柚類種質(zhì)資源DUS測試數(shù)量性狀分級研究

摘" " "要：【目的】驗證中國柑橘屬DUS測試指南中數(shù)量性狀對柚類種質(zhì)資源的適應性，為更客觀更科學地描述柚類數(shù)量性狀和修訂柑橘屬DUS測試指南提供參考。【方法】以中國柑橘屬測試指南為標準，對117份柚類種質(zhì)資源的25個數(shù)量性狀進行數(shù)據(jù)采集，根據(jù)各性狀的特點選擇合適的分級方法并確定分級范圍。【結(jié)果】25個數(shù)量性狀品種內(nèi)變異系數(shù)在2.96%～26.96%之間，品種間變異系數(shù)在10.33%～62.90%之間，大部分數(shù)量性狀數(shù)據(jù)的多態(tài)性和穩(wěn)定性較好；根據(jù)正態(tài)性檢驗結(jié)果對25個數(shù)量性狀進行分級，得到了25個數(shù)量性狀的分級標準，與柑橘屬測試指南的分級數(shù)相比：花萼直徑、果形指數(shù)、汁胞長度由3級增為5級，花瓣長度、花瓣寬度、葉片長度、葉片寬度、果皮厚度由9級減為7級，花瓣指數(shù)、葉形指數(shù)、中心柱大小、囊瓣數(shù)、果汁含量、可溶性固形物含量由9級減為5級，對果實質(zhì)量、果實縱徑和果實橫徑3個性狀分別制定了柚和葡萄柚的分級標準；該分級標準下25個數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)變化范圍為0.878～1.954，性狀間的相似系數(shù)分布在-0.69～0.91之間；通過主成分分析得到6個主成分，累積貢獻率達72.76%?！窘Y(jié)論】初步建立了柚類種質(zhì)資源25個數(shù)量性狀的分級指標，對柚類品種的性狀評價、利用及良種選育具有一定指導意義，同時為中國柚類種質(zhì)鑒定和DUS測試指南修訂提供參考。

關(guān)鍵詞：柚類；DUS測試；數(shù)量性狀；分級

中圖分類號：S666.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）09-1885-18

Classification study on quantitative characteristics of pomelo germplasm resources for DUS test

CHEN Pu1， XU Zhenjiang1， JIANG Dong2， YI Jing1， SU Muqing1， DENG Chao3*， RAO Dehua1*

（1College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， Guangdong， China; 2Citrus Research Institute of Southwest University， Chongqing 400712， China; 3Development Center of Science and Technonlogy， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Beijing 100122， China）

