外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)臍橙果實(shí)抗青霉病與活性氧代謝的關(guān)系

摘" " 要：【目的】通過探究外源茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）誘導(dǎo)臍橙果實(shí)采后抗青霉病與活性氧代謝的關(guān)系，為MeJA應(yīng)用于控制果實(shí)采后病害提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳约~荷爾和龍回紅臍橙果實(shí)為試材，在溫度（26±1） ℃、濕度85%～95%的環(huán)境下，使用濃度為50 μmol·L-1 MeJA密閉熏蒸處理24 h后，接種青霉病菌Penicillium italicum（1.25×106 spores·mL-1）20 μL，以無菌水處理為對照，另設(shè)100 μmol·L-1水楊苷異羥肟酸（salicyhydroxamic acid，SHAM）噴施處理，測定臍橙果實(shí)活性氧代謝相關(guān)指標(biāo)并分析關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平。【結(jié)果】50 μmol·L-1 MeJA熏蒸處理顯著提高2個臍橙品種果實(shí)的谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性以及對應(yīng)酶基因CsGR、CsAPX、Cu-ZnSOD、CsCAT、CsMDHAR、CsDHAR3的相對表達(dá)量，在紐荷爾中MeJA處理分別為對照的1.10、1.16、1.12、1.69、1.21、1.43、1.16、1.42、1.56、1.36、1.58、2.32倍，在龍回紅中MeJA處理分別為對照的1.13、1.49、1.02、1.41、1.26、1.79、2.98、1.59、1.10、1.79、1.57、1.31倍；同時(shí)，顯著提高了還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA）含量和DPPH自由基清除率，降低了過氧化氫（H2O2）含量和超氧陰離子（O2.-）產(chǎn)生速率，延緩了丙二醛（MDA）含量的積累?！窘Y(jié)論】使用MeJA于接種前24 h熏蒸臍橙果實(shí)，能提高柑橘果實(shí)活性氧代謝相關(guān)酶活性以及關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，增強(qiáng)果實(shí)對青霉病的抗性。

關(guān)鍵詞：臍橙果實(shí)；茉莉酸甲酯；青霉病抗性；活性氧代謝

中圖分類號：S666.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）12-2555-12

Involvement of induced resistance by methyl jasmonate to blue mold and reactive oxygen species metabolism in navel orange fruit

CHEN Ming， ZHENG Zhiyuan#， WANG Yinbao， GUO Yue， JIANG Haiyan， FU Yongqi， ZENG Jiaoke， CHEN Jinyin， XIANG Miaolian*

（College of Agronomy， Jiangxi Agricultural University/Jiangxi Provincial Key Laboratory of Fruit and Vegetable Storage and Preservation/Collaborative Innovation Center of Postharvest Key Technology and Quality Safety of Fruits and Vegetables in Jiangxi Province， Nanchang 330045， Jiangxi， China）

