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    小白菊內(nèi)酯對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制研究

    2024-12-31 00:00:00郭紅豆蔣凌羅順祥陳甘瀟林佳儀林奕帆徐尚華
    心血管病學(xué)進(jìn)展 2024年7期
    關(guān)鍵詞:活性氧心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激

    【摘要】目的 探索小白菊內(nèi)酯(PTL)對(duì)多柔比星(DOX)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法 培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞,應(yīng)用CCK-8法確定DOX和PTL的最佳作用濃度。將H9c2大鼠心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、PTL組、DOX組及DOX+PTL組進(jìn)行相應(yīng)處理,DCFH-DA染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡比例,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶1(HO-1)、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)x蛋白(Bax)和B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 檢測(cè)0.5~5.0 μmol/L濃度梯度的DOX處理大鼠H9c2心肌細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力下降,并且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性 (P<0.05),其中1.0 μmol/L DOX可引起H9c2心肌細(xì)胞活力降至53.0%±0.4%。5.0 μmol/L PTL預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞3 h后可顯著增加DOX引起的細(xì)胞活力(P<0.05)。與對(duì)照組相比,在DOX組的H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1及Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低,Bax表達(dá)顯著增加(P<0.05),氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞凋亡比例增多(P<0.05);與DOX組相比,PTL預(yù)處理顯著增加了DOX處理的H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表達(dá),降低Bax表達(dá)(P<0.05),并降低氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。結(jié)論 PTL緩解DOX引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷,可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制Bcl-2/Bax通路有關(guān)。

    【關(guān)鍵詞】小白菊內(nèi)酯;多柔比星;H9c2心肌細(xì)胞;Nrf2/HO-1信號(hào)通路;細(xì)胞凋亡

    【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.07.019

    Study on the Protective Effects and Mechanisms of Parthenolide Against Doxorubicin-Induced H9c2 Cardiomyocyte Injury

    GUO Hongdou1,2,JIANG Ling1,LUO Shunxiang1,CHEN Ganxiao1,LIN Jiayi 1,LIN Yifan1,XU Shanghua1

    (1.Department of Cardiology,Affiliated Nanping First Hospital,F(xiàn)ujian Medical University,Nanping 353000,F(xiàn)ujian,China; 2.Department of Cardiology,Wuwei People’s Hospital,Wuwei 733000,Gansu,China)

    【Abstract】Objective To investigate the protective mechanism of parthenolide (PTL) against doxorubicin (DOX)-induced cardiomyocyte injury.Methods Rat H9c2 cardiomyocytes were cultured,and then the optimal concentration of DOX and PTL was determined by CCK-8 assay.Rat H9c2 cardiomyocytes were randomly divided into control group,PTL group,DOX group and DOX+PTL group.Intracellular reactive oxygen species levels were detected with DCFH-DA using a flow cytometer and the apoptotic cells were measured with Annexin V-FITC/PI staining kit by flow cytometer.Western blot was employed to detect the expressions of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2),heme oxygenase-1 (HO-1),B-cell lymphoma-2-associated X protein (Bax) and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2).Results The cell viability of H9c2 cardiomyocytes exposed to 0.5~5.0 μmol/L DOX for 24 h decreased in a dose-dependent effect (P<0.05),and 1.0 μmol/L DOX could reduce the viability of H9c2 cardiomyocytes to 53.0%±0.4%.The cell viability of H9c2 cardiomyocytes pretreated with 5.0 μmol/L PTL for 3 h was significantly increased after exposure to DOX (P<0.05).The protein expression levels of Nrf2,HO-1 and Bcl-2 in DOX group were significantly decreased comparing with the control group,while the proapoptotic protein Bax was significantly increased (P<0.05),and the level of oxidative stress and the proportion of apoptosis were increased (P<0.05).Contrasted with DOX group,pretreatment with PTL could significantly increase the expression levels of Nrf2,HO-1 and Bcl-2 protein,and reduce the expression level of Bax (P<0.05),and decrease the degree of oxidative stress and apoptosis rate of DOX-induced H9c2 cardiomyocytes (P<0.05).Conclusion PTL alleviates DOX-induced injury of H9c2 cardiomyocytes which was associated with activation of Nrf2/HO-1 pathway and inhibition of Bcl-2/Bax signaling pathway.