Abstract： 【Objective】 The DUS （Distinctness， Uniformity and Stability） test refers to the process of testing the specificity， consistency and stability of new plant varieties. The DUS test guideline is the technical basis and standard for DUS test of tested varieties， and has become the technical basis for variety approval， variety registration and variety protection in China. At present， the DUS testing guideline of Citrus in China （NY/T 2435—2013） covers the entire Citrus genus. However， there are great differences in some characteristics between the different species in the same genus . Therefore， this study aimed to explore the adaptability of quantitative characteristics in the DUS testing guidelines for Citrus in China to pomelo varieties， and to provide reference for more objective and scientific description of quantitative characteristics of pomelo and revision of DUS test guidelines of Citrus. 【Methods】 In this study， twenty-five quantitative characteristics of the 117 pomelo germplasm resources in the National Citrus Germplasm Resource collection were observed according to the DUS testing guideline of Citrus in China. The data of these twenty-five quantitative characteristics were collected by measurement method. The normality of the data was comprehensively judged according to the significant test value of the K-S test for each quantitative characteristics， the fitting of the frequency distribution diagram and the normality curve， and the deviation between the measured value of the Q-Q diagram and the predicted normal value. The least significant difference method was used to grade the quantitative characteristics that conformed to the normal distribution， and the range method was used to grade the quantitative characteristics that did not conform to the normal distribution. 【Results】 The intra-variety variation coefficient of the twenty-five quantitative characteristics was between 2.96% and 26.96%， and the inter-variety variation coefficient was between 10.33% and 62.90%. Most quantitative characteristics showed great polymorphism and stability. According to the results of normality test， the petal length， petal length/width， leaf blade length， leaf blade length/ width， petiole length， petiole wing width， stylar scar diameter， core diameter， fruit rind thickness， number of segments per fruit， number of seeds， fruit juiciness， total soluble solids， fruit juice acidity and edible rate conformed to normal distribution; The length of spring shoot internode， petal width， stamens number per flower and leaf blade width conformed to the approximate normal distribution， calyx diameter， fruit lengt， fruit diameter， fruit length/diameter， juice vesicles length and single-fruit weight did not conform to normal distribution. Among the six quantitative characteristics that did not follow a normal distribution， the frequency distribution of the fruit weight， fruit length and fruit diameter showed a clear bimodal distribution， which was mainly caused by the significant differences between pomelo and grapefruit species. Grapefruit and pomelo showed significant differences in these three characteristics， leading to a bimodal distribution. Therefore， if pomelo and grapefruit were uniformly graded on these quantitative characteristics， it would lead to a wide grading range and misjudge varieties with differences as no differences， thereby increase the probability of errors occurring. This study developed different grading standards for pomelo and grapefruit based on these three characteristics. After separating the data of the two species based on the three quantitative characteristics mentioned above， it was found that except for the pomelo group whose data on fruit diameter did not follow a normal distribution， the rest basically followed a normal distribution or approximate normal distribution. The least significant difference method was used to grade the quantitative characteristics that conformed to the normal distribution， and the range method was used to grade the quantitative characteristics that did not conformed to the normal distribution. The classification standards of the twenty-five quantitative characteristics were obtained. Compared with the grading numbers in the DUS testing guideline of Citrus in China， the calyx diameter， fruit shape index and juice cell length increased from 3 levels to 5 levels， the petal length， petal width， leaf length， leaf width and pericarp thickness decreased from 9 levels to 7 levels， and the petal index， leaf shape index， central column size， capsule number， juice content and soluble solids decreased from 9 levels to 5 levels. For fruit weight， fruit length and fruit diameter， the grading standards of pomelo and grapefruit were formulated respectively. The Shannon diversity index of each characteristics under this grading standard ranged from 0.878 to 1.954， and the Shannon diversity index of fruit juice acidity was relatively large， indicating that this characteristics had more phenotypes and was evenly distributed in different grades. The correlation coefficient of the twenty-five quantitative characteristics ranged from -0.69 to 0.91， and the correlation coefficient between fruit diameter and fruit weight was the highest， reaching 0.91， showing a very significant positive correlation. Six principal components were obtained by principal component analysis， with a cumulative contribution rate of 72.76%. The first principal component contained the most information， which was mainly determined by the 11 characteristics， including the fruit diameter， fruit weight， fruit length， petal width， calyx diameter， petal length， core diameter， stamens number per flower， juice vesicles length， leaf blade width and number of seeds. 【Conclusion】 This study established a preliminary classification index for the twenty-five quantitative characteristics of pomelo germplasm resources， which would have certain guiding significance for the evaluation， utilization， and breeding of pomelo germplasm resources. At the same time， it would provide reference for the identification of pomelo germplasm and the revision of pomelo DUS testing guideline in China. In addition， the classification standard of this study was based on the growth performance of pomelo in Chongqing， and the specific classification range might not be fully applicable to other ecological regions. In the process of DUS testing， researchers should make corresponding adjustments according to the expression status of standard varieties and combine with the field conditions， so as to ensure accurate evaluation and comparison of the character differences of the varieties in different regions.

Key words： Pomelo; DUS testing; Quantitative characteristics; Grade

柚[Citrus grandis（L.）Osbeck]又名拋子、文旦，葡萄柚（C. paradisi Macf.）又名西柚或圓柚，兩者均為蕓香科柑橘屬植物。柚的果實柚子，果型碩大、營養(yǎng)豐富、耐貯藏、便于運輸，有“天然罐頭”之稱[1]；葡萄柚果實比柚子較小，口感酸甜，略帶苦味，具有清熱退火的功效，主要用作鮮食、果汁、罐頭和色拉的原料[2]。大多學者認為葡萄柚是柚與甜橙的回交后代[3-5]，在植物分類上屬于與柚并列的一個種，在栽培上將其列入柚類[6]。柚類是柑橘屬四大栽培種類群（寬皮柑橘類、橙類、柚類、檸檬類）之一，中國作為柚類的原產(chǎn)地和變異中心，有著豐富的種質(zhì)資源以及數(shù)千年的栽培歷史[7-9]。