Abstract： 【Objective】 Navel orange [Citrus sinensis （Linn.） Osbeck ]， one of the most widely planted citrus fruit trees in the world， is mainly planted in Chongqing， Hubei， Jiangxi， Fujian and other places in southern China. However， navel orange fruits are susceptible to diseases caused by pathogens during postharvest transportation and storage， seriously affecting the quality and economic value of the fruits. The blue mold caused by Penicillium italicum is one of the most important postharvest diseases in navel orange fruits， which is currently mainly controlled by chemicals. Currently there is an urgent need to develop safer and more efficient preservation techniques to control post-harvest diseases of navel orange fruits. Methyl jasmonate （MeJA） is an important natural plant growth regulator， which can be used as an inducer of resistance to pathogen infestation to produce a defense response in plants. In recent years， the aspect of MeJA-induced disease resistance in plants has become a hot issue， but there are fewer reports on MeJA-induced resistance to P. italicum in navel orange fruits. In this study， we investigated the relationship between exogenous MeJA-induced postharvest resistance to the blue mold and reactive oxygen metabolism in navel orange fruits to provide a theoretical basis for the potential of the application of MeJA to control postharvest fruit diseases. 【Methods】 In this study， Newhall and Longhuihong navel orange fruits were used as test materials. Firstly， the fruits were cleaned with 0.05% sodium hypochlorite and water， then after being dried at room temperature， one group fruits were treated with 50 μmol·L-1 MeJA for 24 h at （26±1） ℃ and 85%-95% relative humidity， another group fruits were sprayed with 100 μmol·L-1 SHAM， and the third group treated with sterile water was used as control. The conidia of P. italicum that had been cultured on PDA medium for one week were collected and made into a spore suspension with a concentration of 1.25×106 spores·mL-1. The surface of the fruits was sterilized with 75% ethanol and inoculation was carried out by puncturing the equatorial part of the fruit at equal distances using an inoculation needle with a wound size of 2 mm in diameter and 3 mm in depth and injecting 20 μL of spore suspension of P. italicum. Ten fruits were selected from each treatment for 7 consecutive days， and 1 cm of peel tissue was taken from the disease-health junction of navel oranges and quickly frozen with liquid nitrogen for further analysis. The activities of glutathione reductase （GR）， ascorbate peroxidase （APX）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， monodehydroascorbate reductase （MDHAR）， dehydroascorbate reductase （DHAR）， and the relative expression levels of related genes including CsGR， CsAPX， Cu-ZnSOD， CsCAT， CsMDHAR and CsDHAR3 were measured. All data were statistically organized and analyzed by one-way analysis of variance （ANOVA） using Excel 2018 and SPSS 20.0 software. The origin 2018 software was used for graphing， and all data in the graphs were expressed as mean ± standard error （SE）. 【Results】 MeJA fumigation treatment significantly enhanced the activities of GR， APX， SOD， CAT， MDHAR， DHAR and the relative expression levels of CsGR， CsAPX， Cu-ZnSOD， CsCAT， CsMDHAR and CsDHAR3 in two navel orange varieties fruits. In the MeJA treatment of Newhall， they were 1.10， 1.16， 1.12， 1.69， 1.21， 1.43， 1.16， 1.42， 1.56， 1.36， 1.58 and 2.32 times as much as the control， respectively. In the MeJA treatment of Longhuihong， they were 1.13， 1.49， 1.02， 1.41， 1.26， 1.79， 2.98， 1.59， 1.10， 1.79， 1.57 and 1.31 times as much as the control， respectively. At the same time， the content of reduced glutathione （GSH）， ascorbic acid （AsA） and DPPH free radical scavenging rate were significantly increased， the content of hydrogen peroxide （H2O2） and the production rate of superoxide anion （O2.-） were decreased， and the accumulation of malondialdehyde （MDA） content was delayed. 【Conclusion】 In summary， MeJA fumigation of navel orange fruits for 24 h before inoculation could significantly enhance the resistance of fruits to P. italicum， increase the activity of enzymes related to active oxygen metabolism and the expression levels of key enzyme genes. The above results suggested that the enhancement of the resistance to the blue mold in navel orange fruits induced by the MeJA treatment might be related to its regulation of the reactive oxygen species metabolism. This study could provide theoretical basis and technical reference for the prevention and control of the blue mold disease during postharvest storage of the navel orange fruits.