    【Keywords】Parthenolide;Doxorubicin;H9c2 cardiomyocytes;Nrf2/HO-1 pathway;Apoptosis

    多柔比星(doxorubicin,DOX)作為一種常用的蒽環(huán)類(lèi)化療藥物,被廣泛用于臨床治療多種惡性腫瘤,包括乳腺癌、白血病、軟組織肉瘤和淋巴瘤等。然而,DOX的應(yīng)用受到劑量依賴(lài)性心肌毒性的限制[1]。最近的研究表明,氧化應(yīng)激在DOX引起的心肌細(xì)胞損傷中扮演了關(guān)鍵角色。此外,DOX導(dǎo)致過(guò)多的活性氧累積還會(huì)促使心肌細(xì)胞凋亡,最終演變成進(jìn)行性心肌病和心力衰竭[2]。小白菊內(nèi)酯(parthenolide,PTL)是從中藥艾菊中提取的倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)自然產(chǎn)物。PTL具有多種藥理作用,包括抗炎、抗氧化、促使細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤生長(zhǎng)等[3]。研究[4]已證實(shí),PTL通過(guò)減輕心血管損傷,延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展,對(duì)心肌缺血具有治療作用。然而,尚未有相關(guān)研究證明PTL是否具備減輕DOX引起的心肌細(xì)胞損傷的潛力。此外,研究[5]表明,PTL可通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、醌氧還原酶1、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達(dá),對(duì)抗慶大霉素引起的大鼠腎毒性。因此,本研究旨在使用DOX誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細(xì)胞模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),以研究PTL對(duì)DOX引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響,并探索其可能的作用機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

    H9c2大鼠心肌細(xì)胞系于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得。

    1.2 主要試劑

    主要試劑有DOX、PTL(MCE,美國(guó)),抗Nrf2、抗HO-1、抗B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2-associated X protein,Bax)、抗B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(Proteintech,中國(guó)),抗β-actin抗體(Cell Signaling,美國(guó)),CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(Dojindo,日本),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所,中國(guó)),DMEM高糖培養(yǎng)基、5%胰蛋白酶(Gibco,美國(guó)),胎牛血清(PAN Seratech,美國(guó)),以及青霉素和鏈霉素雙抗溶液(Thermo ScientificTM,美國(guó))。

    1.3 主要儀器

    主要儀器有Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀(BioTek,美國(guó))、PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀(BioRad,美國(guó))和FACSCantoTM Ⅱ型流式細(xì)胞儀(BD,美國(guó))。

    1.4 主要方法

    1.4.1 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

    使用含有10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素雙抗溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞,在37 ℃和5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度為80%左右時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞的傳代處理。傳代按1:3的比例進(jìn)行,也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到不同培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。

    1.4.2 DOX造模濃度的篩選

    將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種到96孔板中,每孔約有7 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后貼壁完全,分別予以0、0.5、1.0、2.0和5.0 μmol/L DOX處理24 h。隨后,每孔加入100 μL CCK-8工作液(包括90 μL DMEM培養(yǎng)基+10 μL CCK-8母液)。同時(shí)設(shè)置空白組,即只加入培養(yǎng)基而不加入細(xì)胞。所有操作需在避光條件下進(jìn)行,孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定每孔溶液的吸光度(A),并計(jì)算細(xì)胞活力值。DOX的用藥濃度將選取細(xì)胞活力值接近50%的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DOX損傷模型的制備。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%。