植物新品種保護是實施國家知識產(chǎn)權(quán)和種業(yè)振興的重要組成部分，其不僅關(guān)系到育種權(quán)人的切身利益，還對推動種業(yè)的創(chuàng)新和發(fā)展起到關(guān)鍵作用。根據(jù)《中華人民共和國種子法》規(guī)定，申請品種權(quán)保護和品種審定、登記的農(nóng)作物，均需開展特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）測試[10]。中國于2003年將柑橘屬列入中華人民共和國農(nóng)業(yè)植物品種保護名錄（第五批）中，并于2013年發(fā)布《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 柑橘》（NY/T 2435—2013）農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（以下簡稱柑橘屬測試指南）。該指南的適用范圍包括整個柑橘屬，共有113個測試性狀，含質(zhì)量性狀和假質(zhì)量性狀45個，數(shù)量性狀68個。數(shù)量性狀是指表達狀態(tài)覆蓋了從一個極端到另一個極端之間的整個變異范圍的性狀[11]，如葉片長度、果實質(zhì)量等。數(shù)量性狀分級是數(shù)量性狀代碼轉(zhuǎn)換的重要依據(jù)，數(shù)量性狀分級科學與否直接影響測試的最終結(jié)果。由于數(shù)量性狀極易受環(huán)境條件的影響，測試指南中沒有規(guī)定每個數(shù)量性狀的具體分級范圍，通過給出相應的一套標準品種作為標尺矯正每個生長周期中外界環(huán)境對測試結(jié)果的影響。

柑橘屬測試指南中列出了甜橙、寬皮橘、柚類和檸檬這四種類群的標準品種。其中，柚和葡萄柚雖同為柚類，兩者體型卻存在較大差異，在果型大小方面有著顯著差別。但柑橘屬測試指南對這些性狀的分級較少，例如在果實縱徑和果實橫徑上僅分為三級，第一級“小”的標準品種為葡萄柚品種馬敘，第二級“中”的標準品種為柚品種梁平柚（果實橫徑對應的是沙田柚），第三級“大”的標準品種為柚品種琯溪蜜柚。由于級數(shù)過少，僅把葡萄柚放置在最小等級中，不能很好地區(qū)分葡萄柚品種間以及柚品種間的差異。另外，柑橘屬的各種間形態(tài)大小各異，特別是柚，其果實體積是其他幾個種的數(shù)倍，采用同一套分級代碼進行測試可能會對柚品種的區(qū)分和鑒別產(chǎn)生偏差。

筆者在本研究中針對柚類種質(zhì)資源在柑橘屬測試指南中的25個數(shù)量性狀進行分級研究，建立了一套柚類數(shù)量性狀的分級標準，可為更客觀更科學地描述柚類數(shù)量性狀和柑橘屬DUS測試指南修訂提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

117份柚類種質(zhì)資源均來自國家柑橘種質(zhì)資源圃（重慶）。由于中國葡萄柚的發(fā)展歷程較短，僅收集了13份葡萄柚品種資源進行研究，其余104份為柚品種資源。供試材料包括大部分柑橘屬測試指南中的標準品種，具有良好的代表性（表1）。

1.2 數(shù)據(jù)采集方法

DUS測試中數(shù)量性狀表達可通過目測或測量的方法觀測。當品種內(nèi)變異較小時，通?？梢酝ㄟ^目測而減少工作量；而當品種間差異較小，目測無法判定該性狀是否存在明顯差異，或當對一個通常采用目測的數(shù)量性狀作為與另一品種相區(qū)別的性狀沒把握時，應對該數(shù)量性狀進行測量，通過統(tǒng)計分析的方法判定[11]。

對柑橘屬測試指南中的25個數(shù)量性狀采集田間數(shù)據(jù)，其中18個為測量性狀，7個為群體目測性狀（T1、T2、T10、T11、T16、T17、T20）。為提升性狀觀測的精準性，調(diào)查時均采用測量的方法，以測量值對個體或群體進行記錄（表2）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2021計算出各性狀的最小值、最大值、中值、平均值和標準差。根據(jù)公式（1）計算品種內(nèi)變異系數(shù)CV1，根據(jù)公式（2）計算品種間變異系數(shù)CV2。其中X1為每個性狀每個品種的均值，X2為各性狀的均值，S1為每個性狀每個品種的標準差，S2為各性狀的標準差。

[CV1 = S1 ÷ X1×100%]； " " " （1）

[CV2 = S2 ÷ X2×100%]。 " " " （2）

遺傳多樣性指數(shù)采用香農(nóng)多樣性指數(shù)，計算公式為H’= -[Pi×ln（Pi）]，其中[Pi]表示某個性狀第i個代碼出現(xiàn)的概率，H’為遺傳多樣性指數(shù)。使用SPSS軟件進行K-S檢驗及LSD檢驗，通過Origin軟件繪制頻率分布直方圖和Q-Q圖，利用R語言進行相關(guān)性分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚類種質(zhì)資源數(shù)量性狀變異情況分析

