高光譜圖像技術在醬油中L-色氨酸含量分析中的應用

摘要：以3種市售醬油為研究對象，利用二極管陣列檢測器結合外標法定量考察醬油中L-色氨酸含量；基于偏最小二乘法進行醬油中L-色氨酸含量預測。結果表明，在最大吸收波長302 nm、流動相pH 5.0、柱溫37 ℃、流速1.2 mL/min、流動相為甲醇比例12%、乙酸鈉緩沖液含量0.015 mol/L的乙酸鈉緩沖液-甲醇、氫氧化鈉濃度0.015 mol/L下進行醬油中L-色氨酸含量檢測時效果最優(yōu)；在光譜范圍462～506 nm、612～698 nm、794～858 nm之間時，校正集相關系數為0.985 1，均方根誤差為0.491；預測集相關系數為0.987 3，均方根誤差為0.373，其模型精度最高。利用高光譜圖像技術可以快速有效地進行醬油中L-色氨酸含量的測定，其結果可為醬油分析提供理論依據和數據支持。

關鍵詞：高光譜圖像技術；醬油；L-色氨酸含量

中圖分類號：TS264.21""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）12-0171-04

Application of Hyperspectral Imaging Technology in Analysis

of L-Tryptophan Content in Soy Sauce

ZHANG Huan-jun1， XU Qing-lei1， WANG Wen-wen2

（1.Zhumadian Vocational and Technical College， Zhumadian 463000， China; 2.Binhai School of

Foreign Affairs of Tianjin Foreign Studies University， Tianjin 300270， China）

Abstract： Taking three types of commercially available soy sauce as the research objects， the content of L-tryptophan in soy sauce is quantitatively examined using diode array detector combined with external standard method. The prediction of L-tryptophan content in soy sauce is carried out based on partial least squares method. The results show that the detection effect of L-tryptophan content in soy sauce is the best when the maximum absorption wavelength is 302 nm， the pH of the mobile phase is 5.0， the column temperature is 37 ℃， the flow velocity is 1.2 mL/min，" the mobile phase is sodium acetate buffer-methanol with the methanol proportion of 12% and the sodium acetate buffer content of 0.015 mol/L， and the concentration of sodium hydroxide is 0.015 mol/L. When the spectral range is 462～506 nm， 612～698 nm and 794～858 nm， the correlation coefficient of the calibration set is 0.985 1 and the root mean square error is 0.491; the correlation coefficient of the prediction set is 0.987 3 and the root mean square error is 0.373， indicating that the accuracy of the model is the highest. Using hyperspectral imaging technology can rapidly and effectively determine the L-tryptophan content in soy sauce， and the results can provide a theoretical basis and data support for soy sauce analysis.

Key words： hyperspectral imaging technology; soy sauce; L-tryptophan content

收稿日期：2024-06-18

基金項目：河南高等教育教學改革研究與實踐項目（2021SJGLX866）

作者簡介：張煥俊（1978—），女，河南駐馬店人，副教授，碩士，研究方向：高光譜圖像技術在食品工藝中的應用。

醬油是中國傳統(tǒng)的液體調味品，因其豐富的口感而深受人們喜愛，是一種大豆發(fā)酵類產品［1-2］。醬油主要由大豆、小麥、食鹽等原材料經微生物發(fā)酵釀制而成，呈紅褐色，色澤鮮亮，有獨特的醬香味，口感咸鮮，味道豐富，能改善菜肴的口感和風味，因此在烹飪中作為常見的調味品，有提升菜品風味、改善菜肴色澤、激發(fā)食欲的作用。由于醬油風味獨特，其被廣泛應用于烹調、食品加工等領域，并已從亞洲國家逐漸走向全球市場［3-4］。