    1.4.3 PTL濃度的篩選

    將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種到96孔板中,每孔約有7 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后貼壁完全,分別予以含有0、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L DOX的培養(yǎng)基處理H9c2心肌細(xì)胞24 h。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,以確定PTL干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞的上限濃度。

    1.4.4 PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的作用

    將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種到96孔板中,每孔約有7 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后貼壁完全,分別予以1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L PTL預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞3 h。同時(shí)設(shè)立空白組和模型組,其中空白組只添加培養(yǎng)基,模型組加入培養(yǎng)基+1.0 μmol/L DOX。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力確定最佳PTL給藥濃度。

    1.4.5 實(shí)驗(yàn)分組

    基于CCK-8細(xì)胞活力的測(cè)定結(jié)果,筆者將實(shí)驗(yàn)分為以下組別:對(duì)照組、PTL處理組(5 μmol/L)、DOX處理組(1.0 μmol/L)、DOX+PTL共處理組(1.0 μmol/L DOX + 5.0 μmol/L PTL)。其中共處理組在PTL預(yù)處理3 h后,加入1.0 μmol/L DOX,共同干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞24 h;空白對(duì)照組只加入完全培養(yǎng)基;其余兩組按藥物濃度分別加入1.0 μmol/L DOX、5.0 μmol/L PTL干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞24 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.4.6 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

    使用Annexin V-FITC和PI染色來(lái)檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞的早期和晚期凋亡。不同組別的H9c2心肌細(xì)胞用0.25%無(wú)EDTA胰酶進(jìn)行消化,然后將細(xì)胞收集于微量離心管中,用PBS沖洗2次后重懸細(xì)胞。按照說(shuō)明書(shū)的操作方法:每組取10萬(wàn)重懸細(xì)胞,進(jìn)行離心(1 000 g,5 min),棄去上清液后加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。接著分別添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI,輕輕混勻,并轉(zhuǎn)移至流式管中。在避光條件下室溫孵育10 min后(孵育過(guò)程中通過(guò)重懸細(xì)胞3次以提高染色效果),立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.4.7 活性氧生成的檢測(cè)

    筆者使用DCFH-DA探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成。不同組別的H9c2心肌細(xì)胞在1 mL稀釋后的DCFH-DA中重懸,使細(xì)胞濃度為100萬(wàn)/mL,并在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min,孵育過(guò)程中每5 min輕輕顛倒混勻,以確保探針和細(xì)胞充分接觸。然后,用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌,以確保充分清除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧的生成。

    1.4.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

    各組細(xì)胞用PBS漂洗2次,加入含有RIPA裂解液在冰上進(jìn)行裂解30 min,然后進(jìn)行總蛋白提取,并使用BCA法完成蛋白濃度測(cè)定,加入5×loading buffer制樣。每孔上30 μg的蛋白,依據(jù)不同目的蛋白的大小,分別配置8%或10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。用PVDF轉(zhuǎn)印膜將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)移,并在室溫下封閉1 h,將PVDF膜用洗膜液清洗后,分別加入Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、β-actin一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。隔日用洗膜液清洗孵有抗體的PVDF膜3次,每次10 min,加入相應(yīng)的二抗(稀釋比例為1:2 000),室溫孵育1 h,然后使用ECL化學(xué)發(fā)光液在多功能成像系統(tǒng)下曝光顯影,應(yīng)用Image J軟件分析條帶的灰度。

    1.5 統(tǒng)計(jì)處理方法

    使用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示計(jì)量資料。應(yīng)用單因素方差分析對(duì)多組之間的差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn),不同兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 DOX造模濃度的確定

    與對(duì)照組相比,加入不同濃度梯度的DOX(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L和5.0 μmol/L)分別作用于大鼠H9c2心肌細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,DOX均可降低H9c2心肌細(xì)胞的活力,而且這種效應(yīng)呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(P<0.05),見(jiàn)圖1。因此,本研究后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)中,選擇可使H9c2心肌細(xì)胞活力降至接近50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的DOX的濃度,即應(yīng)用1.0 μmol/L DOX對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),干預(yù)時(shí)間為24 h,以建立DOX引起的心肌細(xì)胞損傷模型。