Key words： Navel orange fruit; Methyl jasmonate; Resistance to blue mold; Reactive oxygen metabolism

在柑橘的貯運(yùn)過程中，果實(shí)采后腐爛嚴(yán)重，爛果率為10%～30%，其中由意大利青霉（Penicillium italicum）侵染引起的青霉病是果實(shí)腐爛的主要致病原因之一[1]，目前主要通過化學(xué)藥劑控制該病害。由于使用防治的化學(xué)藥劑在一定程度上也會抑制柑橘果實(shí)的生理活性，且長期使用化學(xué)試劑會降低植物對病原菌的抵御能力，使防治效果大大降低，以及公眾對食品健康和環(huán)境污染的日益關(guān)注，因此，開發(fā)出更多綠色安全高效的方法來控制柑橘果實(shí)采后病害具有重要的生產(chǎn)意義?；钚匝酰≧OS）的積累是由于植物遭受生物或非生物脅迫時(shí)，抗氧化防御系統(tǒng)不能及時(shí)消除其體內(nèi)過量的ROS而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)；其后果是破壞植物代謝平衡，導(dǎo)致植物生理紊亂甚至衰老死亡[2-3]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是一種重要的天然植物生長調(diào)節(jié)劑，可以作為植物抵抗病原體侵染產(chǎn)生防御反應(yīng)的誘抗劑[4]。王瀚博[5]在研究MeJA預(yù)處理采后藍(lán)莓果實(shí)對灰霉病抗性的影響中發(fā)現(xiàn)，MeJA可通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性，減輕活性氧損傷進(jìn)而增強(qiáng)采后藍(lán)莓果實(shí)對灰霉病的抗性。Wang等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能誘導(dǎo)楊梅抗氧化能力的增強(qiáng)，提高果實(shí)對橘青霉病菌（P. citrinum）的抗性。在外源MeJA誘導(dǎo)獼猴桃抗軟腐病的研究中發(fā)現(xiàn)，MeJA誘導(dǎo)了果實(shí)中過氧化物酶（POD）、CAT和SOD等抗氧化酶活性的提高，同時(shí)也有效提高了相關(guān)酶基因AcPOD、AcSOD的表達(dá)量[7]。Cao等[8]的研究表明，10 μmol·L-1 MeJA處理采后枇杷果實(shí)可通過增加多胺的含量來抑制炭疽病的發(fā)生。王建偉等[9]研究表明外源施加MeJA后能夠減輕鹽脅迫對菜用甘薯光合系統(tǒng)的傷害，并且提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，促進(jìn)菜用甘薯有機(jī)物質(zhì)的積累，從而提高產(chǎn)量。以上研究表明，外源MeJA的應(yīng)用能夠誘導(dǎo)采后果蔬產(chǎn)生防御反應(yīng)，激活相關(guān)防御酶活性，促進(jìn)抗病物質(zhì)積累，從而有效增強(qiáng)其對病原菌的抗性[4]。目前有關(guān)MeJA誘導(dǎo)臍橙果實(shí)抗青霉病的報(bào)道較少。筆者課題組在前期的試驗(yàn)中表明MeJA在調(diào)控臍橙果實(shí)抗青霉病中發(fā)揮重要作用，與其提高果實(shí)中防御酶POD、多酚氧化酶（PPO）以及病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶（CHI）、β-1，3-葡聚糖酶（GLU）活性密切相關(guān)，但MeJA誘導(dǎo)抗病與臍橙果實(shí)活性氧代謝之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步探究。本試驗(yàn)中，以紐荷爾和龍回紅臍橙果實(shí)為試材，探究外源MeJA熏蒸處理對采后臍橙果實(shí)活性氧代謝相關(guān)酶活性及其酶基因表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探究MeJA調(diào)控臍橙果實(shí)抗采后青霉病的作用機(jī)制，為MeJA應(yīng)用于果實(shí)貯藏保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用果：紐荷爾、龍回紅臍橙果實(shí)，于2021年11月12日采自江西省贛州市南康縣龍回鎮(zhèn)俊萍果業(yè)示范園（25.66° N，114.76° E），翌日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。選出大小均勻、成熟度一致、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實(shí)作為試驗(yàn)用果。先用自來水清洗，再用0.05%次氯酸鈉溶液浸洗2 min，最后使用自來水沖洗干凈。室溫下晾干后使用保鮮袋單果套袋，入庫備用（冷庫溫度：7～8 ℃）。