性狀表達狀態(tài)在品種內(nèi)變異系數(shù)越小，該性狀在品種內(nèi)表達越穩(wěn)定；在品種間變異系數(shù)越大，遺傳背景越豐富，利用該性狀鑒別品種的可能性越大。對117份柚類種質(zhì)資源的數(shù)量性狀進行統(tǒng)計分析（表3），結(jié)果表明，25個數(shù)量性狀的品種內(nèi)變異系數(shù)介于2.96%～26.96%之間，其中T23可溶性固形物含量、T14果實橫徑和T15果形指數(shù)的品種內(nèi)變異系數(shù)較小，分別為2.96%、3.40%和3.86%，說明這幾個性狀在品種內(nèi)的穩(wěn)定性較好；T11翼葉寬度和T21種子數(shù)量的品種內(nèi)變異系數(shù)較大，分別為23.01%和26.96%，表明這2個性狀在品種內(nèi)的穩(wěn)定性較差，易受環(huán)境等因素影響。

所有數(shù)量性狀的品種間變異系數(shù)均大于品種內(nèi)變異系數(shù)，變化范圍在10.33%～62.90%之間。品種間變異系數(shù)較大的有T11翼葉寬度（43.33%）、T12果實質(zhì)量（39.75%）、T17中心柱大?。?2.49%）、T18果皮厚度（36.79%）、T21種子數(shù)量（62.90%）和T24果汁含酸量（54.82%），這些性狀在品種間的變異幅度大，遺傳變異較為豐富。

2.2 柚類種質(zhì)資源數(shù)量性狀正態(tài)性檢驗

數(shù)量性狀分級方法的選擇與性狀表達狀態(tài)是否符合正態(tài)分布密切相關(guān)，對各數(shù)量性狀的數(shù)據(jù)進行K-S正態(tài)性檢驗并繪制頻率分布直方圖和Q-Q圖（表4，圖1）。T3花瓣長度、T5花瓣指數(shù)、T7葉片長度、T9葉形指數(shù)、T10葉柄長度、T11翼葉寬度、T16花柱痕直徑、T17中心柱大小、T18果皮厚度、T19囊瓣數(shù)量、T21種子數(shù)量、T22果汁含量、T23可溶性固形物含量、T24果汁含酸量以及T25可食率這15個性狀的K-S檢驗p值大于0.05，中值與平均值接近，數(shù)據(jù)分布較均勻，Q-Q圖中實測值與預測正態(tài)值偏差不大，符合正態(tài)分布；T1春梢節(jié)間長度、T4花瓣寬度、T6雄蕊數(shù)量及T8葉片寬度這4個性狀的K-S檢驗p值小于0.05，但其頻次分布曲線與正態(tài)分布曲線較為相似，偏度與峰度值均小于1，Q-Q圖中實測值與預測正態(tài)值偏差不大，可認為符合近似正態(tài)分布；T2花萼直徑、T13果實縱徑、T14果實橫徑、T15果形指數(shù)、T20汁胞長度這5個性狀的K-S檢驗p值小于0.05，中值與平均值差距較大，頻率分布直方圖可看出對稱性較差且Q-Q圖中實測值與預測正態(tài)值偏差較大，不符合正態(tài)分布；T12果實質(zhì)量的K-S檢驗p值雖大于0.05，但中值與均值相差較大，數(shù)據(jù)分布不均勻，同時其Q-Q圖中實測值與預測正態(tài)值也具有偏差，故認為不符合正態(tài)分布。

在不符合正態(tài)分布的6個性狀中，發(fā)現(xiàn)3個性狀的頻率分布圖呈現(xiàn)出明顯的雙峰分布，這些性狀分別是T12果實質(zhì)量、T13果實縱徑和T14果實橫徑。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這種雙峰現(xiàn)象主要由葡萄柚和柚兩個種之間的顯著差異所引起。葡萄柚屬于小型果而柚屬于大型果，兩者在這3個的性狀上表現(xiàn)出較大的差異，從而導致雙峰分布的情況。因此若將柚和葡萄柚在這些數(shù)量性狀上進行統(tǒng)一分級，會導致分級范圍寬而將有差異的品種錯判為無差異，進而增加錯誤發(fā)生的概率。將針對這3個性狀分別為柚和葡萄柚制定不同的分級標準，并以“編號1（僅適用于柚）”、“編號2（僅適用于葡萄柚）”的形式呈現(xiàn)。

上述3個性狀在柚和葡萄柚群體中的分布情況及其K-S檢驗如圖2、表5所示。對兩類群數(shù)據(jù)進行分離處理后，發(fā)現(xiàn)除柚群體在性狀T14的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布外，其余基本符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布。