    2.2 PTL濃度的確定

    與對(duì)照組相比,不同濃度的PTL(1.0 μmol/L、2.0 μmol/L和5.0 μmol/L)處理對(duì)細(xì)胞活力均沒(méi)有顯著影響(P>0.05),見(jiàn)圖2。然而,當(dāng)PTL濃度增加至10.0 μmol/L和20.0 μmol/L時(shí),明顯降低了H9c2心肌細(xì)胞的活力(P<0.05)。因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇5.0 μmol/L的PTL濃度,確定為PTL的干預(yù)濃度上限。

    2.3 PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的作用

    經(jīng)過(guò)DOX處理24 h后,細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05),而經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L PTL預(yù)處理后,細(xì)胞活力均得到顯著提高(P<0.05)。在這4個(gè)劑量組中,5.0 μmol/L PTL表現(xiàn)出最顯著的保護(hù)效果,見(jiàn)圖3。因此,選擇5.0 μmol/L PTL進(jìn)行預(yù)處理,為期3 h,然后加入1.0 μmol/L DOX共同干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞,持續(xù)培養(yǎng)24 h。

    2.4 PTL對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)及活性氧生成的影響

    根據(jù)DCFH-DA染色的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L DOX干預(yù)的H9c2心肌細(xì)胞,與對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著增高(P<0.05)。然而,與1.0 μmol/L DOX處理組相比,DOX+PTL共處理組的細(xì)胞活性氧水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

    蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L DOX刺激后,H9c2心肌細(xì)胞中Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。然而,經(jīng)過(guò)PTL預(yù)處理后,Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

    2.5 PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

    根據(jù)Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀結(jié)果分析,與對(duì)照組相比,經(jīng)過(guò)1.0 μmol/L DOX處理24 h后,H9c2心肌細(xì)胞的凋亡比例顯著增加(P<0.05)。然而,與DOX處理組相比,DOX+PTL共處理組的細(xì)胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

    蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,應(yīng)用 1 μmol/L DOX處理H9c2心肌細(xì)胞,經(jīng)過(guò)24 h后,促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)顯著增加,同時(shí)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。然而,與DOX處理組相比,DOX+PTL共處理組的Bax表達(dá)顯著降低,抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

    3 討論

    盡管學(xué)術(shù)界對(duì)DOX引發(fā)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制已研究了數(shù)十年,但迄今為止,尚缺乏能有效預(yù)防和治療DOX心臟毒性反應(yīng)的特效藥物[6]。目前,右丙亞胺是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于改善DOX相關(guān)的心肌細(xì)胞損傷的唯一藥物,它通過(guò)抗心肌細(xì)胞過(guò)度氧化應(yīng)激的機(jī)制來(lái)減輕DOX心肌細(xì)胞損傷,并已在臨床上得到應(yīng)用[7]。然而,右丙亞胺的臨床效果存在限制,而且已有研究[8]表明它可能會(huì)增加兒童繼發(fā)性惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此,進(jìn)一步探索用于減輕DOX心臟毒性損傷的藥物,并深入了解其相關(guān)緩解作用機(jī)制,具有極其重要的臨床意義。

    PTL是從天然藥用植物艾菊中分離到的倍半萜烯內(nèi)酯類(lèi)化合物,其親脂性有助于其在血腦屏障中的良好透通性[9]?,F(xiàn)有研究 [3]已證實(shí)PTL的藥理作用領(lǐng)域較廣泛,主要涉及到抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化、免疫抑制、抑制破骨細(xì)胞活性,以及抗腫瘤等。本項(xiàng)研究觀察到,DOX可導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞的活力下降,然而在PTL預(yù)處理后可提高細(xì)胞活力,表明PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷具有一定程度的抑制作用。此外,研究還表明PTL可通過(guò)抑制STAT3和NF-κB信號(hào)通路,抑制不同腫瘤細(xì)胞的增殖,包含乳腺癌、急性髓性白血病等[10-11]。這些研究結(jié)果表明,PTL不僅可改善DOX引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷,還可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在不減弱DOX的抗腫瘤效果的前提下,PTL可能有望改善腫瘤患者的預(yù)后,因此,深入研究其心肌保護(hù)的具體機(jī)制具有重要意義。