供試青霉病菌（P. italicum）：由果蔬貯藏與保鮮江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。從典型臍橙發(fā)病果實(shí)中單孢分離，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）進(jìn)行純化培養(yǎng)。試驗(yàn)前于恒溫箱[（25±1） ℃]培養(yǎng)5～7 d，用無菌水洗脫孢子，經(jīng)滅菌脫脂棉過濾后，配置濃度為1.25×106 spores·mL-1孢子懸浮液，備用。

試驗(yàn)試劑：茉莉酸甲酯（MeJA）：純度95%，水楊苷異羥肟酸（salicyhydroxamic acid，SHAM，茉莉酸生物合成抑制劑）購自美國Sigma-Aldrich公司，配制濃度為100 μmol·L-1，待用。

1.2 臍橙果實(shí)處理

預(yù)試驗(yàn)篩選出最適濃度50 μmol·L-1和最適熏蒸時(shí)間24 h的MeJA處理，在（26±1） ℃、相對濕度85%～95%環(huán)境下密閉熏蒸處理紐荷爾和龍回紅臍橙果實(shí)；以無菌水處理為對照，另設(shè)100 μmol·L-1 SHAM噴施處理，共3組處理，24 h后于超凈工作臺上通風(fēng)1 h后接種。臍橙果實(shí)表面經(jīng)75%乙醇消毒后，用接種針在其赤道部等距離刺傷，傷口大小為直徑2 mm，深度3 mm；注入濃度為1.25×106 spores·mL-1的P. italicum孢子懸浮液20 μL。每組處理3次重復(fù)，每次重復(fù)30個果實(shí)，每處理共90個果實(shí)，處理后置于溫度（26±1） ℃、相對濕度85%～95%培養(yǎng)箱。接種后0～7 d逐日從各處理中隨機(jī)選取10個果實(shí)，取3組處理臍橙果實(shí)病健交界處1 cm果皮組織，用液氮迅速冷凍研磨裝袋，于-80 ℃超低溫保存。

1.3 活性氧代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量的測定

谷胱甘肽還原酶（GR）、APX活性，還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（AsA）含量和超氧陰離子（O2.-）產(chǎn)生速率和丙二醛（MDA）含量參照曹建康等[10]方法測定，SOD活性、過氧化氫（H2O2）含量采用試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司，南京，中國）測定。CAT活性參考李合生[11]的方法測定。DPPH自由基清除率參考張昭等[12]的方法測定。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性參考Wei等[13]的方法測定。

1.4 活性氧代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)分析

參考馬巧利[14]的方法，采用改良Trizol法提取果皮總RNA，使用微量核酸分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。使用Hifair?Ⅲ試劑盒（翌圣，上海）反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA鏈。制備的cDNA保存-80 ℃超低溫冰箱用于后續(xù)qRT-PCR試驗(yàn)?；虮磉_(dá)測定：以甜橙CsActin基因?yàn)槎康膬?nèi)參基因，通過qRT-PCR方法檢測6種活性氧代謝抗病相關(guān)基因的表達(dá)量。引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃持續(xù)5 s，60 ℃退火持續(xù)30 s，72 ℃延伸30 s，共反應(yīng)40個循環(huán)。反應(yīng)體系為10 μL，包含1 μL cDNA + 0.3 μL F primer （10 mmol·L-1）+0.3 μL R primer （10 mmol·L-1） + 5 μL TB Green? Premix Ex Taq? + 3.4 μL ddH2O。每個樣品3次重復(fù)測定，基因表達(dá)水平計(jì)算采用2-ΔΔCt方法[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)按照完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，全部試驗(yàn)指標(biāo)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用Excel 2018和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理和單因素方差分析（ANOVA）。采用Origin 2018軟件作圖，圖中所有數(shù)據(jù)以平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理對臍橙果實(shí)GR活性和GSH含量的影響

