水平升高，可隨著抑郁癥狀的緩解而恢復[27]。本研究結果顯示，模型組大鼠較正常對照組大鼠的皮質(zhì)酮濃度升高，與已有研究結果[6，12]相似，而低濃度組、高濃度組均能不同程度逆轉這一情況，與Hu等[25]研究結果相似。表明氫自由基水可以在一定程度上緩解CUMS誘導的抑郁樣行為，且高濃度可能效果更佳。

4" 小結

在本實驗條件下，實驗結果未顯示出氫自由基水有急性和短期毒性效應和毒作用特征，并發(fā)現(xiàn)其對CUMS誘導的抑郁樣行為有一定的保護作用，可能具有劑量效應，后期可繼續(xù)進行其他安全性實驗并探討其抗抑郁相關分子機制。

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（收稿日期：2024-08-09；修回日期：2024-10-27）

（本文編輯 陳瓊）