醬油作為大豆類發(fā)酵產品，含有豐富的有機酸、氨基酸、還原糖等營養(yǎng)成分。在所含的氨基酸中，谷氨酸的含量最高，蘇氨酸的含量其次。醬油中所含氨基酸不僅可以直接被人體吸收，而且具有多種生理功能，如維持人體氮平衡、增強免疫力、促進營養(yǎng)物質代謝等。同時還可以通過美拉德反應生成復雜的香味物質，賦予醬油特有的風味和色澤。其中，L-色氨酸作為人體必需氨基酸，是評價醬油品質的重要指標之一［5］。醬油中的L-色氨酸在烹飪過程中與食材中微量金屬離子有機結合，可形成理化性質穩(wěn)定的有機螯合物，提升產品的風味［6］。

進行L-色氨酸檢測的傳統(tǒng)方法為理化分析法（凱氏定氮法）、儀器檢測法（氨基酸分析儀法）、高效液相色譜法等［7-14］，這些方法往往存在樣品被破壞、檢測成本高、持續(xù)時間長、檢測所需技術要求高等特點，與目前對食品安全快速、便捷的檢測要求不符，因此急需探討操作簡便且結果準確的檢測方法。

高光譜圖像技術是一種新型的遙感技術，利用光譜成像技術獲取大量連續(xù)的光譜信息，從而形成高維數據矩陣，因此被廣泛應用于環(huán)境監(jiān)測、農業(yè)、地質、醫(yī)學等領域［15］。高光譜圖像技術的核心在于光譜成像技術，它通過將目標物體發(fā)射或反射的光譜信息捕獲并成像，從而得到目標物體的光譜信息，這些信息可以反映目標物體的物質成分、結構、分布等特征，具有高分辨率、多波段全面了解目標信息等優(yōu)點。在食品安全檢測領域，與高效液相色譜技術、質譜技術等相比，高光譜圖像技術可以對樣品進行在線檢測，且在檢測過程中樣品結構保持完整，不會造成樣品破壞性損傷，尤其對于需進行過程性分析的實驗樣品更加友好，且實驗結果準確、快捷、高效。因此，目前在食品安全檢測領域應用范圍逐漸擴大，在果蔬［16］、肉類產品［17］的成分含量分析方面均有報道。

本文通過高效液相色譜法和高光譜圖像技術檢測方法對市售醬油進行L-色氨酸含量檢測，通過回歸分析獲得相關系數，最終判定兩種方法的相關性，為高光譜圖像技術在醬油L-色氨酸含量測定中的應用提供了理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

3種醬油樣品：購于駐馬店大潤發(fā)超市；L-色氨酸標準品、NaOH、無水乙酸鈉、冰醋酸（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器

APC-8015C高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器） 河南奧普斯儀器設備有限公司；SBD750成像光譜儀 美國FIGS公司；高光譜分析儀其他組成部分包括暗箱、升降臺、鹵鎢燈、計算機。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜法

1.2.1.1 L-色氨酸標準溶液和儲備液制備

準確稱取10 mg L-色氨酸標準品，定容于10 mL容量瓶中，于4 ℃避光保存；分別準確吸取L-色氨酸標準溶液1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 mL，分別定容至10 mL，制成濃度為100，80，60，40，20，10 μg/mL的儲備液，在室溫下避光保存。

1.2.1.2 NaOH溶液制備

準確稱取0.4 g氫氧化鈉，定容至100 mL容量瓶中，在室溫下保存。

1.2.1.3 乙酸鈉緩沖液制備

準確稱取0.82 g無水乙酸鈉，溶解于1 000 mL水中，使用冰醋酸調節(jié)pH為5.0。

1.2.1.4 樣品制備

取0.2 g醬油樣品，置于蛋白質水解管中，加入1.0 mL NaOH溶液，振蕩2 min，充氮2 min，置于114 ℃烘箱中水解22 h。置于室內待恢復至室溫，用乙酸鈉緩沖液定容至50 mL，過濾，上機分析。

1.2.1.5 色譜條件

色譜柱：反相C18柱；最大吸收波長：302 nm；流動相：乙酸鈉緩沖液（pH 5.0）；流速：1.2 mL/min；進樣量：25 μL；柱溫：37 ℃。

1.2.2 高光譜檢測

高光譜信息采集過程設置高光譜分析儀測定范圍為400～1 100 nm；光譜圖像分辨率為2.5 nm；樣品光譜信息采集過程中圖像分辨率為748×1 836像素；實驗臺傳送速度為1.0 mm/s；相機曝光率為35 s。