從圖1-A可知，除接種后第1天和第6天外，紐荷爾MeJA處理組GR活性在接種后7 d內(nèi)均顯著高于對照（CK）和SHAM處理組（p＜0.05），其中在接種后第5天到達(dá)峰值，分別是對照和SHAM處理組的1.10倍和1.13倍。從圖1-B可知，龍回紅MeJA處理組GR活性在除接種后第4天和第6天外均顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；MeJA處理組的GR活性在接種后第5天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.13和1.16倍。

在接種后第3天和第5～6天，紐荷爾MeJA處理組GSH含量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；且在接種后第6天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.17和1.32倍（圖1-C）。在接種后第1、3天和第6～7天，龍回紅MeJA處理組GSH含量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；且在接種后第7天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.17和1.20倍（圖1-D）。

2.2 MeJA處理對臍橙果實(shí)APX活性和AsA含量的影響

紐荷爾臍橙MeJA和CK處理組APX活性呈先上升后下降、然后再上升最后又下降的趨勢，在接種后第3天最高，MeJA處理組顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05），分別是CK和SHAM處理組的1.16、1.22倍（圖2-A）；龍回紅MeJA和CK處理組APX活性總體呈先上升后下降趨勢，CK和處理組APX活性均在接種后第4天最高，MeJA處理組顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05），分別是CK和SHAM處理組的1.49、1.45倍（圖2-B）。隨著接種時(shí)間的延長，紐荷爾MeJA和SHAM處理組均呈雙峰趨勢。在接種后除第4天外，紐荷爾MeJA處理組AsA含量均顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）（圖2-C）；MeJA處理組AsA含量在接種后第6天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.12和1.16倍。于接種后第1～7天，龍回紅3組處理均大致呈先上升后下降趨勢。在接種后第1天和第3～6天，龍回紅MeJA處理組AsA含量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）（圖2-D）；MeJA處理組AsA含量在接種后第4天最高，為CK和SHAM處理組的1.20和1.14倍。

2.3 MeJA處理對臍橙果實(shí)SOD和CAT活性的影響

由圖3-A可知，紐荷爾3組處理SOD活性出現(xiàn)雙峰趨勢。在除接種后第6天外，MeJA處理SOD活性均顯著高于CK組（p＜0.05）；且在接種后第5天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.12和1.27倍。如圖3-B可知，龍回紅MeJA處理SOD活性在接種后第3、7天顯著高于CK組（p＜0.05）；且在接種后第6天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.02和1.10倍。

紐荷爾3組處理呈先上升后下降趨勢（圖3-C）。在接種后第1、6、7天，MeJA處理CAT活性顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；在接種后第6天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.69和2.10倍。龍回紅MeJA處理組CAT活性在接種后除第6天外均顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；MeJA處理組CAT活性于接種后第4天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.41和1.96倍（圖3-D）。

2.4 MeJA處理對臍橙果實(shí)H2O2含量和O2.-產(chǎn)生速率的影響

如圖4-A所示，紐荷爾3組處理H2O2含量呈先上升后下降趨勢，于接種后第6天最高。MeJA處理H2O2含量在接種后第1～4天和第7天顯著低于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；且在接種后第4天，僅為CK和SHAM處理組的51.21%和44.37%。如圖4-B所示，龍回紅3組處理H2O2含量大致呈上升趨勢。在接種后第3～5天，MeJA處理H2O2含量顯著低于CK組（p＜0.05）；于接種后第4天，分別為CK和SHAM處理組的84.67%和90.93%。

從圖4-C和圖4-D可知，MeJA和SHAM處理組O2.-產(chǎn)生速率呈雙峰趨勢。在除接種后第5天外，紐荷爾MeJA處理O2.-產(chǎn)生速率均顯著低于CK組（p＜0.05）；在接種后第3天最低，僅為CK和SHAM處理組的24.56%和31.84%。龍回紅MeJA處理O2.-產(chǎn)生速率在接種后第1天和第4～7天顯著低于CK組（p＜0.05）；于接種后第3天最低，分別為CK和SHAM處理組的95.33%和66.56%。