2.3 柚類種質(zhì)資源數(shù)量性狀分級和多樣性分析

在DUS測試中，對符合正態(tài)分布的數(shù)量性狀分級使用較多的是概率分布法和最小顯著差法。概率分布法按（X-1.281 8S）、（X-0.524 6S）、（X+0.524 6S）和（X+1.281 8S）4個分點可將性狀分為3或5級（X為均值、S為標準差）；最小差異顯著法通過計算每個數(shù)量性狀的LSD0.05的值，以測量數(shù)據(jù)的中值為中心，級差大于等于2倍LSD0.05向兩側(cè)進行等距劃分，再通過實際情況對每個區(qū)間進行調(diào)整，可將數(shù)量性狀分為3～9級不等。國際植物新品種保護聯(lián)盟（簡稱UPOV）提出每個分級所包含的區(qū)間不得小于2倍LSD0.05[12]，不僅確保了每個相鄰分級之間具有明顯的差異，而且能將相對集中的數(shù)據(jù)進行較為細致的劃分。

大多性狀利用概率分布法的分級區(qū)間不滿足大于等于2倍LSD0.05的要求，且有較多的品種資源落在兩端代碼的范圍，不利于區(qū)分特殊的（如極大或者極小）品種，故對符合正態(tài)分布和近似正態(tài)分布的性狀均采用最小顯著差法進行分級。對于不符合正態(tài)分布的數(shù)量性狀，運用極差法來進行劃分。首先通過極差與分級數(shù)的比值計算出每一個數(shù)量性狀的分級級差，以分布范圍的中位數(shù)為分級中點，按公式y(tǒng)=G±（1/2+n）x（n=0、1、2、3、4，G為數(shù)據(jù)中位數(shù)，x為分級級差）進行級別劃分，確定各數(shù)量性狀分級區(qū)間。根據(jù)性狀的變異、數(shù)據(jù)分布情況以及田間的整體表現(xiàn)情況來確定分級數(shù)（表6）。

通過最小差異顯著法和極差法，將性狀T1春梢節(jié)間長度、T6雄蕊數(shù)量、T10葉柄長度、T11翼葉寬度、T16花柱痕直徑和T25可食率分成3個連續(xù)分布的分級范圍，性狀T2花萼直徑、T5花瓣指數(shù)、T9葉形指數(shù)、T12.2果實質(zhì)量（僅適用于葡萄柚）、T13.2果實縱徑（僅適用于葡萄柚）、T14.2果實橫徑（僅適用于葡萄柚）、T15果形指數(shù)、T17中心柱大小、T19囊瓣數(shù)量、T20汁胞長度、T21種子數(shù)量（自然授粉）、T22果汁含量和T23可溶性固形物含量分成5個連續(xù)分布的分級范圍，性狀T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T7葉片長度、T8葉片寬度、T13.1果實縱徑（僅適用于柚）、T14.1果實橫徑（僅適用于柚）和T18果皮厚度分成7個連續(xù)分布的分級范圍，性狀T12.1果實質(zhì)量（僅適用于柚）和T24果汁含酸量分成9個連續(xù)分布的分級范圍。

25個性狀的區(qū)間均大于2倍的LSD0.05，符合UPOV對相鄰分級間明顯差異的要求。將分級數(shù)與柑橘屬測試指南的分級數(shù)相比（表6），T2花萼直徑、T15果形指數(shù)、T20汁胞長度由3級增為5級；T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T7葉片長度、T8葉片寬度、T18果皮厚度由9級減為7級；T5花瓣指數(shù)、T9葉形指數(shù)、T17中心柱大小、T19囊瓣數(shù)量、T22果汁含量、T23可溶性固形物含量由9級減為5級。對于性狀T12果實質(zhì)量、T13果實縱徑和T14果實橫徑，中國柑橘屬測試指南中分為了9級、3級、3級，筆者在本研究中針對柚類種質(zhì)資源的分布特點，單獨劃分了柚和葡萄柚的分級范圍，這3個性狀對柚劃分為9級、7級、7級，對葡萄柚均劃分為5級，此分級范圍更適用于中國柚類的DUS測試。

利用分布頻率計算的25個數(shù)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)H’在0.878～1.954之間變化（表7），均值為1.318，遺傳多樣性指數(shù)H’從高到低依次為：T24＞T12.1＞T18＞T14.1＞T3＞T13.1＞T8＞T7＞T4＞T14.2＞T21＞T12.2＞T17＞T9＞T5＞T13.2＞T20＞T2＞T23＞T15＞T22＞T11＞T10＞T19＞T6＞T1＞T25＞T16。T24果汁含酸量、T12.1果實質(zhì)量（僅適用于柚）、T18果實橫徑等性狀的多樣性指數(shù)相對較大，表明這些性狀的表現(xiàn)型較多且在不同等級中均勻分布。