信號采集：信號采集開始前，需進行相關預實驗。經預實驗后依據傳送臺傳輸速度1.0 mm/s、相機曝光率35 s進行采集。光纖裝置開機預熱15 min后，準確吸取1 mL醬油樣品置于載物臺中間，調節(jié)傳送裝置傳送方向，以1.0 mm/s的速度經過相機鏡頭下方，以35 s曝光率進行拍照，獲得樣品信息。以同樣方式進行空載物臺及上置黑板拍照，獲得背景的高光譜信息［18-19］。采集光譜圖像計算方法參考文獻［20］。

Rλ=Iλ－BλWλ－Bλ。

式中： Rλ為光譜入射率；Iλ為校正前數據，W/（m2·nm）；Wλ為標定板數據，W/（m2·nm）；Bλ為基底信號數據，W/（m2·nm）。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法檢測醬油中L-色氨酸含量

2.1.1 柱溫篩選

由于柱溫嚴重影響色譜出峰時間，溫度越高，出峰時間越短，因此需對過柱溫度進行篩選。當柱溫低于37 ℃時，L-色氨酸含量檢測受到影響，出峰效果不佳；當柱溫高于37 ℃時，出峰速度快但分離效果不佳，影響結果分析，因此，確定過柱溫度為37 ℃。

2.1.2 流動相pH環(huán)境確定

pH環(huán)境對液相色譜的出峰情況和靈敏度會造成一定的影響，從而影響檢測結果。在檢測pH 3.0～5.0的乙酸鈉緩沖體系環(huán)境對L-色氨酸含量的影響后發(fā)現，隨著流動相pH的降低，出峰時間變慢，影響實驗分析時間，同時產生較多雜峰，影響L-色氨酸的峰形分析；隨著pH的升高，出峰速度提高，L-色氨酸的分離效果提高，但當pH高于5.0時又產生較多雜峰，影響結果分析，因此，確定流動相pH為5.0。

2.1.3 流動相選擇

高效液相色譜流動相常以甲醇、乙腈、離子對流動相（如四丁基銨、四乙基銨等）為基礎性流動相。在本實驗中，以甲醇比例不同的乙酸鈉緩沖液-甲醇為流動相，并篩選出12%甲醇比例的乙酸鈉緩沖液-甲醇流動相。同時篩選乙酸鈉緩沖液比例，以0，0.005，0.01，0.015 mol/L 4種不同含量的乙酸鈉緩沖液-甲醇流動相對L-色氨酸含量進行檢測，結果發(fā)現，在乙酸鈉緩沖液-甲醇流動相中乙酸鈉含量為0.015 mol/L時，L-色氨酸檢測出峰效果最佳，雜峰干擾少；而當高于或低于該濃度時，均出現較多雜峰，影響結果分析。因此，最終確定以12%甲醇比例、含0.015 mol/L乙酸鈉緩沖液的乙酸鈉緩沖液-甲醇為檢測流動相。

2.1.4 水解條件篩選

L-色氨酸作為一種氨基酸，其結構在酸性條件下極易被破壞，因此，本實驗中利用堿水解方式進行處理。但氫氧化鈉濃度嚴重影響氨基酸的水解效果，并最終影響峰面積的分析。本實驗選擇不同濃度的氫氧化鈉（0.010，0.015，0.020，0.025 mol/L）對大豆蛋白進行水解，比較結果后發(fā)現，當氫氧化鈉濃度為0.015 mol/L時，L-色氨酸峰面積保持一致，蛋白水解完全，效果較好。