2.5 MeJA處理對臍橙果實(shí)MDA含量和DPPH自由基清除率的影響

如圖5-A和圖5-B所示，紐荷爾和龍回紅3組處理MDA含量均隨接種時(shí)間的延長呈大致上升趨勢。紐荷爾MeJA處理在接種后除第5天外顯著低于CK組（p＜0.05）；在接種后第3天最低，分別為CK和SHAM處理組的64.08%和67.46%。龍回紅MeJA處理組MDA含量在接種后第2～5天顯著低于CK組（p＜0.05）；于接種后第5天，含量是CK和SHAM處理組的74.93%和71.89%。

在接種后第3～7天，紐荷爾MeJA處理DPPH自由基清除率顯著高于CK組（p＜0.05）；在接種后第6天，MeJA處理DPPH自由基清除率最高，分別是CK和SHAM處理組的1.29和1.19倍（圖5-C）。在除接種后第2、5天外，龍回紅MeJA處理DPPH自由基清除率均顯著高于CK組（p＜0.05）；于接種后第7天，MeJA處理DPPH自由基清除率最高，分別是CK和SHAM處理組的1.18和1.11倍（圖5-D）。

2.6 MeJA處理對臍橙果實(shí)MDHAR和DHAR活性的影響

由圖6-A可知，紐荷爾MeJA處理MDHAR活性在接種后第3～7天顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；于接種后第3天達(dá)到峰值，MeJA處理MDHAR活性分別是CK和SHAM處理組的1.21和1.78倍。由圖6-B可知，除在接種后第6天龍回紅MeJA處理MDHAR活性與SHAM處理無顯著差異外，在接種后第2～7天顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；于接種后第5天最高，MDHAR活性分別是CK和SHAM處理組的1.26和1.53倍。

隨著接種時(shí)間的延長，紐荷爾MeJA和SHAM處理組DHAR活性出現(xiàn)雙峰趨勢（圖6-C）。于接種后第1天和第4～6天，MeJA處理DHAR活性顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；在接種后第5天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.43和1.47倍。從圖6-D可知，龍回紅3組處理DHAR活性均大致呈先上升后下降的趨勢。于接種后第4天，MeJA處理DHAR活性最高，分別是CK和SHAM處理組的1.79和1.91倍。

2.7 MeJA處理對臍橙果實(shí)活性氧代謝途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

由圖7-A所示，于接種后第3～4天和第6～7天，紐荷爾MeJA處理組CsGR相對表達(dá)量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；在接種后第7天，MeJA處理組CsGR相對表達(dá)量最高，分別是CK和SHAM處理組的1.16和1.86倍。由圖7-B所示，除接種后第7天外，龍回紅MeJA處理組CsGR相對表達(dá)量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；于接種后第4天，MeJA處理組CsGR相對表達(dá)量最高，分別是CK和SHAM處理組的2.98和2.52倍。

紐荷爾MeJA處理組CsAPX相對表達(dá)量除接種后第1天外均顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）（圖7-C）；MeJA處理組CsAPX相對表達(dá)量在接種后第5天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.42和1.24倍。龍回紅MeJA處理組CsAPX相對表達(dá)量在接種后第2～6天顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）（圖7-D）；MeJA處理組CsAPX相對表達(dá)量于接種后第5天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.59和3.01倍。

如圖7-E所示，在接種后除第3、4和6天外，紐荷爾MeJA處理組Cu-ZnSOD相對表達(dá)量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；于接種后第7天，MeJA處理組Cu-ZnSOD相對表達(dá)量最高，分別是CK和SHAM處理組的1.36和1.17倍。如圖7-F所示，在接種后第3天，龍回紅MeJA處理組Cu-ZnSOD相對表達(dá)量達(dá)到峰值，分別是CK和SHAM處理組的1.79和1.20倍。