2.4 柚類種質(zhì)資源數(shù)量性狀相關(guān)性分析

為了排除種間差異帶來的影響，除去葡萄柚品種資源單獨繪制104個柚品種資源在25個數(shù)量性狀之間的相關(guān)性熱圖（圖3）。多個性狀之間存在不同程度相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分布在-0.69～0.91之間，花、葉、果內(nèi)部間包含的性狀相關(guān)性高。5個花性狀間的相關(guān)系數(shù)絕對值在0.25～0.73之間，平均相關(guān)系數(shù)絕對值為0.46，T2花萼直徑與T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T6雄蕊數(shù)量存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（0.59、0.73、0.47）；T4花瓣寬度與T3花瓣長度、T6雄蕊數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（0.66、0.50），與T5花瓣指數(shù)呈極顯著負相關(guān)（-0.48）。5個葉性狀間的相關(guān)系數(shù)絕對值在0.03～0.82之間，平均0.33，T10葉柄長度與T11翼葉寬度呈極顯著正相關(guān)（0.82）；T7葉片長度與T8葉片寬度、T9葉形指數(shù)和T10葉柄長度呈極顯著正相關(guān)（0.47、0.44、0.31）；T8葉片寬度與T9葉形指數(shù)呈極顯著負相關(guān)（-0.58）。14個果實性狀間的相關(guān)系數(shù)絕對值在0.00～0.91之間，平均0.22，T14果實橫徑與T12果實質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)最大，為0.91，呈極顯著正相關(guān)；T22果汁含量與T25可食率呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.76）；T13果實縱徑與T14果實橫徑、T15果形指數(shù)和T18果皮厚度呈極顯著正相關(guān)（0.60、0.55、0.47）。另外，T18果皮厚度還與T22果汁含量、T25可食率呈極顯著負相關(guān)（-0.69、-0.67），表明果皮越厚，果汁含量和可食率越低。不同類型的性狀也存在著一定的相關(guān)性，比如T2花萼直徑、T3花瓣長度、T4花瓣寬度與T9葉形指數(shù)呈極顯著負相關(guān)（-0.43、-0.43、-0.30）、與T8葉片寬度呈極顯著正相關(guān)（0.47、0.45、0.35）；T12果實質(zhì)量、T13果實縱徑、T14果實橫徑與T2花萼直徑、T3花瓣長度、T4花瓣寬度、T6雄蕊數(shù)量、T8葉片寬度也均呈極顯著正相關(guān)。

2.5 數(shù)量性狀主成分分析

利用SPSS將25個數(shù)量性狀進行主成分分析，以特征值大于等于1為標準，共提取出6個主成分（表8），累積貢獻率達72.76%，表明這25個數(shù)量性狀的遺傳信息可由這6個主成分代表。第一個主成分特征值為7.57，貢獻率為30.27%，包含著最多的信息，主要由果實橫徑、果實質(zhì)量、果實縱徑、花瓣寬度、花萼直徑、花瓣長度、中心柱大小、雄蕊數(shù)量、汁胞長度、葉片寬度和種子數(shù)量這11個性狀決定；第二個主成分特征值為2.99，貢獻率為11.98%，包含可食率、果汁含量和果皮厚度3個性狀，主要是與果實的食用性相關(guān)的性狀；第三個主成分的特征值為2.60，貢獻率為10.40%，包含葉柄長度、翼葉寬度、葉片長度和春梢節(jié)間長度4個性狀，主要與葉片大小和春梢節(jié)間長度相關(guān)；第四個主成分的特征值為2.00，貢獻率為7.98%，包含囊瓣數(shù)量、花柱痕直徑、果形指數(shù)和花瓣指數(shù)4個性狀，為果心以及長寬比相關(guān)性狀；第五個主成分的特征值為1.61，貢獻率為6.45%，包含葉形指數(shù)1個性狀；第六個主成分的特征值為1.42，貢獻率為5.67%，包含可溶性固形物含量和果汁含酸量2個性狀，為果實品質(zhì)相關(guān)性狀。