2.1.5 醬油樣品檢測

在條件篩選后，在最大吸收波長302 nm、流動相pH 5.0、柱溫37 ℃、流速1.2 mL/min的條件下進行L-色氨酸標準品標準譜圖繪制，L-色氨酸峰形顯著。在302 nm波長處，吸收峰的靈敏度高、干擾?。灰晕辗迕娣e為縱坐標、L-色氨酸濃度為橫坐標繪制標準曲線，擬合方程為Y=26+241.5X（R2=0.99）。以此方程進行3種市售醬油產品的檢測，獲得3種醬油樣品中L-色氨酸含量，見表2和表3。

由表2和表3可知，3種醬油產品中L-色氨酸含量范圍為0.35～0.42 g/kg，這是由于在不同品牌的醬油生產中，其生產工藝有差異，同時也與所選用的大豆品種有關。在生產過程中，L-色氨酸結構可能遭到一定程度的破壞，也會導致L-色氨酸的含量下降［5］。

2.2 高光譜圖像技術檢測醬油中L-色氨酸含量

在高光譜圖像數據采集過程中，儀器、操作、基線漂移等情況會導致采集的信號數據信息量大、冗余數據多，影響數據結果的采集和處理。因此，如果直接對原始光譜圖像數據進行建模處理，會出現較大誤差，需要將采集的數據進行預處理，提升建模的精度［21］。

聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘模型是常規(guī)區(qū)間偏最小二乘法的一種改進，將同一次區(qū)間中精度較高的幾個局部區(qū)域所在子區(qū)間聯(lián)合統(tǒng)計，從而獲得目標樣品的相關參數［22-24］。在此過程中，首先將整個光譜區(qū)域劃分為多個等寬子區(qū)間，然后于每個子區(qū)間內進行一次偏最小二乘回歸，此時即可獲得每一個子區(qū)間的局部回歸模型，從而獲得多個子區(qū)間的局部回歸模型；隨后通過交互驗證獲得多個局部回歸模型的精度衡量，經比較全光譜模型和各個局部回歸模型的精度，篩選獲得精度較好的模型子區(qū)間，將這些精度較好的子區(qū)間再聯(lián)合建立高精度局部回歸模型，再以高精度局部回歸模型集進行交互驗證，從而確定特征波譜區(qū)間組合。

由于尚未見任何關于獲得醬油中L-色氨酸含量檢測的高光譜聯(lián)合建模子區(qū)間數目的報道，因此本實驗將整個光譜區(qū)域劃分為3，4，5，6，……，9個子區(qū)間，從而考察子區(qū)間劃分對模型精度和最佳波長區(qū)間的影響。同時，在相同子區(qū)間下又聯(lián)合2～4個子區(qū)間，建模結果見表4。

由表4可知，選用多個子區(qū)間進行聯(lián)合建模后，醬油中L-色氨酸含量的測定校正結果較好。當劃分為4個子區(qū)間、聯(lián)合3個子區(qū)間數、主成分因子為5時獲得的醬油中L-色氨酸含量校正模型最優(yōu)，此時選取的子區(qū)間為3，5，14，校正集相關系數為0.985 1，均方根誤差為0.491；預測集相關系數為0.987 3，均方根誤差為0.373。

3 結論

本研究通過比較篩選獲得高效液相色譜法檢測醬油中L-色氨酸含量的最優(yōu)方法：最大吸收波長302 nm、流動相pH 5.0、柱溫37 ℃、流速1.2 mL/min、12%甲醇比例、含0.015 mol/L乙酸鈉緩沖液的流動相、氫氧化鈉濃度0.015 mol/L。

準確獲知3種市售醬油中L-色氨酸的含量后，通過高光譜圖像技術進行檢測，從而獲得高光譜圖像技術預測醬油中L-色氨酸含量的最佳模型。通過選取最優(yōu)波段的光譜信息，建立最有效的預測模型，獲得結果：在光譜范圍462～506 nm、612～698 nm、794～858 nm之間時，校正集相關系數為0.985 1，均方根誤差為0.491；預測集相關系數為0.987 3，均方根誤差為0.373，其模型精度最高。結果表明，高光譜圖像技術可以應用于醬油中L-色氨酸含量的檢測。

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