在接種后第2～4天和第6天，紐荷爾MeJA處理組CsCAT相對表達(dá)量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；MeJA處理組CsCAT相對表達(dá)量于接種后第6天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.56和4.41倍（圖7-G）。在接種后除第2天外，龍回紅MeJA處理組CsCAT相對表達(dá)量均顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；在接種后第4天，MeJA處理組CsCAT相對表達(dá)量最高，分別是CK和SHAM處理組的1.10和6.75倍（圖7-H）。

從圖7-I可知，紐荷爾MeJA處理組CsMDHAR相對表達(dá)量在接種后第1、4天和第6～7天顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；其中在接種后第6天，MeJA處理組CsMDHAR相對表達(dá)量最高，分別是CK和SHAM處理組的1.58和1.29倍。從圖7-J可知，除接種后第1、6天外，龍回紅MeJA處理組CsMDHAR相對表達(dá)量均顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；MeJA處理組CsMDHAR相對表達(dá)量在接種后第7天最高，分別是CK和SHAM處理組的1.57和1.96倍。

由圖7-K所示，在接種后除第2、3天外，紐荷爾MeJA處理組CsDHAR3相對表達(dá)量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；于接種后第6天，MeJA處理組CsDHAR3相對表達(dá)量最高，分別是CK和SHAM處理組的2.32和1.91倍。由圖7-L所示，在接種后第3天和第5～6天，龍回紅MeJA處理組CsDHAR3相對表達(dá)量顯著高于CK和SHAM處理組（p＜0.05）；MeJA處理組CsDHAR3相對表達(dá)量在接種后第7天達(dá)到峰值，分別是CK和SHAM處理組的1.31和1.03倍。

3 討 論

MeJA作為一種抗病信號分子，可以誘導(dǎo)提高多種采后果蔬對病原菌侵染的抵抗能力。前人研究表明使用MeJA處理提高了果實(shí)抗氧化酶CAT、APX和SOD活性且促進(jìn)了GSH、AsA含量增加，并降低了O2.-產(chǎn)生速率、抑制H2O2含量積累[16-18]。筆者在本試驗(yàn)結(jié)果中顯示，與對照組相比，50 μmol·L-1 MeJA熏蒸處理紐荷爾和龍回紅臍橙果實(shí)，均顯著提高了GR、APX、SOD和CAT活性，降低了H2O2含量和O2.-產(chǎn)生速率，并促進(jìn)了GSH和AsA積累，表明外源MeJA處理激發(fā)了活性氧代謝途徑，顯著增強(qiáng)了SOD活性，將不穩(wěn)定的O2.-分解成為更穩(wěn)定的H2O2；同時(shí)H2O2又在CAT和APX的作用下被分解為H2O和O2，以及在GR的催化下GSSG被還原形成GSH。在MeJA處理下，臍橙果實(shí)體內(nèi)活性氧過度積累被清除，恢復(fù)了活性氧動態(tài)平衡，從而減輕了果實(shí)采后青霉病的發(fā)生?？梢娫谕庠醇ぐl(fā)因子的誘導(dǎo)下果蔬抗氧化酶活性增強(qiáng)同時(shí)抗氧化合物增加，清除了過度積累的活性氧，從而增強(qiáng)了果蔬抵抗病原菌侵染的能力。MDA是膜脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，其含量可以直接反映對植物細(xì)胞膜的破壞程度，是寄主抗病能力的重要指標(biāo)[19]。DPPH自由基清除率是植物組織內(nèi)的自由基清除率的判定指標(biāo)。ROS清除系統(tǒng)中包含AsA-GSH循環(huán)，GR、APX、MDHAR和DHAR是AsA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶。APX催化AsA產(chǎn)生MDHA，并消除H2O2；MDHA在MDHAR催化下可形成AsA，GSH為DHAR提供電子將DHA催化為AsA。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，與CK組和SHAM組比較，MeJA熏蒸處理影響兩品種臍橙果實(shí)活性氧代謝，果實(shí)內(nèi)MDHAR和DHAR活性得到顯著提高，DPPH自由基清除率顯著提升，進(jìn)而有效延緩了MDA的積累。試驗(yàn)結(jié)果與前人用MeJA與氯化鈉聯(lián)合處理提高了玉米芽中抗氧化酶活性和清除自由基能力的結(jié)論相一致[20]。同時(shí)，為應(yīng)對冷害、鹽脅迫和病害等生物或非生物脅迫，前人在研究MeJA處理對番茄[21]、玉米[22]和枇杷[23]的影響中發(fā)現(xiàn)，MeJA能夠不同程度地提高抗氧化物質(zhì)GSH、AsA的含量和AsA-GSH循環(huán)中關(guān)鍵酶MDHAR、DHAR的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)果蔬增強(qiáng)對外界環(huán)境的抗性。由此推測MeJA處理誘導(dǎo)臍橙果實(shí)對青霉病的抗性與其調(diào)控活性氧代謝相關(guān)酶活性及物質(zhì)含量有關(guān)，且筆者前期研究表明，龍回紅臍橙果實(shí)病斑直徑在接種第3天顯著小于紐荷爾臍橙果實(shí)病斑直徑，說明龍回紅比紐荷爾臍橙果實(shí)抗青霉病，可能導(dǎo)致了MeJA處理調(diào)控活性氧代謝相關(guān)酶活性及物質(zhì)含量在臍橙不同品種間存在差異，但其原因還需要進(jìn)一步深入研究。