3 討 論

變異系數(shù)是衡量數(shù)據(jù)離散程度的重要指標，不僅能夠評估單一數(shù)據(jù)集內(nèi)的變異性，還能夠跨數(shù)據(jù)集進行變異程度的比較。在本研究中，25個數(shù)量性狀中果實質(zhì)量和果汁含酸量在品種內(nèi)的穩(wěn)定性較好，其變異系數(shù)分別為8.88%和15.71%，同時在品種間表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性，變異系數(shù)分別為39.75%和54.82%，說明這兩個性狀在描述和區(qū)分品種時具有較高的實用價值和應用潛力。種子數(shù)量和翼葉寬度的品種間變異系數(shù)分別達62.90%和43.33%，盡管這兩個性狀在品種間存在較大的遺傳變異，但兩者的品種內(nèi)變異系數(shù)也較大，分別為26.96%和23.01%，反映這兩個性狀在品種內(nèi)的穩(wěn)定性較差，因此在對種子數(shù)量和翼葉寬度進行測試時，需要考慮環(huán)境條件等因素以確保測試結(jié)果的準確性和可靠性。

DUS測試數(shù)量性狀的合理分級是特異性判定的重要環(huán)節(jié)，也是制定、修訂測試指南最重要和最關(guān)鍵的部分[13]。為方便測試數(shù)據(jù)信息化處理，以及消除同一品種在不同年度、不同測試地點間同一性狀表達數(shù)據(jù)不同造成的差異，在DUS測試中需要將性狀表達狀態(tài)實際測量值轉(zhuǎn)化為以數(shù)字表示的分級代碼。數(shù)量性狀分級過少，每一級可能導致性狀表達狀態(tài)有差異的兩個品種代碼相同，增加錯誤概率；分級過多，不僅無法排除品種內(nèi)差異、校正測量誤差，還可能錯將兩個相似品種判定為有差異，導致誤判[14]。數(shù)量性狀的分級有極差法、概率分級法、中值平均標準差法以及最小顯著差法等多種。極差法又稱等距法，此方法簡單直觀，在向日葵[15]、毛花獼猴桃[16]等數(shù)量性狀的分級中得以應用；概率分級法依據(jù)數(shù)據(jù)的分布規(guī)律進行分級，適用于正態(tài)分布的性狀，該方法在棗[17]、草莓[18]、大花惠蘭[19]、杜仲[20]等數(shù)量性狀的分級中均有應用，能較準確地反映性狀的變異范圍和分布狀態(tài)，但通常只能將數(shù)量性狀分為3級或5級[21]，并且對于數(shù)據(jù)分布比較集中的性狀會存在分級區(qū)間過小的情況，使之不滿足UPOV對數(shù)量性狀的基本要求（分級級差不得小于2倍LSD0.05）；褚云霞等[22]和紀軍建等[13]利用中值平均標準差法進行數(shù)量性狀分級，此法操作簡便，但若數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，僅依靠平均值和標準差進行分級可能會導致分級不夠精細或不夠準確；最小顯著差法適用于符合正態(tài)分布的性狀，能夠檢測出較小的差異，即使在性狀數(shù)據(jù)相近時也能區(qū)分出顯著性差異，同時靈活性強，可將性狀分為3～9級不等，目前已經(jīng)廣泛應用于多種植物的數(shù)量性狀分級[23-25]。不同的分級方法有各自的適用范圍和局限性，分級方法的選擇需考慮測試目標、性狀的分布特征以及測試指南的要求。筆者在本研究中根據(jù)柚類種質(zhì)的調(diào)查數(shù)據(jù)，將25個數(shù)量性狀進行正態(tài)性檢驗，對符合正態(tài)分布的性狀采用最小顯著差法，對不符合正態(tài)分布的性狀選用極差法，同時結(jié)合田間表現(xiàn)情況及未來育種發(fā)展的可能性，對25個數(shù)量性狀的分級進行調(diào)整，最終各性狀的分級區(qū)間均符合大于等于2倍LSD0.05的基本要求。由于數(shù)量性狀的表達易受到栽培環(huán)境和氣候條件的影響，本研究中的分級標準以重慶地區(qū)柚類的生長情況為基礎，具體分級范圍可能不完全適用于其他生態(tài)區(qū)域。確定的25個數(shù)量性狀表達狀態(tài)劃分可作為參考，在測試過程中研究者需根據(jù)標準品種的表達狀態(tài)并結(jié)合田間情況做出相應的調(diào)整，確保能夠準確地評估和比較不同區(qū)域內(nèi)品種的性狀差異。