    已有研究[12]明確指出,細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是參與DOX心肌細(xì)胞損傷重要病理過(guò)程之一,因此降低心肌細(xì)胞凋亡率可緩解DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。在本實(shí)驗(yàn)中,筆者應(yīng)用Annexin V-FITC/PI染色和蛋白質(zhì)印跡法來(lái)觀察H9c2心肌細(xì)胞的凋亡程度。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)DOX處理的H9c2心肌細(xì)胞中,促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)增加,抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)降低,同時(shí)細(xì)胞凋亡比例顯著增加,與相關(guān)研究[13]結(jié)果一致。與DOX處理組相比,經(jīng)過(guò)PTL預(yù)處理后,促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)降低,抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)增加,同時(shí)顯著減少了DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡比例。這些研究結(jié)果表明,PTL減輕DOX引發(fā)的H9c2心肌細(xì)胞損傷可能與抑制凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。

    另外,氧化應(yīng)激也在蒽環(huán)類(lèi)藥物引發(fā)心臟功能障礙的機(jī)制中扮演著重要的角色。DOX在其代謝過(guò)程中會(huì)生成半醌自由基,這些自由基通過(guò)一系列反應(yīng)最終形成活性氧,導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[14]。Nrf2是一種對(duì)氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子,它在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng),能上調(diào)抗氧化基因HO-1的表達(dá),而有活性的HO-1蛋白能減輕細(xì)胞內(nèi)炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等反應(yīng)。此外,應(yīng)用DOX會(huì)導(dǎo)致心臟中核蛋白Nrf2的表達(dá)降低[15-16]。有研究[17]已證實(shí),染料木黃酮,一種異黃酮類(lèi)植物雌激素,能增加DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷動(dòng)物模型中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平。這一過(guò)程可能與染料木黃酮激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān),發(fā)揮潛在的抗氧化作用,從而保護(hù)心臟免受損傷。在本實(shí)驗(yàn)中,筆者觀察到PTL預(yù)處理顯著減少了DOX引起的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成,增加了Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)水平,從而降低了促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá),抑制了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,最終緩解了DOX對(duì)H9c2心肌細(xì)胞引發(fā)的損傷。

    DOX造成心臟毒性的機(jī)制較為復(fù)雜,其通過(guò)提升氧化應(yīng)激水平直接或通過(guò)促凋亡間接導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷[18]。Nrf2/HO-1是在細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路之一,研究發(fā)現(xiàn)染料木黃酮激活此通路,抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,繼而抑制凋亡水平[17]。表明在DOX引起的心肌細(xì)胞損傷中,以上兩條通路可能存在相互影響,但需進(jìn)一步研究論證。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)PTL可調(diào)節(jié)這兩條通路并改善DOX引起的心肌細(xì)胞損傷。但關(guān)于通路間是否存在相互促進(jìn)關(guān)系,仍需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,本研究揭示PTL可能與激活Nrf2/HO-1通路,增加Nrf2、HO-1抗氧化蛋白的水平,降低心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成有關(guān),從而緩解氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損害,進(jìn)而減輕DOX引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡。此研究結(jié)果表明PTL對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷具有明顯的抵抗作用。本研究通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn),為臨床上治療和預(yù)防DOX引起的相關(guān)心臟病提供了參考,后續(xù)將進(jìn)一步完善動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

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    收稿日期:2023-12-24

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