植物在遭受病原微生物侵染時(shí)，不同外源誘導(dǎo)劑可調(diào)控植物次生代謝，激活多種相關(guān)防御基因的表達(dá)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)。前人研究表明外源MeJA處理后均能增加果實(shí)體內(nèi)活性氧代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量從而增強(qiáng)果實(shí)對病原菌的抗性[24-26]。此外，其他誘抗劑如苯并噻重氮（acibenzolar-S-methyl，ASM）和褪黑素（melatonin，MT）在對梨果實(shí)抗采后黑斑病的研究中指出，ASM處理激活了果實(shí)中抗病相關(guān)基因PcSOD、PcCAT、PcAPX和PcDHAR顯著表達(dá)；以及MT預(yù)處理顯著提高了果實(shí)中防御酶基因PpCAT、PpSOD、PpCHI和PpGLU的表達(dá)且在后期維持高水平表達(dá)，進(jìn)而有效提高梨果實(shí)抗采后黑斑病的能力[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，于接種前用MeJA熏蒸處理臍橙果實(shí)后，能誘導(dǎo)臍橙果實(shí)活性氧代謝相關(guān)防御酶基因（CsGR、CsAPX、Cu-ZnSOD、CsCAT、CsMDHAR和CsDHAR3）不同程度地顯著表達(dá)。由此推測MeJA誘導(dǎo)采后臍橙對青霉病的抗性可能與其活性氧代謝中相關(guān)防御酶基因的高表達(dá)密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

在接種P. italicum前采用外源50 μmol·L-1 MeJA熏蒸處理紐荷爾和龍回紅臍橙果實(shí)24 h，顯著提高了活性氧代謝相關(guān)酶（GR、APX、SOD、CAT、MDHAR和DHAR）活性，促進(jìn)了AsA、GSH含量的增加，降低了O2.-產(chǎn)生速率和H2O2含量、抑制了MDA的積累并提高了果實(shí)內(nèi)DPPH自由清除率水平；同時(shí)激活了相關(guān)防御酶基因（CsGR、CsAPX、Cu-ZnSOD、CsCAT、CsMDHAR和CsDHAR3）的顯著表達(dá)，進(jìn)而提升了臍橙果實(shí)抵抗青霉病菌侵染的能力。

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