由于數(shù)量性狀的表達易受到栽培環(huán)境和氣候條件的影響，同一品種在不同年度或區(qū)域間的表現(xiàn)可能會有所變化[26]。因此即便UPOV發(fā)布了相應的測試指南，也需要針對各國家和地區(qū)的具體條件進行調(diào)整，以確保分級標準的實用性[27]。UPOV作為國際指南，對數(shù)量性狀的分級大多采用最大尺度（1～9級尺度），各成員國可結(jié)合本國的具體情況對其進行修改。筆者在本研究中針對柚類種質(zhì)資源，對中國柑橘屬測試指南中的數(shù)量性狀重新進行劃分，與中國柑橘屬測試指南相比：花萼直徑、果形指數(shù)、汁胞長度由3級增為5級，花瓣長度、花瓣寬度、葉片長度、葉片寬度、果皮厚度由9級減為7級，花瓣指數(shù)、葉形指數(shù)、中心柱大小、囊瓣數(shù)量、果汁含量、可溶性固形物含量由9級減為5級。與UPOV發(fā)布的柚類測試指南（TG/204/1）相比：花瓣長度、花瓣寬度、葉片長度、葉片寬度、果皮厚度由9級減為了7級；花萼直徑、花瓣指數(shù)、果形指數(shù)、中心柱大小、囊瓣數(shù)量、汁胞長度、果汁含量、可溶性固形物含量、種子數(shù)量（自然授粉）由9級減為了5級；葉柄長度、翼葉寬度、花柱痕直徑由9級減為了3級。而對于果實質(zhì)量、果實縱徑和果實橫徑，筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)這3個性狀在柚類材料的頻率分布圖中呈明顯的雙峰型分布，且這種分布情況是由柚和葡萄柚的種間差異造成的。中國柑橘屬測試指南和UPOV柚類測試指南（TG/204/1）均沒有在這3個性狀上對兩者進行區(qū)分，筆者在本研究中通過對兩年的測量數(shù)據(jù)分級發(fā)現(xiàn)，若兩個種一起分級會導致分級區(qū)間范圍過大，可能會使兩個有差異的品種代碼相同，增加測試的錯誤概率，不利于兩種類型品種的區(qū)分[14]。玉米測試中存在著類似的情況，自交系玉米在植株高度、穗位高度和果穗長度等性狀上會明顯低于雜交種玉米，對此玉米DUS測試指南（GB/T 19557.24—2018）在這些性狀上進行劃分，對不同類型品種分別制定了分級標準和標準品種。同樣棉花DUS測試指南（NY/T 2238—2012）也采用了相同的方法，在6個數(shù)量性狀上對陸地棉和海島棉兩個種分類分級。柚與葡萄柚雖同為柚類，在較多性狀上有著相似之處，使得兩者可同用一本測試指南進行測試，但在體型的大小上卻存在較大的區(qū)別。因此筆者在本研究中參照玉米DUS測試指南的處理方法，分別在果實質(zhì)量、果實縱徑和果實橫徑3個性狀上制定了柚和葡萄柚的分級標準。該分級范圍更適用于中國柚類的區(qū)分和鑒別，增強了對柚類品種鑒定的準確性，為柚類DUS測試的準確性和科學性提供理論基礎和參考。

柑橘屬含有寬皮柑橘、甜橙、檸檬、柚等幾十個種，這些種親緣關(guān)系較近，但在形態(tài)上卻差異巨大。目前中國柑橘屬的DUS測試僅有《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 柑橘》（NY/T 2435—2013）一個測試指南可依，采用同一個指南作為測試標準可能會對性狀表達狀態(tài)的判斷產(chǎn)生偏差。例如柑橘屬指南中“果實：果臍”、“果實：乳突”在柚類中就鮮有表達。國際植物新品種保護聯(lián)盟（UPOV）已將柑橘屬分為了寬皮柑橘、橙、檸檬和來檬、柚和葡萄柚等不同組，每組都有其特定的測試指南，可以更精確地反映不同品種間的差異。因此，為更好地開展柚類品種測試工作，服務廣大育種者和生產(chǎn)者，使中國柚類品種的DUS測試工作有其特有的標準可依，確保植物品種DUS測試數(shù)據(jù)的準確性和權(quán)威性，應當結(jié)合國際測試指南，有針對性地制定適合中國柚類品種鑒定及保護的DUS測試指南，從而更精準地為柚類品種DUS測試服務。

4 結(jié) 論

依據(jù)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 柑橘》對25個數(shù)量性狀數(shù)據(jù)進行了分級研究，確定了各數(shù)量性狀的分級范圍，對柚類DUS測試數(shù)量性狀描述分級具有較好的指導作用，并可對下一步修訂柑橘屬DUS測試指南提供參考。

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基金項目：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種資源保護項目：申請保護品種DUS測試及已知品種庫維護（h20230603）

作者簡介：陳璞，女，在讀碩士研究生，研究方向為種業(yè)。E-mail：402103519@qq.com

*通信作者Author for correspondence. E-mail：dengchaowin@sina.com；E-mail：huard_001@163.com